一種綠風(fēng)藤茶品種復(fù)壯的快速繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種綠風(fēng)藤茶品種復(fù)壯的組培快速繁殖方法，其步驟：A)外植體的選取與滅菌：取綠風(fēng)藤茶幼嫩枝條的莖尖，經(jīng)表面滅菌后備用；B）將滅菌后的綠風(fēng)藤茶幼嫩枝條的莖尖進(jìn)行初代培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下將經(jīng)表面滅菌后的外植體接種在初代培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)分化叢芽的培養(yǎng)基中；C)增殖培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下將叢芽切成單株接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)；D)壯苗培養(yǎng)；E)生根培養(yǎng)：將壯苗培養(yǎng)的叢生苗切成單株后，接種在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；F)移栽：將生根組培苗移栽于基質(zhì)中，培育1~2個(gè)月至成苗。方法易行，操作簡(jiǎn)便，有效地防止了外植體接種污染率，接種成功率達(dá)85%以上，生根整齊，苗壯，成活率高，適用于綠風(fēng)藤茶苗的商業(yè)生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】一種綠風(fēng)藤茶品種復(fù)壯的快速繁殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物莖尖脫毒以達(dá)到品種復(fù)壯的組培快繁【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體涉及一種綠風(fēng)藤茶品種復(fù)壯的組培快速繁殖方法。
【背景技術(shù)】
[0002]藤茶為葡萄科(Vitaceae)蛇葡萄屬(Ampe | opsis Michaux)藥食兩用的木質(zhì)藤本植物顯齒蛇葡萄(A.grossedentata (Hand.-Mazz.)ff.T.Wang),富含黃酮(二氫楊梅素)、氨基酸、多糖、多酚、維生素等多種有效成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)與生物活性研究表明，藤茶具有抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖、降血脂等多種生物活性。綠鳳藤茶(A.grossedentataCV, Iufeng,)是鄭小江等經(jīng)過(guò)多年選育的無(wú)性系，2003年12月通過(guò)湖北省恩施州農(nóng)作物品種審(認(rèn))定小組審(認(rèn))定和湖北省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)備案為推廣品種，所含多糖、總氨基酸、維生素等都極顯著高于顯齒蛇葡萄，是大量應(yīng)用于醫(yī)藥、保健、功能性飲食品工業(yè)的優(yōu)質(zhì)原料。目前，恩施州綠鳳藤茶的種植面積已達(dá)8000余畝，并產(chǎn)生了較好的經(jīng)濟(jì)效益。近年來(lái)，由于藤茶種植時(shí)間較長(zhǎng)且種苗均采用扦插的方式得到，其品種退化較為嚴(yán)重，使藤茶的產(chǎn)量及品質(zhì)均有所下降。
[0003]感染病毒植株的體內(nèi)病毒的分布并不均勻，病毒的數(shù)量隨植株部位及年齡而異，越靠近莖頂端區(qū)域的病毒的感染深度越低，生長(zhǎng)點(diǎn)(約0.1~1.0mm區(qū)域)則幾乎不含或含病毒很少。這是因?yàn)榉稚鷧^(qū)域內(nèi)無(wú)維管束，病毒只能通過(guò)胞間連絲傳遞，趕不上細(xì)胞不斷分裂和活躍的生長(zhǎng)速度。在切取莖尖時(shí)越小越好，但太小則不易成活，過(guò)大則不能保證完全除去病毒。莖尖培養(yǎng)脫毒，由于其脫毒效果好，后代穩(wěn)定，所以是目前培育無(wú)病毒苗的最廣泛最重要的一個(gè)途徑。
[0004]通過(guò)綠風(fēng)藤茶莖尖的組織培養(yǎng)得到了一種綠風(fēng)藤茶品種復(fù)壯的組培快繁技術(shù)，并確定了進(jìn)行組織培養(yǎng)的幾個(gè)培養(yǎng)基的最佳方案。通過(guò)大量繁殖，其成活率達(dá)85%以上，且性狀穩(wěn)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是在于提供了一種綠風(fēng)藤茶品種復(fù)壯的組培快速繁殖方法，方法易行，操作簡(jiǎn)便，有效地防止了外植體接種污染率，接種成功率達(dá)85%以上；提出的綠風(fēng)藤茶品種復(fù)壯的優(yōu)化培養(yǎng)基針對(duì)性強(qiáng)、適用性好，組培苗、叢生芽及芽增值系數(shù)高，生根整齊，苗壯，成活率高，適用于綠風(fēng)藤茶苗的商業(yè)生產(chǎn)。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
