Lycium exsertum組織培養(yǎng)及快速繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Lycium?exsertum組織培養(yǎng)及快速繁殖方法，以解決引進枸杞的繁殖問題。該方法包括如下步驟：外殖體處理、初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗以及移栽，本發(fā)明的優(yōu)點如下：A.本發(fā)明中對Lycium?exsertum進行繼代培養(yǎng)時，僅使用了6-芐氨基腺嘌呤與吲哚-3-乙酸配比，極大地降低了激素積累對多次繼代的影響，同時也降低了成本。B.本發(fā)明中對Lycium?exsertum的繼代苗木進行生根培養(yǎng)時，所采用的培養(yǎng)基配比中沒有添加任何激素，做到了培養(yǎng)基配制的簡化和成本的降低，并且效果較好。C.本發(fā)明中泥炭、蛭石、珍珠巖1∶1∶1的移栽基質(zhì)混合配比，能夠在栽培過程起到很好的保水和保溫的作用，能夠提高移栽的成活率。
【專利說明】Lyc i um exsertum組織培養(yǎng)及快速繁殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域,具體涉及Lycium exsertum組織培養(yǎng)及快速繁殖方法。
【背景技術(shù)】
[0002]爺科枸杞屬Lyciumexsertum是從美國引進的爺科枸杞屬植物,主要分布在亞利桑那沙漠地區(qū)，其進化程度高于我國的枸杞。在生殖進化上，已經(jīng)由雌雄同體和自交不親和的二倍體進化到自交親和的多倍體階段，而我國仍處在自交不親和的二倍體進化階段。該種枸杞的引進對于我國枸杞的種質(zhì)資源的改良有很大的意義。該種枸杞引進后面臨的首要問題是進行擴大繁殖。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種Lycium exsertum組織培養(yǎng)及快速繁殖方法，以解決引進枸杞的繁殖問題。
[0004]本發(fā)明技術(shù)方案如下:本發(fā)明種子為爺科枸杞屬(Lycium exsertum)購于美國的 S&S SEEDS, INC.聯(lián)系方式為 P.0.BOX 1275 CARPINTERIA AVE CARPINTERIA, CA93013，USA。
[0005]一種Lycium exsertum組織培養(yǎng)方法,具體步驟如下:
A、外殖體處理采用Lyciumexsertum幼嫩莖段作為外殖體,剪去葉片，留少量葉柄,每2-3個芽剪成一段，將莖段洗去污潰，后用水沖洗干凈，沖洗時間為5-10min，然后將其放入超凈工作臺中，進行 消毒，消毒后剪去莖段兩端，放于培養(yǎng)皿中備用；
優(yōu)選的，消毒的最佳方案如下:先用75%酒精振蕩消毒5s，再用0.1 %升汞溶液消毒6—6.5分鐘，最后用無菌水清洗3-4次；
B、初代培養(yǎng)
以MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加不同類型的激素及數(shù)量進行初代培養(yǎng)。通過初代培養(yǎng)可以獲得所繁育物種的無菌材料。這一階段的培養(yǎng)效果依植物種類及培養(yǎng)基成分而異，可能形成一個芽或多個芽。
[0006]優(yōu)選的，添加0.05mg/L的萘乙酸(NAA)、3%蔗糖和4g瓊脂，使用NaOH或HCl將培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.8。培養(yǎng)條件是光強為30001x全光照24h，溫度為:25°C，濕度為70%RH。
[0007]C、繼代培養(yǎng)
在初代培養(yǎng)的基礎上獲得的芽苗數(shù)量不多，還需進一步擴大繁殖，才能發(fā)揮組織培養(yǎng)快速繁殖的優(yōu)勢。
[0008]通過對L.exsertum的最佳培養(yǎng)基的篩選，培養(yǎng)材料為初代培養(yǎng)獲得的單苗或叢芽，以MS為基本培養(yǎng)基，添加6-芐氨基腺嘌呤與吲哚-3-乙酸。
[0009]優(yōu)選的，繼代培養(yǎng)基主要成分以及培養(yǎng)條件如下:以MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基,添加0.1 mg/L的6-芐氨基腺嘌呤和0.05 mg/L的吲哚-3-乙酸，使用NaOH或HCl將培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.8 ;培養(yǎng)條件是光強為30001x全光照24h，溫度為23°C，濕度為70%RH。
[0010]優(yōu)選的，所述6-芐氨基腺嘌呤和0.05 mg/L的吲哚_3_乙酸的濃度比為2:1時，芽分化系數(shù)最高，生長最旺盛。
[0011]D、生根培養(yǎng)
