一種川貝母開(kāi)放式組織培養(yǎng)用抑菌劑及其使用方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了川貝母開(kāi)放式組織培養(yǎng)用抑菌劑及其使用方法，該抑菌劑包括抑菌劑I和抑菌劑II，具有廣譜性殺菌能力且能保護(hù)植物正常生長(zhǎng)，使川貝母種苗的規(guī)?；a(chǎn)成為了可能；利用上述抑菌劑進(jìn)行川貝母開(kāi)放式組織培養(yǎng)的方法規(guī)避了在傳統(tǒng)接種操作中因人為失誤和環(huán)境而造成的污染問(wèn)題，大大降低了污染率，使川貝母的培養(yǎng)成功率達(dá)到93％，并且組培成本節(jié)省60％左右，成本得到大大降低。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種川貝母開(kāi)放式組織培養(yǎng)用抑菌劑及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種川貝母開(kāi)放式組織培養(yǎng)用抑菌劑及利用該抑菌劑進(jìn)行開(kāi)放式組織培養(yǎng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]川貝母為百合科，主要分布于我國(guó)青藏高原東南緣、四川西部、云南迪慶州、麗江地區(qū)、甘肅隴南地區(qū)、西藏東北部及南部和青海局部。川貝母是治療外感風(fēng)熱咳嗽、肺虛久咳、痰少咽燥等癥的良藥；四川是川貝母的地道產(chǎn)區(qū)，優(yōu)質(zhì)川貝母主要分布在甘孜藏族自治州和阿壩藏族自治州，海拔3500-4500m高山高原地帶，該區(qū)氣候寒冷，以藏族等少數(shù)民族為主。
[0003]目前，川貝母商品主要來(lái)源于野生資源，由于其療效卓著，藥用需求量大，野生資源日漸枯竭，價(jià)格逐年上升；但是，人工栽培川貝母周期較長(zhǎng)，技術(shù)難度大，尚未進(jìn)入商品生產(chǎn)階段，其中困難之一就是規(guī)?；嘤N苗難度較大。在高原進(jìn)行種子直播，當(dāng)年出苗率低、秋季保存率更低，不到20%。因此，如何規(guī)模化提供川貝母商品生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)種苗已成為制約川貝母產(chǎn)業(yè)發(fā)展的首要瓶頸。
[0004]現(xiàn)有關(guān)川貝母的發(fā)明專(zhuān)利(申請(qǐng))主要包括:川貝母種子的處理方法、以川貝母植株葉為外植體的鱗莖快速增殖方法、川貝母的種植方法、川貝母高原保護(hù)地育苗方法和川貝母的育秧盤(pán)或育秧袋式 有性繁殖栽培方法等，以上技術(shù)方法分別涉及到川貝母的栽培與繁育的方法，從繁殖方式、種子處理、育苗選地、育苗環(huán)境調(diào)控、育苗方式上等多方面進(jìn)行了研究與改進(jìn)，在一定程度上提升了川貝母的生產(chǎn)水平，但是從川貝母的生產(chǎn)實(shí)踐及目前的市場(chǎng)需求量上來(lái)考慮，就現(xiàn)有的技術(shù)還未達(dá)到理想效果；在生物技術(shù)突飛猛進(jìn)發(fā)展的今天，在植物培育領(lǐng)域，植物組織培養(yǎng)技術(shù)已成為主要的技術(shù)方法，有資料也表明植物組織培養(yǎng)技術(shù)也已成功運(yùn)用在川貝母的種苗培育中，給規(guī)?；嘤ㄘ惙N苗提供了可行性。
[0005]植物組織培養(yǎng)始于20世紀(jì)初，是以德國(guó)植物學(xué)家G.Haberlandt的植物細(xì)胞具有全能性的理論發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。作為一種十分有效的植物快繁方式，植物組織培養(yǎng)具有普通繁殖方法無(wú)法比擬的技術(shù)和產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)，在當(dāng)前倡導(dǎo)高效現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)發(fā)展模式的形勢(shì)下，通過(guò)植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)高質(zhì)量的種苗具有十分廣闊的市場(chǎng)前景；但一直以來(lái)，植物組培產(chǎn)業(yè)流傳著一句話就是:組培組培越組越賠，這其中的原因除了發(fā)展思路和經(jīng)營(yíng)不善之外，還有一個(gè)重要原因就是組培成本太高，無(wú)法滿足市場(chǎng)對(duì)高質(zhì)量組培苗低價(jià)位成本的需求。因此，如何降低組培成本是決定組培效益的關(guān)鍵所在，也是組培技術(shù)得以健康發(fā)展的首要條件。