一種綠風(fēng)藤茶品種復(fù)壯的組培快速繁殖方法，其步驟是:
A)外植體的選取與滅菌:取健壯的綠風(fēng)藤茶幼嫩枝條的莖尖，經(jīng)表面滅菌后備用。外植體的選取與滅菌為當(dāng)年新萌發(fā)嫩枝的莖尖，剪掉嫩枝的葉片和卷須，切成長(zhǎng)0.4-0.6cm帶頂芽莖段，用洗潔精浸泡5~10 min后，用毛筆輕輕地刷洗干凈，流水沖洗2_4h，移至超凈工作臺(tái)上，用70% (體積比)的酒精震蕩清洗28-32S，無(wú)菌水洗2-4次，再放入質(zhì)量(g)與體積(mL)之比為0.1%的升汞溶液中震蕩消毒6-8min，無(wú)菌水沖洗4_6次后，在解剖鏡下切下0.4-0.6mm的莖尖，接種到初代培養(yǎng)基上；所述的洗潔精為普通的立白洗潔精(家里洗菜洗碗用的洗潔精均可)。
[0007]B)將滅菌后的綠風(fēng)藤茶幼嫩枝條的莖尖進(jìn)行初代培養(yǎng):在無(wú)菌條件下將經(jīng)表面滅菌后的外植體接種在初代培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15~20d后，轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)分化叢芽的培養(yǎng)基中；所述的初代培養(yǎng)基:WPM+6-BAl.5mg.L、NAA0.2mg.1^+PVPZg.L-1 +25g.L-1 蔗糖；或MS+6-BA1.5 mg.L、NAA0.2 mg.L-1+ PVP2g.L_1+25g.L-1 蔗糖；
C)增殖培養(yǎng):在無(wú)菌條件下將叢芽切成單株接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)30^45天叢生芽可增殖出51倍；根據(jù)對(duì)幼苗數(shù)量的需求，每隔3(T45d按同樣方法進(jìn)行幼苗再增殖培養(yǎng)；誘導(dǎo)叢生芽和芽增殖的培養(yǎng)基:MS+TDZ0.2mg.L^+IAA0.lmg.r1+25g.L—1蔗糖；或 WPM+6-BA1.5mg.L ^NAA0.2mg.L 1+25g.L 1 鹿糖；
D)壯苗培養(yǎng):將增殖培養(yǎng)的叢生芽轉(zhuǎn)接到含低濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)25~30d，可以改變植物體內(nèi)源激素水平的平衡，從而有利于以后階段的生根和移栽。所述的壯苗培養(yǎng)基:MS+6-BAl.0 mg.1^+NAA0.1 mg.^+258.L-1 蔗糖；
E)生根培養(yǎng):將壯苗培養(yǎng)的叢生苗切成單株后，接種在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)2(T30d后，幼苗基部長(zhǎng)出3、條根；所述的生根培養(yǎng)基:1/2MS+ PP3330.2mg.L klBA0.2mg.L 1+20g.L 1 鹿 糖。
[0008]F)移栽:將生根組培苗移栽于基質(zhì)中，培育f 2個(gè)月至成苗。所述的移栽基質(zhì)由草炭:蛭石按體積比1:3配制而成。
[0009]G)病毒檢測(cè):對(duì)莖尖成苗的植株進(jìn)行移栽后，隨機(jī)抽取10株幼苗，用電子顯微鏡觀察葉片的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，未發(fā)現(xiàn)病毒粒子。
[0010]所述的外植體的選取與滅菌為當(dāng)年新萌發(fā)嫩枝的莖尖，剪掉嫩枝的葉片和卷須，切成長(zhǎng)0.5cm帶頂芽莖段，用洗潔精浸泡5~10 min后，用毛筆輕輕地刷洗干凈，流水沖洗3h左右，移至超凈工作臺(tái)上，用70% (體積比)的酒精震蕩清洗30S左右，無(wú)菌水洗3次，再放入質(zhì)量(g)與體積(mL)之比為0.1%的升汞溶液中震蕩消毒7min，無(wú)菌水沖洗5次后，在解剖鏡下切下0.5mm的莖尖，接種到初代培養(yǎng)基上；