繼代培養(yǎng)擴大繁殖后進行生根誘導獲得完整再生的植株。
[0012]生根培養(yǎng)有三種優(yōu)選方案:方案一、所述步驟D生根培養(yǎng)條件:使用步驟C繼代培養(yǎng)植株葉片為材料，以1/4的MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加1.5%蔗糖和4g瓊脂，使用NaOH或HCl將培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.8 ;培養(yǎng)條件是光強為30001x下12h光暗交替，溫度為23°C，濕度為70%RH。
[0013]方案二、使用步驟B的培養(yǎng)植株葉片為材料進行叢芽增殖培養(yǎng)，
方案三、使用步驟C的培養(yǎng)植株葉片為材料進行叢芽增殖培養(yǎng)，方案二和三的培養(yǎng)條件:以1/2MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加1.0 mg/L的6-芐氨基腺嘌呤(6_BA)、0.5 mg/L的吲哚丁酸(IBA);培養(yǎng)條件是先在25°C下暗培養(yǎng)7d，然后在25°C、光強為30001x全光照，濕度為70%RH下培養(yǎng)至叢芽長出。此條件下叢芽增殖系數(shù)最高，生長最旺盛，增殖系數(shù)能達到
5.0以上。
[0014]E、煉苗移栽
煉苗:將生根培養(yǎng)的苗木在與移栽環(huán)境相同的條件下閉瓶煉苗5-7d，讓組培苗逐漸適應外界條件。
`[0015]移栽:煉苗移栽基質(zhì)以泥炭、蛭石、珍珠巖1:1:1混合配制，將苗子移栽到裝有基質(zhì)的花盆中，澆透水后，覆膜。
[0016]優(yōu)選的，煉苗移栽對基質(zhì)用0.1%多菌靈澆透，移栽時將煉好苗的植株的根部浸入
0.1%多菌靈和0.1 g/Ld的NAA混合溶液中浸泡lOmin。
[0017]優(yōu)選的，枸杞組培苗移栽初期，由于苗木幼嫩，必須設置遮陽網(wǎng)，光強度為全光照時的30%。每日通風，通風時間逐日加長，同時逐漸增加光強，直到全天開放。適時澆水，隔日噴少量0.1%多菌靈溶液，7天后噴1/4MS營養(yǎng)液。待幼苗成活后逐漸全光照。
[0018]發(fā)明的優(yōu)點:
I)本發(fā)明中對Lyciumexsertum進行繼代培養(yǎng)時,僅使用了 6-節(jié)氨基腺嘌呤(6-BA)與吲哚-3-乙酸(IAA)配比，極大地降低了激素積累對多次繼代的影響，同時也降低了成本。
[0019]2)本發(fā)明中對Lyciumexsertum的繼代苗木進行生根培養(yǎng)時,所采用的培養(yǎng)基配比中沒有添加任何激素，做到了培養(yǎng)基配制的簡化和成本的降低，并且效果較好。
[0020]3)本發(fā)明中泥炭、蛭石、珍珠巖1:1:1的移栽基質(zhì)混合配比，能夠在栽培過程起到很好的保水和保溫的作用，能夠提高移栽的成活率。
【具體實施方式】
[0021]以下實施例進一步說明本發(fā)明的具體實施過程，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0022]實施例1 A、外殖體處理
采集Lycium exsertum幼嫩莖段作為外殖體，剪去葉片，留少量葉柄,每2_3個芽剪成一段，將莖段用洗衣粉水洗去污潰，后用自來水沖洗干凈，沖洗時間為5-10min。然后將其放入超凈工作臺中，進行消毒，消毒后剪去莖段兩端，放于培養(yǎng)皿中備用。
[0023]B、初代培養(yǎng)
每次處理接種30瓶，外殖體接種后每隔7天記錄一次生長狀況。
[0024]以MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加0.05mg/L的NAA、3%蔗糖和4g瓊脂，使用NaOH或HCl將培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.8。培養(yǎng)條件是光強為30001x全光照 24h，溫度為25°C，濕度為70%RH。不定芽生長的比例達到93.3%。
[0025]C、繼代培養(yǎng)
培養(yǎng)材料為初代培養(yǎng)獲得的單苗或叢芽，以MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加0.1 mg/L的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)和0.05 mg/L的吲哚-3-乙酸(IAA)，使用NaOH或HCl將培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.8 ;培養(yǎng)條件是光照:24h/d，光強為30001x，溫度為23°C，濕度為70%RH。此條件增殖系數(shù)最高，生長最旺盛。每次處理接種30瓶，每7天觀察并記錄幼苗的增殖效果。
[0026]D、生根培養(yǎng)