[0006]植物開(kāi)放式組織培養(yǎng)，簡(jiǎn)稱(chēng)開(kāi)放組培，是在抗菌劑的作用下，使植物組織培養(yǎng)脫離嚴(yán)格無(wú)菌的操作環(huán)境，不需高壓滅菌和超凈工作臺(tái)，在自然、開(kāi)放的有菌環(huán)境中進(jìn)行植物的組織培養(yǎng)，從根本上簡(jiǎn)化組培環(huán)節(jié)，降低組培成本；
[0007]傳統(tǒng)組培過(guò)程中的污染，主要表現(xiàn)為培養(yǎng)基的污染。因此，只要將培養(yǎng)基改造成既可保證植物組織正常生長(zhǎng)，又具有抗菌、殺菌功能的培養(yǎng)基，細(xì)菌和真菌等菌類(lèi)一旦失去滋生場(chǎng)所，進(jìn)行開(kāi)放式組織培養(yǎng)是完全可能的，而改造培養(yǎng)基的關(guān)鍵是要找到一種或幾種能夠添加到培養(yǎng)基的廣譜性抗菌劑，廣譜抗菌劑的篩選一直是困擾植物組培專(zhuān)家的難題，常用抗生素、抗菌素、防腐劑在植物組培污染的防治方面有一定的作用，但是針對(duì)不同的植物品種要想找到一種合適的處理組合是比較困難的，往往是當(dāng)培養(yǎng)基抗菌，而植物組織的生長(zhǎng)卻受到抑制；植物組織能正常生長(zhǎng)，卻無(wú)法獲得滿意的抗菌效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明針對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中川貝母組織培養(yǎng)的高成本和低成活率的上述不足，提供了一種川貝母開(kāi)放式組織培養(yǎng)用抑菌劑，該抑菌劑具有廣譜性殺菌能力且能保護(hù)植物正常生長(zhǎng)，使川貝母種苗的規(guī)?；a(chǎn)成為了可能。
[0009]本發(fā)明的另一目的是利用上述抑菌劑進(jìn)行川貝母開(kāi)放式組織培養(yǎng)的方法，該方法大大提高了川貝母種苗成活率，降低成本。
[0010]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0011]提供一種川貝母開(kāi)放式組織培養(yǎng)用抑菌劑，包括抑菌劑I和抑菌劑II;
[0012]所述抑菌劑I由下述重量份的組分組成:絲瓜水50-70份、金銀花提取液10-15份、艾葉提取液10-20份、黃柏提取液10-15份、花椒提取液5-15份、紫草提取液10_15份、黃連提取液5-10份、蒲公英提取液10-15份、茵陳提取液10-15份、大青葉提取液10-15份、阿莫西林舒巴坦100-200份、PVP70-200份、二氧化氯0.7-7份以及維生素C35-50份；
[0013]所述抑菌劑II由下述重量份的組分組成:絲瓜水50-70份、金銀花提取液10-15份、艾葉提取液10-20份、黃柏提取液10-15份、花椒提取液5-15份、紫草提取液10_15份、黃連提取液5-10份、蒲公英提取液10-15份、茵陳提取液10-15份、大青葉提取液10-15份、阿莫西林舒巴坦150-300 份、PVP-1150-500份以及二氧化氯7_70份。
[0014]優(yōu)選地，所述抑菌劑I由下述重量份的組分組成:絲瓜水60份、金銀花提取液13份、艾葉提取液15份、黃柏提取液12份、花椒提取液10份、紫草提取液12份、黃連提取液8份、蒲公英提取液13份、茵陳提取液13份、大青葉提取液12份、阿莫西林舒巴坦130份、PVP150份、二氧化氯4份以及維生素C40份；
[0015]所述抑菌劑II由下述重量份的組分組成:絲瓜水60份、金銀花提取液13份、艾葉提取液15份、黃柏提取液12份、花椒提取液10份、紫草提取液12份、黃連提取液8份、蒲公英提取液13份、茵陳提取液13份、大青葉提取液12份、阿莫西林舒巴坦200份、PVP-1210份以及二氧化氯20份。
[0016]其中，所述金銀花提取液、艾葉提取液、紫草提取液、蒲公英提取液、茵陳提取液和大青葉提取液由下述方法制備:分別取金銀花、艾葉、紫草、蒲公英、茵陳和大青葉，放入純水中在100°C下煮3-4次，每次煮到液體濃縮至1/4為止，過(guò)濾，取濾液，分別裝入容器中備用；其中，每次的加水量為上次熬煮后液量的4-5倍；
[0017]所述絲瓜水、黃柏提取液、花椒提取液、黃連提取液由下述方法制備:取絲瓜、黃柏、花椒、黃連放入干燥箱中在160°C下烘烤至顏色變?yōu)樯詈稚?，取出，各自研磨成粉；再將粉末置于體積分?jǐn)?shù)為60 %的乙醇溶液中浸泡10-20天，過(guò)濾，取濾液，分別裝入容器中備用。