所述的初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等培養(yǎng)階段的培養(yǎng)條件是:光照強(qiáng)度為40 μ mol.m_2.s—1，光照時(shí)間12h.d-1。其中初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基ρΗ6.0-6.5，培養(yǎng)溫度為20^210C，增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等培養(yǎng)階段的培養(yǎng)溫度為23-25°C，培養(yǎng)基pH均為
5.6-6。
[0011]所述的移栽基質(zhì)由草炭:蛭石按體積比1:3配制而成。
[0012]通過(guò)綠風(fēng)藤茶莖尖的組織培養(yǎng)得到了一種綠風(fēng)藤茶品種復(fù)壯的組培快繁技術(shù)，并確定了進(jìn)行組織培養(yǎng)的幾個(gè)培養(yǎng)基的最佳方案。通過(guò)大量繁殖，其成活率達(dá)85%以上，且性狀穩(wěn)定。
[0013]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:
本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，易于掌握。本方法中外植體采取洗滌劑浸泡預(yù)處理和流水沖洗，有效地防止了外植體接種污染率，接種成功率達(dá)85%以上；提出的綠風(fēng)藤茶品種復(fù)壯的優(yōu)化培養(yǎng)基針對(duì)性強(qiáng)、適用性好，組培苗、叢生芽及芽增值系數(shù)高，生根整齊，苗壯，成活率高，適用于綠風(fēng)藤茶苗的商業(yè)生產(chǎn)；本方法所獲得的綠風(fēng)藤茶達(dá)到了品種復(fù)壯的目的，在產(chǎn)量及品質(zhì)方面均有所提聞。
【具體實(shí)施方式】
[0014]通過(guò)以下實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
[0015]實(shí)施例1:
一種綠風(fēng)藤茶品種復(fù)壯的組培快速繁殖方法，其步驟是:
1)外植體的選取與滅菌:
取100個(gè)健壯的綠風(fēng)藤茶幼嫩枝條的莖尖，經(jīng)表面滅菌后備用。
[0016]選取100個(gè)10或13或15cm新萌發(fā)的嫩枝,剪掉葉片和卷須，切成長(zhǎng)0.5cm帶頂芽莖段，用洗潔精浸泡5或8或10 min后，用毛筆輕輕地刷洗干凈，流水沖洗3h左右，移至超凈工作臺(tái)上，用70% (體積比)的酒精震蕩清洗30S左右，無(wú)菌水洗3或4或5次，再放入質(zhì)量(g)與體積(mL)之比為0.1%的升汞溶液中震蕩消毒7min，無(wú)菌水沖洗5次后，在解剖鏡下切下0.5mm的莖尖，接種到初代培養(yǎng)基上；
2)培養(yǎng)基的配制:
(1)初代培養(yǎng)基:WPM+6-BAl.5mg.L-1+NAA0.2mg.L_1+PVP2g.L_1+25g.l-1 蔗糖；pH6.0 或
6.1或6.2或6.3或6.4或6.5，培養(yǎng)溫度為20或21°C
(2)誘導(dǎo)叢生芽和芽增殖的培養(yǎng)基:MS+TDZ0.2mg.L-1'+ΙΑΑΟ.lmg.^+258.L—1蔗糖；
(3)壯苗培養(yǎng)基:MS+6-BAl.0 mg.L_1+NAA0.1 mg.L_1+25g.L—1 蔗糖；
(4)生根培養(yǎng)基:1/2MS+PP3330.2 mg.L_1+IBA0.2mg.U^Og.L-1 蔗糖。
[0017]上述培養(yǎng)基均附加0.7g.L—1瓊脂，光照強(qiáng)度為40 μ mol.m_2.s—1，光照時(shí)間12h.cf1。其中培養(yǎng)基(I) Ph5.5或5.7或5.9或6或6.1或6.2，培養(yǎng)溫度為20或21°C，其他培養(yǎng)基pH均為5.8，溫度為21或22或23或24或25或29°C。
[0018]3)初代培養(yǎng):在無(wú)菌條件下將經(jīng)表面滅菌后的外植體接種在初代培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15或16或17或18或19或20d后，成活率為95%，轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)分化叢芽的培養(yǎng)基中；
4)增殖培養(yǎng):在無(wú)菌條件下將叢芽切成單株接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30或33或36或39或42或45d增殖出叢生芽，芽的增值倍數(shù)可達(dá)5或6或7或8倍。根據(jù)對(duì)幼苗數(shù)量的需求，每隔30或32或35或38或41或43或45d按同樣方法進(jìn)行幼苗再增殖培養(yǎng)；