生根培養(yǎng)基主要成分以及培養(yǎng)條件:以1/4的MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加1.5%蔗糖和4g瓊脂，使用NaOH或HCl將培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.8 ;培養(yǎng)條件是光強為30001x下12h光暗交替，溫度為23°C，濕度為70%RH。從第7d開始生根，15d后可移栽，生根率在80%以上，生根條數(shù)平均在4.3條。
[0027]E、煉苗移栽 煉苗:將生根培養(yǎng)的苗木在與移栽環(huán)境相同的條件下閉瓶煉苗5-7d，讓組培苗逐漸適應外界條件。
[0028]實施例2
與實施例1區(qū)別在于生根培養(yǎng)步驟不同:使用步驟B的培養(yǎng)植株葉片為材料進行叢芽增殖培養(yǎng)，以1/2MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加1.0 mg/L的6-芐氨基腺嘌呤、0.5 mg/L的吲哚丁酸(IBA);培養(yǎng)條件是先在25°C下暗培養(yǎng)7d，然后在25°C、光強為30001x全光照，濕度為70%RH下培養(yǎng)至叢芽長出。
[0029]實施例3
與實施例1區(qū)別在于生根培養(yǎng)步驟不同:使用步驟C的培養(yǎng)植株葉片為材料進行叢芽增殖培養(yǎng)，以1/2MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加1.0 mg/L的6-芐氨基腺嘌呤、0.5 mg/L的吲哚丁酸(IBA);培養(yǎng)條件是先在25°C下暗培養(yǎng)7d，然后在25°C、光強為30001x全光照，濕度為70%RH下培養(yǎng)至叢芽長出。此條件下叢芽增殖系數(shù)最高，生長最旺盛，增殖系數(shù)能達到
5.0以上。
[0030]實施例4
對實施例1煉苗后的產(chǎn)品進行移栽:煉苗移栽基質(zhì)以泥炭、蛭石、珍珠巖1:1:1混合配制，在移栽前對基質(zhì)進行高溫滅菌。冷卻后裝盆，準備移栽，移栽前對基質(zhì)用0.1%多菌靈澆透；移栽時將煉好苗的植株完整的從錐形瓶中取出，放入水中洗凈根上的培養(yǎng)基，將根部浸入0.1%多菌靈和0.1 g/L的NAA的混合溶液中浸泡lOmin。將苗子移栽到裝有基質(zhì)的花盆中，澆透水后，覆膜。
[0031]枸杞組培苗移栽初期，由于苗木幼嫩，必須設置遮陽網(wǎng)，光強度為全光照時的30%左右。每日通風，通風時間逐日加長，同時逐漸增加光強，直到全天開放。適時澆水，隔日噴少量0.1%多菌靈溶液，7天后噴1/4MS營養(yǎng)液。15d后統(tǒng)計成活率，移栽成活率在90%以上，而在沙和田園土基質(zhì)中移栽的效果較差。
[0032]實施例5與實施例1不同之處在于，步驟A消毒的具體方案如下:先用75%酒精振蕩消毒5s，再用0.1 %升汞溶液消毒6min，最后用無菌水清洗3_4次。
[0033]實施例6與實施例1不同之處在于，步驟A消毒的具體方案如下:先用75%酒精振蕩消毒5s,再用0.1 %升萊溶液消毒6.5min,最后用無菌水清洗3_4次。該方案效果最佳，正常生長的比例可達85%。
[0034]試驗
試驗一、考察用0.1%升汞消毒為6min，并且用75%酒精消毒，看消毒時間對初代培養(yǎng)生長的影響:
將準備好的材料先用75%酒精分別消毒4s、5s、6s、7s、8s ;再用0.1%升汞溶液消毒6min，后用無菌水沖洗3-4遍。再剪去嫩莖兩端接種，每瓶接種I個，每處理接種30瓶。接入培養(yǎng)基中，統(tǒng)計污染、干枯和正常生長的個數(shù)，結(jié)果見表1。
【權(quán)利要求】
1.一種Lycium exsertum組織培養(yǎng)及快速繁殖方法,其特征在于該方法包括如下步驟: A、外殖體處理采用爺科枸杞屬(Lyciumexsertum)幼嫩莖段作為外殖體,剪去葉片，留少量葉柄，每2-3個芽剪成一段，將莖段洗去污潰，后用水沖洗干凈，沖洗時間為5-10min，然后將其放入超凈工作臺中，進行消毒，消毒后剪去莖段兩端，放于培養(yǎng)皿中備用； B、初代培養(yǎng) 以MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基進行初代培養(yǎng)； C、繼代培養(yǎng) 培養(yǎng)材料為初代培養(yǎng)獲得的單苗或叢芽，以MS為基本培養(yǎng)基，添加6-芐氨基腺嘌呤與吲哚-3-乙酸； D、生根培養(yǎng):以MS為基本培養(yǎng)基； E、煉苗移栽 煉苗:將生根培養(yǎng)的苗木在與移栽環(huán)境相同的條件下閉瓶煉苗5-7d ;移栽:煉苗移栽基質(zhì)以泥炭、蛭石、珍珠巖1:1:1混合配制，將苗子移栽到裝有基質(zhì)的花盆中，澆透水后，覆膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Lyciumexsertum組織培養(yǎng)及快速繁殖方法,其特征在于:所述步驟A消毒方案如下:先用75%酒精振蕩消毒5s，再用0.1 %升汞溶液消毒6 — 6.5分鐘，最后用無菌水清洗3-4次·。