[0018]利用上述抑菌劑進(jìn)行開(kāi)放式組織培養(yǎng)川貝母的方法，包括以下步驟:[0019]I)外植體消毒滅菌:選取川貝母的鱗莖、種子或葉片作為外植體，將外植體用水沖洗20分鐘，放入體積分?jǐn)?shù)為20%的抑菌劑II中浸泡10-15min，再用無(wú)菌水沖洗2_3次，濾干水分，用經(jīng)抑菌劑II浸泡過(guò)的解剖刀對(duì)表面滅菌后的外植體進(jìn)行切割，待接種；
[0020]2)接種操作:接種室內(nèi)用臭氧發(fā)生機(jī)或紫外線進(jìn)行空氣滅菌，接種的器具用體積比75%的酒精消毒后，浸泡于體積分?jǐn)?shù)為50-80%的抑菌劑II中滅菌l_2h ；
[0021]3)組織培養(yǎng):將步驟I)制得的外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20-30天后，轉(zhuǎn)接到增殖繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；經(jīng)過(guò)增殖繼代培養(yǎng)后，再將其轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；
[0022]其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:鹿糖30g -L-1+ 瓊脂 4g -r'+MS+e-BAl.0-2.0mg -L^+NAA
0.5-1.0mg.L i+GA0.5-1.5mg ^L1+ 抑菌劑 I15_25ml.L 1 ；
[0023]所述增殖繼代培養(yǎng)基為:鹿糖30g -L-1+ 瓊脂 4g -r'+MS+e-BAl.5-2.0mg -L^+NAAO? 5mg.L-1+ 抑菌劑 I10-15ml.L-1 ；
[0024]所述生根培養(yǎng)基為:鹿糖30g.L—1+ 瓊脂 4g.r1+l/2MS+NAA0.5-1.0mg.L—1+ 抑菌劑 I10-15ml.L-1 ；
[0025]4)移栽:將進(jìn)行生根培養(yǎng)后的川貝母組培苗進(jìn)行煉苗后移栽。
[0026]步驟2)中，所述抑菌劑11的體積分?jǐn)?shù)為60 %。
[0027]其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:鹿糖30g.L—1+ 瓊脂 4g -r'+MS+e-BAl.0mg -L^+NAA0.5mg.L-1+GAl.5mg.L-1+ 抑菌劑 115ml.L-1 ；
[0028]所述增殖繼代培養(yǎng)基為:鹿糖30g.L—1+瓊脂4g -^+18+6^2.0mg -L^+NAA0.5mg?卩1+抑菌劑1lOml.L-1 ；
[0029]所述生根培養(yǎng)基為:鹿糖30g.L-1+瓊脂4g.r1+l/2MS+NAA0.8mg.L-1+抑菌劑113ml -L10
[0030]綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0031]1)本發(fā)明的抑菌劑是采用特定濃度的具有殺菌、抗菌性的天然植物配制而成，具有廣譜性殺菌能力且能較好保護(hù)植物正常生長(zhǎng)，并且在該抑菌劑的作用下，可以使植物組織培養(yǎng)脫離嚴(yán)格無(wú)菌的操作環(huán)境，不需高壓滅菌和超凈工作臺(tái)，在自然、開(kāi)放的有菌環(huán)境中進(jìn)行植物的組織培養(yǎng)，從根本上簡(jiǎn)化組培環(huán)節(jié)，降低成本。
[0032]2)本發(fā)明利用抑菌劑進(jìn)行開(kāi)放式組織培養(yǎng)的方法解決了川貝母只能通過(guò)各種嚴(yán)格滅菌步驟才能完成的傳統(tǒng)組織培養(yǎng)的問(wèn)題，且規(guī)避了在傳統(tǒng)接種操作中因人為失誤和環(huán)境而造成的污染問(wèn)題，大大降低了污染率，使川貝母的培養(yǎng)成功率達(dá)到93%，材料的分化也未受到任何影響；由于不需高壓滅菌，培養(yǎng)基中的激素和營(yíng)養(yǎng)元素?fù)p失較少，再加上培養(yǎng)容器透光性能較好，組培苗生長(zhǎng)健壯，分化率得到提高。
[0033]3)本發(fā)明使用抑菌劑進(jìn)行川貝母的開(kāi)放式組織培養(yǎng)方法，組培成本節(jié)省60%左右，且由于抑菌劑的中藥材料資源豐富，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，使川貝母種苗較低成本地規(guī)模化生產(chǎn)成為了可能。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述，但它們不是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步限制。