5)壯苗培養(yǎng):初代培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)過(guò)程中，由于高濃度細(xì)胞分裂素的影響，芽的生長(zhǎng)受到了抑制，在含有較高濃度的細(xì)胞分裂素的增殖階段后緊接著進(jìn)行低濃度細(xì)胞分裂素或不含細(xì)胞分裂素的壯苗階段培養(yǎng)，可以改變植物體內(nèi)源激素水平的平衡，從而有利于以后階段的生根和移栽。將增殖培養(yǎng)的叢生芽轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)25或26或27或28或29 或 30d ；
6)生根培養(yǎng):將壯苗培養(yǎng)的叢生苗切成單株后，接種在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)20或22或24或26或28或30d后，幼苗基部長(zhǎng)出3或5或7或8條根，生根率達(dá)92%。獲得生根苗475株；
7)移栽:將生根組培苗移栽于基質(zhì)中，培育I或2個(gè)月至成苗，獲得健壯植株406株。
[0019]8)病毒檢測(cè):對(duì)莖尖成苗的植株進(jìn)行移栽后，隨機(jī)抽取10株幼苗，用電子顯微鏡觀察葉片的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，未發(fā)現(xiàn)病毒粒子。
[0020]實(shí)施例2:
一種綠風(fēng)藤茶品種復(fù)壯的組培快速繁殖方法，其步驟是:
O外植體的選取與滅菌:
取100個(gè)健壯的綠風(fēng)藤茶幼嫩枝條的莖尖，經(jīng)表面滅菌后備用。
[0021]選取100個(gè)10或12或14或15cm新萌發(fā)的嫩枝，剪掉葉片和卷須，切成長(zhǎng)0.5cm帶頂芽莖段，用洗潔精浸泡5或7或10 min后，用毛筆輕輕地刷洗干凈，流水沖洗3h左右，移至超凈工作臺(tái)上，用70%的酒精震蕩清洗30S左右，無(wú)菌水洗3或4或5次，再放入0.1%的升汞溶液中震蕩消毒7min，無(wú)菌水沖洗5次后，在解剖鏡下切下0.5mm的莖尖，接種到初代培養(yǎng)基上；
2)培養(yǎng)基的配制:
(1)初代培養(yǎng)基:MS+6-BAl.5 mg.L、NAA0.2 mg.L-1+ PVP2g.L_1+25g.L-1 蔗糖；
(2)誘導(dǎo)叢生芽的培養(yǎng)基:WPM+6-BAl.5mg.L-'+ΝΑΑΟ.2mg.^+258.L-1 蔗糖；
(3)壯苗培養(yǎng)基:MS+6-BAl.0 mg.L_1+NAA0.1 mg.L_1+25g.L—1 蔗糖；
(4)生根培養(yǎng)基:1/2MS+PP3330.2 mg.L_1+IBA0.2mg.U^Og.L-1 蔗糖。
[0022]上述培養(yǎng)基均附加0.7g.L-1瓊脂，光照強(qiáng)度為40 μ mol.m_2.s—1，光照時(shí)間12h.cf1。其中培養(yǎng)基(l)Ph5.6或5.9或6.2，培養(yǎng)溫度為20或21 °C，其他培養(yǎng)基pH均為5.8，溫度為21或22或23或24或25°C。
[0023]3)初代培養(yǎng):在無(wú)菌條件下將經(jīng)表面滅菌后的外植體接種在初代培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15或17或18或20d后，成活率為87%，轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)分化叢芽的培養(yǎng)基中；
4)增殖培養(yǎng):在無(wú)菌條件下將叢芽切成單株接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30或32或36或38或42或45d增殖出叢生芽，芽的增值倍數(shù)可達(dá)3或4或5倍。根據(jù)對(duì)幼苗數(shù)量的需求，每隔30或34或38或43或45d按同樣方法進(jìn)行幼苗再增殖培養(yǎng)；
5)壯苗培養(yǎng):初代培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)過(guò)程中，由于高濃度細(xì)胞分裂素的影響，芽的生長(zhǎng)受到了抑制，在含有較高濃度的細(xì)胞分裂素的增殖階段后緊接著進(jìn)行低濃度細(xì)胞分裂素或不含細(xì)胞分裂素的壯苗階段培養(yǎng)，可以改變植物體內(nèi)源激素水平的平衡，從而有利于以后階段的生根和移栽。將增殖培養(yǎng)的叢生芽轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)25或7或29或30d ;
6)生根培養(yǎng):將壯苗培養(yǎng)的叢生苗切成單株后，接種在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)20或24或28或30d后，幼苗基部長(zhǎng)出3或4或5或6或7或8條根，生根率達(dá)90%。獲得生根苗438株；