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Lyciumexsertum組織培養(yǎng)及快速繁殖方法,其特征在于:所述步驟B的培養(yǎng)過程為以MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加0.05mg/L的萘乙酸、3%蔗糖和4g瓊脂，使用NaOH或HCl將培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.8，培養(yǎng)條件是光強為30001x全光照24h，溫度為25°C，濕度為70%RH。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的Lyciumexsertum組織培養(yǎng)及快速繁殖方法,其特征在于:所述步驟C繼代培養(yǎng)條件如下:以MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加0.1 mg/L的6-芐氨基腺嘌呤和0.05 mg/L的吲哚-3-乙酸，使用NaOH或HCl將培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.8 ;培養(yǎng)條件是光強為30001x全光照24h，溫度為23°C，濕度為70%RH。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的Lyciumexsertum組織培養(yǎng)及快速繁殖方法,其特征在于:所述6-芐氨基腺嘌呤和0.05 mg/L的吲哚-3-乙酸的濃度比為2:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的Lyciumexsertum組織培養(yǎng)及快速繁殖方法,其特征在于:所述步驟D生根培養(yǎng)條件:使用步驟C繼代培養(yǎng)植株葉片為材料，以1/4的MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加1.5%蔗糖和4g瓊脂，使用NaOH或HCl將培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.8 ;培養(yǎng)條件是光強為30001x下12h光暗交替，溫度為23°C，濕度為70%RH。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的Lyciumexsertum組織培養(yǎng)及快速繁殖方法,其特征在于:所述步驟D生根培養(yǎng)條件:使用步驟B或步驟C的培養(yǎng)植株葉片為材料進行叢芽增殖培養(yǎng)，以1/2MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加1.0 mg/L的6-芐氨基腺嘌呤、0.5 mg/L的吲哚丁酸；培養(yǎng)條件是先在25°C下暗培養(yǎng)7d，然后在25°C、光強為30001x全光照，濕度為70%RH下培養(yǎng)至叢芽長出。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的Lyciumexsertum組織培養(yǎng)及快速繁殖方法,其特征在于:所述步驟E中煉苗移栽對基質(zhì)用0.1%多菌靈澆透，移栽時將煉好苗的植株的根部浸入`0.1%多菌靈和0.1 g/Ld的NAA混合溶液中浸泡lOmin。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的Lyciumexsertum組織培養(yǎng)及快速繁殖方法,其特征在于:所述步驟E中組培苗移栽初期，設置遮陽網(wǎng)，光強度為全光照時的30%。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的Lyciumexsertum組織培養(yǎng)及快速繁殖方法,其特征在于:所述步驟E移栽前兩日遮光密封保濕培養(yǎng)，第三日開始每日通風，通風時間逐日加長，同時逐漸增加光強，直到全天開放；適時澆水，隔日噴少量0.1%多菌靈溶液，7天后噴1/4的MS營養(yǎng)液，待幼苗成活后逐漸全光照。``
【文檔編號】A01H4/00GK103843664SQ201410110179
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月24日
【發(fā)明者】李捷, 馮麗丹, 王有科, 張寶琳, 張廣忠, 蔡國軍 申請人:甘肅農(nóng)業(yè)大學