[0035]在開(kāi)放式組培中，抑菌液的配制是制約成敗的關(guān)鍵，一是因?yàn)檫€沒(méi)有一種抗生素對(duì)所有的細(xì)菌都有效并且藥效期短；二是有些抗菌素、防腐劑在有效濃度下，其殺菌、抗菌離子對(duì)植物組織直接產(chǎn)生傷害，有些則產(chǎn)生鹽害；針對(duì)抗菌藥劑篩選中的問(wèn)題，只有選擇與植物組織親和、友好、藥效期長(zhǎng)(至少一個(gè)生長(zhǎng)周期)、不產(chǎn)生鹽害并具有殺菌、抗菌活性的物質(zhì)才是可用有效的。為此，本發(fā)明針對(duì)川貝母的生長(zhǎng)，特意利用具有殺菌、抗菌性的天然植物進(jìn)行配制實(shí)驗(yàn)，并成功研制出了具有廣譜性殺菌能力且能較好保護(hù)植物材料正常生長(zhǎng)的抑菌劑成功解決了以上問(wèn)題，并對(duì)其有效濃度和使用方法作了大量探索性試驗(yàn)。
[0036]抑菌劑的配制按照廣普抗菌和對(duì)植物活體材料傷害程度最低的原則進(jìn)行調(diào)配，既在使培養(yǎng)川貝母的環(huán)境不受雜菌污染侵害的同時(shí)，也使所接種的外植體不受到藥害，影響到分化生長(zhǎng)；此抑菌劑適用于川貝母鱗莖、葉片及種子的無(wú)菌播種。
[0037]實(shí)施例1
[0038]抑菌劑的配制:
[0039]抑菌劑I的組成成分及含量為:總體積為1000ml的抑菌劑I中含有:絲瓜水50mg、金銀花提取液10mg、艾葉提取液10mg、黃柏提取液10mg、花椒提取液15mg、紫草提取液15mg、黃連提取液10mg、蒲公英提取液10mg、茵陳提取液15mg、大青葉提取液15mg、阿莫西林舒巴坦100mg、PVP(聚乙烯吡咯燒酮)70mg、二氧化氯0.7mg以及維生素C35mg ；
[0040]抑菌劑II的組成成分及含量為:總體積為1000ml的抑菌劑II中含有:絲瓜水50mg、金銀花提取液10mg、艾葉提取液10mg、黃柏提取液15mg、花椒提取液15mg、紫草提取液10mg、黃連提取液5mg、蒲公英提取液10mg、茵陳提取液15mg、大青葉提取液15mg、阿莫西林舒巴坦150mg、PVP-1 (聚維酮碘制劑)500mg以及二氧化氯70mg。
[0041]按照上述抑菌劑I和抑菌劑II的配方成分，稱(chēng)取相應(yīng)量，分別倒入純凈水中，在常溫下進(jìn)行攪拌溶解；抑菌劑I在定容后將其PH調(diào)整到5.8-6之間；抑菌劑I和抑菌劑II配制好后，放入4°C低溫中保存待用。
[0042]其中，金銀花提取液、艾葉提取液、紫草提取液、蒲公英提取液、茵陳提取液和大青葉提取液由下述方法制備:分別取金銀花、艾葉、紫草、蒲公英、茵陳和大青葉，各自放入純水中反復(fù)熬煮3次，每次加入的純水量按前一次熬煮后溶液的量的4倍進(jìn)行摻兌；其中，熬煮溫度為100°C，每次熬到液體濃縮到1/4即可，再經(jīng)壓力過(guò)濾，取濾液，分別裝入容器中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0043]絲瓜水、黃柏提取液、花椒提取液、黃連提取液由下述方法制備:取絲瓜、黃柏、花椒、黃連放入干燥箱中在160°C下進(jìn)行烘烤，等材料顏色接近于深褐色時(shí)取出，并分別研磨成粉末狀；將磨好的粉末浸入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液中，攪拌，浸泡10天后，經(jīng)壓力過(guò)濾，取濾液，分別裝入容器中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0044]利用上述抑菌劑I和抑菌劑II進(jìn)行川貝母的開(kāi)放式組織培養(yǎng):
[0045](I)外植體消毒滅菌:選取川貝母的鱗莖、種子或葉片作為外植體，將外植體用水沖洗20分鐘，放入體積分?jǐn)?shù)為20%的抑菌劑II中浸泡lOmin，再用無(wú)菌水沖洗2次，濾干水分，用經(jīng)抑菌劑II浸泡過(guò)的解剖刀對(duì)表面滅菌后的外植體進(jìn)行切割，待接種；
[0046](2)培養(yǎng)基制作:根據(jù)MS基本培養(yǎng)基成分及用量稱(chēng)取藥品，使其充分溶解，并按相應(yīng)濃度分別依次取用；先量取大量元素母液，再依次加入微量元素母液、鐵鹽母液及有機(jī)成分。然后分別按誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖繼代培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基來(lái)加入激素及抑菌劑I，其分別添加為:[0047]誘導(dǎo)培養(yǎng)基:
[0048]鹿糖30g.L1+ 瓊脂 4g.L 1+MS+6-BA2.0mg.L ^NAAl.0mg.L ^GAl.5mg.L k 抑菌劑 125ml.L-1 ；
[0049]增殖繼代培養(yǎng)基為:蔗糖30g I1+ 瓊脂 4g ?L-'+ΜΞ+Θ-ΒΑΙ.5mg ?L^+NAA0.5mg ?L-1+抑菌劑115ml.L-1 ；