7)移栽:將生根組培苗移栽于基質(zhì)中，培育I或2個(gè)月(33或38或45或50或55天)至成苗，獲得健壯植株377株。
[0024]8)病毒檢測(cè):對(duì)莖尖成苗的植株進(jìn)行移栽后，隨機(jī)抽取10株幼苗，用電子顯微鏡觀察葉片的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，未發(fā)現(xiàn)病毒粒子。
【權(quán)利要求】
1.一種綠風(fēng)藤茶品種復(fù)壯的組培快速繁殖方法，其步驟是: A)外植體的選取與滅菌:取綠風(fēng)藤茶幼嫩枝條的莖尖，經(jīng)表面滅菌后備用，外植體的選取與滅菌為當(dāng)年新萌發(fā)嫩枝的莖尖，剪掉嫩枝的葉片和卷須，切成長(zhǎng)0.4-0.6cm帶頂芽莖段，用洗潔精浸泡5~10 min后，刷洗干凈，流水沖洗2_4h，移至超凈工作臺(tái)上，用70%體積比的酒精震蕩清洗28-32S，無(wú)菌水洗2-4次，再放入質(zhì)量與體積之比為0.1%的升汞溶液中震蕩消毒6-8min，無(wú)菌水沖洗4_6次后，在解剖鏡下切下0.4-0.6mm的莖尖，接種到初代培養(yǎng)基上； B)將滅菌后的綠風(fēng)藤茶幼嫩枝條的莖尖進(jìn)行初代培養(yǎng):在無(wú)菌條件下將經(jīng)表面滅菌后的外植體接種在初代培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15~20d后，轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)分化叢芽的培養(yǎng)基中；所述的初代培養(yǎng)基:WPM+6-BAl.5mg.L_1+NAA0.2mg.L_1+PVP2g.L-1 +25g.L-1 蔗糖；或 MS+6-BA1.5mg.L-1+NAA0.2 mg.L:+ PVP2g.L 1+25g.L -1 鹿糖； C)增殖培養(yǎng):在無(wú)菌條件下將叢芽切成單株接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)30-45天叢生芽可增殖出51倍；根據(jù)對(duì)幼苗數(shù)量，每隔3(T45d按同樣方法進(jìn)行幼苗再增殖培養(yǎng)；誘導(dǎo)叢生芽和芽增殖的培養(yǎng)基:MS+TDZ0.2mg.L-1+NAAO.1mg.L+258.L—1蔗糖； D)壯苗培養(yǎng):初代培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)過(guò)程中，將增殖培養(yǎng)的叢生芽轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng) 25~30d ;所述的壯苗培養(yǎng)基:MS+6-BAl.0 mg.L-1+NAA0.1 mg.L-1+25g.L-1 蔗糖； E)生根培養(yǎng):將壯苗培養(yǎng)的叢生苗切成單株后，接種在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)20-30d后，幼苗基部長(zhǎng)出3-8條根；所述的生根培養(yǎng)基:1/2MS+ PP3330.2mg.L-1+ IBA0.2mg.L -1+20g.L- 1 鹿糖； F)移栽:將生根組培苗移栽于基質(zhì)中，培育廣2個(gè)月至成苗，所述的移栽基質(zhì)由草炭:蛭石按體積比1:3配制而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種綠風(fēng)藤茶品種復(fù)壯的組培快速繁殖方法，其特征在于:所述的初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件是，光照強(qiáng)度為40 μ mol.m_2.s'光照時(shí)間12h.d-1，其中初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基pH6.0-6.5，培養(yǎng)溫度為20-21°C，增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)培養(yǎng)階段的培養(yǎng)溫度為23-25°C，培養(yǎng)基pH為5.6_6。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103891613SQ201410110182
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月24日
【發(fā)明者】武蕓, 鄭小江, 張澤, 武玉蓮, 卜貴軍, 曾智, 楊婷, 方響亮 申請(qǐng)人:湖北民族學(xué)院