[0050]生根培養(yǎng)基為:蔗糖30g.L-1+ 瓊脂 4g.r1+l/2MS+NAA0.5mg.L-1+ 抑菌劑IlOml.L 1 ；
[0051]溶化瓊脂:稱(chēng)取瓊脂和蔗糖，用蒸餾水加熱燒開(kāi)熔化瓊脂，待瓊脂完全熔化后，把蔗糖及調(diào)配好的激素和抑菌劑加入，用PH試紙測(cè)pH值，并用0.lmol/L的氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH至5.8,最后加水定容至所需體積。
[0052]分裝:將配好的培養(yǎng)基分裝于培養(yǎng)瓶中，然后用封口膜或瓶蓋封口，待用。
[0053](3)接種操作:接種室內(nèi)用臭氧發(fā)生機(jī)進(jìn)行空氣滅菌，接種的器具如剪子、鑷子、刀片和接種盤(pán)等用體積比75%的酒精消毒后，浸泡于體積分?jǐn)?shù)為50%的抑菌劑II中滅菌Ih ；
[0054](4)組織培養(yǎng):在接種臺(tái)上將滅菌后的外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20天后，材料開(kāi)始分化增殖，再轉(zhuǎn)接到增殖繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；經(jīng)過(guò)增殖繼代培養(yǎng)后，再將其轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；
[0055](5)移栽:將進(jìn)行生根培養(yǎng)后的川貝母組培苗進(jìn)行煉苗后移栽。
[0056]實(shí)施例2
[0057]抑菌劑的配制:
[0058]抑菌劑I的組成成分及含量為:總體積為1000ml的抑菌劑I中含有:絲瓜水60mg、金銀花提取液13mg、艾葉提取液15mg、黃柏提取液12mg、花椒提取液10mg、紫草提取液12mg、黃連提取液8mg、蒲公英提取液13mg、茵陳提取液13mg、大青葉提取液12mg、阿莫西林舒巴坦130mg、PVP (聚乙烯吡咯燒酮)150mg、二氧化氯4mg以及維生素C40mg ；
[0059]抑菌劑II的組成成分及含量為:總體積為1000ml的抑菌劑II中含有:絲瓜水60mg、金銀花提取液13mg、艾葉提取液15mg、黃柏提取液12mg、花椒提取液10mg、紫草提取液12mg、黃連提取液8mg、蒲公英提取液13mg、茵陳提取液13mg、大青葉提取液12mg、阿莫西林舒巴坦200mg、PVP-1 (聚維酮碘制劑)210mg以及二氧化氯20mg。
[0060]按照上述抑菌劑I和抑菌劑II的配方成分，稱(chēng)取相應(yīng)量，分別倒入純凈水中，在常溫下進(jìn)行攪拌溶解；抑菌劑I在定容后將其PH調(diào)整到5.8-6之間；抑菌劑I和抑菌劑II配制好后，放入4°C低溫中保存待用。
[0061]其中，金銀花提取液、艾葉提取液、紫草提取液、蒲公英提取液、茵陳提取液和大青葉提取液由下述方法制備:分別取金銀花、艾葉、紫草、蒲公英、茵陳和大青葉，各自放入純水中反復(fù)熬煮4次，每次加入的純水量按前一次熬煮后溶液量的5倍進(jìn)行摻兌；其中，熬煮溫度為100°C，每次熬到液體濃縮到1/4即可，再經(jīng)壓力過(guò)濾，取濾液，分別裝入容器中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0062]絲瓜水、黃柏提取液、花椒提取液、黃連提取液由下述方法制備:取絲瓜、黃柏、花椒、黃連放入干燥箱中在160°C下進(jìn)行烘烤，等材料顏色接近于深褐色時(shí)取出，并分別研磨成粉末狀；將磨好的粉末浸入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液中，攪拌，浸泡20天后，經(jīng)壓力過(guò)濾，取濾液，分別裝入容器中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0063]利用上述抑菌劑I和抑菌劑II進(jìn)行川貝母的開(kāi)放式組織培養(yǎng):
[0064](I)外植體消毒滅菌:選取川貝母的鱗莖、種子或葉片作為外植體，將外植體用水沖洗20分鐘，放入體積分?jǐn)?shù)為20%的抑菌劑II中浸泡15min，再用無(wú)菌水沖洗3次，濾干水分，用經(jīng)抑菌劑II浸泡過(guò)的解剖刀對(duì)表面滅菌后的外植體進(jìn)行切割，待接種；
[0065](2)培養(yǎng)基制作:根據(jù)MS基本培養(yǎng)基成分及用量稱(chēng)取藥品，使其充分溶解，并按相應(yīng)濃度分別依次取用；先量取大量元素母液，再依次加入微量元素母液、鐵鹽母液及有機(jī)成分。然后分別按誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖繼代培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基來(lái)加入激素及抑菌劑I，其分別添加為:
[0066]誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:鹿糖30g *L-1 瓊脂 4g *L-1+MS+e-BAl.0mg *L-1+NAA0.5mg *L-1+GAl.5mg.-1+抑菌劑 I15ml.-1 ；
[0067]增殖繼代培養(yǎng)基為:鹿糖30g·L-1+ 瓊脂 4g ?L+MS+6-BA2.0mg -L-1+NAA0.5mg·L-1+抑菌劑IlOml.-1 ；
[0068]生根培養(yǎng)基為:蔗糖30g.L-1+ 瓊脂 4g.L-1+l/2MS+NAA0.8mg.L-1+ 抑菌劑I13ml·L-1。
[0069]溶化瓊脂:稱(chēng)取瓊脂和蔗糖，用蒸餾水加熱燒開(kāi)熔化瓊脂，待瓊脂完全熔化后，把蔗糖及調(diào)配好的激素和抑菌劑加入，用PH試紙測(cè)pH值，并用0.lmol/L的氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH至5.8,最后加水定容至所需體積。
[0070]分裝:將配好的培養(yǎng)基分裝于培養(yǎng)瓶中，然后用封口膜或瓶蓋封口，待用。
[0071](3)接種操作:接種室內(nèi)用紫外線進(jìn)行空氣滅菌，接種的器具如剪子、鑷子、刀片和接種盤(pán)等用體積比75%的酒精消毒后，浸泡于體積分?jǐn)?shù)為60%的抑菌劑II中滅菌Ih ；
[0072](4)組織培養(yǎng):在接種臺(tái)上將滅菌后的外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30天后，材料開(kāi)始分化增殖，再轉(zhuǎn)接到增殖繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；經(jīng)過(guò)增殖繼代培養(yǎng)后，再將其轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；
[0073](5)移栽:將進(jìn)行生根培養(yǎng)后的川貝母組培苗進(jìn)行煉苗后移栽。
[0074]實(shí)施例3:
[0075]抑菌劑的配制:
[0076]抑菌劑I的組成成分及含量為:總體積為1000ml的抑菌劑I中含有:絲瓜水70mg、金銀花提取液15mg、艾葉提取液20mg、黃柏提取液15mg、花椒提取液5mg、紫草提取液10mg、黃連提取液5mg、蒲公英提取液15mg、茵陳提取液10mg、大青葉提取液12mg、阿莫西林舒巴坦200mg、PVP (聚乙烯吡咯燒酮)200mg、二氧化氯7mg以及維生素C50mg ；
[0077]抑菌劑II的組成成分及含量為:總體積為1000ml的抑菌劑II中含有:絲瓜水70mg、金銀花提取液15mg、艾葉提取液20mg、黃柏提取液10mg、花椒提取液5mg、紫草提取液15mg、黃連提取液10mg、蒲公英提取液15mg、茵陳提取液10mg、大青葉提取液10mg、阿莫西林舒巴坦300mg、PVP-1 (聚維酮碘制劑)150mg以及二氧化氯7mg。
[0078]按照上述抑菌劑I和抑菌劑II的配方成分，稱(chēng)取相應(yīng)量，分別倒入純凈水中，在常溫下進(jìn)行攪拌溶解；抑菌劑I在定容后將其PH調(diào)整到5.8-6之間；抑菌劑I和抑菌劑II配制好后，放入4°C低溫中保存待用。
[0079]其中，金銀花提取液、艾葉提取液、紫草提取液、蒲公英提取液、茵陳提取液和大青葉提取液由下述方法制備：分別取金銀花、艾葉、紫草、蒲公英、茵陳和大青葉，各自放入純 水中反復(fù)熬煮4次，每次加入的純水量按前一次熬煮后溶液量的5倍進(jìn)行摻兌；其中，熬煮 溫度為100C，每次熬到液體濃縮到1/4即可，再經(jīng)壓力過(guò)濾，取濾液，分別裝入容器中儲(chǔ)存 備用。
[0080]絲瓜水、黃柏提取液、花椒提取液、黃連提取液由下述方法制備：取絲瓜、黃柏、花 椒、黃連放入干燥箱中在160°C下進(jìn)行烘烤，等材料顏色接近于深褐色時(shí)取出，并分別研磨 成粉末狀；將磨好的粉末浸入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液中，攪拌，浸泡15天后，經(jīng)壓力過(guò) 濾，取濾液，分別裝入容器中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0081]利用上述抑菌劑I和抑菌劑II進(jìn)行川貝母的開(kāi)放式組織培養(yǎng)：
[0082](1)外植體消毒滅菌：選取川貝母的鱗莖、種子或葉片作為外植體，將外植體用水 沖洗20分鐘，放入體積分?jǐn)?shù)為20%的抑菌劑II中浸泡13min，再用無(wú)菌水沖洗3次，濾干 水分，用經(jīng)抑菌劑II浸泡過(guò)的解剖刀對(duì)表面滅菌后的外植體進(jìn)行切割，待接種；
[0083](2)培養(yǎng)基制作：根據(jù)MS基本培養(yǎng)基成分及用量稱(chēng)取藥品，使其充分溶解，并按相 應(yīng)濃度分別依次取用；先量取大量元素母液，再依次加入微量元素母液、鐵鹽母液及有機(jī)成 分。然后分別按誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖繼代培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基來(lái)加入激素及抑菌劑I，其分別 添加為：
[0084]誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：蔗糖30g *L_1+ 瓊脂 4g .L^+MS+e-BAl. 5mg ?L_1+NAA0. 8mg ?L_1+GA0. 5mg ? I^+抑菌劑 110ml ? I71 ；
[0085]增殖繼代培養(yǎng)基為：鹿糖30g 瓊脂 4g ?L_1+MS+6-BAl. 8mg ?L_1+NAA0. 5mg *1^+ 抑菌劑 112ml ? I71 ；
[0086]生根培養(yǎng)基為：蔗糖30g ? L_i+瓊脂4g ? r1+l/2MS+NAAl. Omg ? L^+抑菌劑 115ml ? L、
[0087]溶化瓊脂：稱(chēng)取瓊脂和蔗糖，用蒸餾水加熱燒開(kāi)熔化瓊脂，待瓊脂完全熔化后，把 蔗糖及調(diào)配好的激素和抑菌劑加入，用pH試紙測(cè)pH值，并用0. lmol/L的氫氧化鈉或鹽酸 調(diào)pH至5. 8,最后加水定容至所需體積。
[0088]分裝：將配好的培養(yǎng)基分裝于培養(yǎng)瓶中，然后用封口膜或瓶蓋封口，待用。
[0089](3)接種操作：接種室內(nèi)用臭氧發(fā)生機(jī)進(jìn)行空氣滅菌，接種的器具如剪子、鑷子、 刀片和接種盤(pán)等用體積比75%的酒精消毒后，浸泡于體積分?jǐn)?shù)為80%的抑菌劑II中滅菌 1. 5h ；
[0090](4)組織培養(yǎng)：在接種臺(tái)上將滅菌后的外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30天后， 材料開(kāi)始分化增殖，再轉(zhuǎn)接到增殖繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；經(jīng)過(guò)增殖繼代培養(yǎng)后，再將其轉(zhuǎn) 接到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；
[0091](5)移栽：將進(jìn)行生根培養(yǎng)后的川貝母組培苗進(jìn)行煉苗后移栽。
[0092]雖然結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行了詳細(xì)地描述，但并非是對(duì)本 專(zhuān)利保護(hù)范圍的限定。在權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍內(nèi)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員不經(jīng)創(chuàng)造性勞動(dòng) 即可做出的各種修改或調(diào)整仍受本專(zhuān)利的保護(hù)。
【權(quán)利要求】
1.一種川貝母開(kāi)放式組織培養(yǎng)用抑菌劑，其特征是：包括抑菌劑I和抑菌劑II ;所述抑菌劑I由下述重量份的組分組成：絲瓜水50-70份、金銀花提取液10-15份、艾葉提取液10-20份、黃柏提取液10-15份、花椒提取液5-15份、紫草提取液10-15份、黃連 提取液5-10份、蒲公英提取液，10-15份、茵陳提取液10-15份、大青葉提取液10-15份、阿 莫西林舒巴坦100-200份、PVP70-200份、二氧化氯0. 7-7份以及維生素C35-50份；所述抑菌劑II由下述重量份的組分組成：絲瓜水50-70份、金銀花提取液10-15份、艾 葉提取液10-20份、黃柏提取液10-15份、花椒提取液5-15份、紫草提取液10-15份、黃連 提取液5-10份、蒲公英提取液10-15份、茵陳提取液10-15份、大青葉提取液10-15份、阿 莫西林舒巴坦150-300份、PVP-1150-500份以及二氧化氯7_70份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑菌劑，其特征是：所述抑菌劑I由下述重量份的組分組成：絲瓜水60份、金銀花提取液13份、艾葉提取 液15份、黃柏提取液12份、花椒提取液10份、紫草提取液12份、黃連提取液8份、蒲公英 提取液13份、茵陳提取液13份、大青葉提取液12份、阿莫西林舒巴坦130份、PVP150份、 二氧化氯4份以及維生素C40份；所述抑菌劑II由下述重量份的組分組成：絲瓜水60份、金銀花提取液13份、艾葉提取 液15份、黃柏提取液12份、花椒提取液10份、紫草提取液12份、黃連提取液8份、蒲公英 提取液13份、茵陳提取液13份、大青葉提取液12份、阿莫西林舒巴坦200份、PVP-I210份 以及二氧化氯20份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抑菌劑的制備方法，其特征是：所述金銀花提取液、艾葉 提取液、紫草提取液、蒲公英提取液、茵陳提取液和大青葉提取液由下述方法制備：分別取金銀花、艾葉、紫草、蒲公英、茵陳和大青葉，放入純水中在100°c下煮3-4次，每 次煮到液體濃縮至1/4為止，過(guò)濾，取濾液，分別裝入容器中備用；其中，每次加水量為上次 濃縮后溶液量的4-5倍；所述絲瓜水、黃柏提取液、花椒提取液、黃連提取液由下述方法制備：取絲瓜、黃柏、花 椒、黃連放入干燥箱中在160°C下烘烤至顏色變?yōu)樯詈稚〕?，各自研磨成粉；再將粉?置于體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液中浸泡10-20天，過(guò)濾，取濾液，分別裝入容器中備用。
4.一種利用權(quán)利要求1或2所述的抑菌劑開(kāi)放式培養(yǎng)川貝母的方法，包括：1)外植體消毒滅菌：選取川貝母的鱗莖、種子或葉片作為外植體，將外植體用水沖洗 20分鐘，放入體積分?jǐn)?shù)為20%的抑菌劑II中浸泡10-15min，再用無(wú)菌水沖洗2_3次，濾干 水分，用經(jīng)抑菌劑II浸泡過(guò)的解剖刀對(duì)表面滅菌后的外植體進(jìn)行切割，待接種；2)接種操作：接種室內(nèi)用臭氧發(fā)生機(jī)或紫外線進(jìn)行空氣滅菌，接種的器具用體積比 75%的酒精消毒后，浸泡于體積分?jǐn)?shù)50-80%的抑菌劑II中滅菌l-2h ；3)組織培養(yǎng)：將步驟1)制得的外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20-30天后，轉(zhuǎn)接到 增殖繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；經(jīng)過(guò)增殖繼代培養(yǎng)后，再將其轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根 培養(yǎng)；其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：鹿糖30g 瓊脂4g ?r'+MS+e-BAl. 0-2. Omg -L^+NAAO. 5-1. Omg ? L i+GAO. 5-1. 5mg ? L :+ 抑菌劑 I15_25ml ? L 1 ;所述增殖繼代培養(yǎng)基為：鹿糖 30g 瓊脂 4g ?L_1+MS+6-BAl. 5-2. Omg ?L_1+NAA0. 5mg ? L-1+抑菌劑 I10-，15ml ? I71 ；所述生根培養(yǎng)基為:蔗糖30g.L-1+瓊脂4g.r1+l/2MS+NAA0.5-1.0mg.L-1+抑菌劑I10-15ml.L-1 ； 4)移栽:將進(jìn)行生根培養(yǎng)后的川貝母組培苗進(jìn)行煉苗后移栽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是:步驟2)中，所述抑菌劑II的體積分?jǐn)?shù)為60%。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是: 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:蔗糖 30g 七1+瓊脂 4g ?L-'+ΜΞ+Θ-ΒΑΙ.0mg ?L^+NAA0.5mg ^U1+GAl.5mg.L-1+抑菌劑 115ml.L-1 ； 所述增殖繼代培養(yǎng)基為:蔗糖30g噸―1+瓊脂4g -^+18+6^2.0mg -L^+NAA0.5mg -L-1+抑菌劑IlOml.L-1 ； 所述生根培養(yǎng)基為:蔗糖30g.L-1+瓊脂4g.r1+l/2MS+NAA0.8mg.L-1+抑菌劑113ml -L10
【文檔編號(hào)】A01N3/00GK103875732SQ201410097129
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月11日
【發(fā)明者】段曉宇, 唐敏, 葉萌, 張健 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)