利用玉米秸稈酶解液制備促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了利用玉米秸稈酶解液制備促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑的方法。該方法，包括：(1)將玉米秸稈在180-200℃和1.0-2.0Mpa條件下進(jìn)行水熱處理，得到經(jīng)過預(yù)處理的玉米秸稈；(2)將所述經(jīng)過預(yù)處理的玉米秸稈粉碎后，用纖維素酶進(jìn)行酶解，分別收集酶解液和酶解殘?jiān)唬?）用所述酶解液、(NH4)2SO4、MgSO4、CaCO3、玉米漿和水配制發(fā)酵培養(yǎng)基，每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中所述酶解液的含量滿足每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量為20-50g；(4)向所述發(fā)酵培養(yǎng)基中接入牡丹抗病促生菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后收集發(fā)酵液，將所述發(fā)酵液和所述酶解殘?jiān)旌?，得到促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑。
【專利說明】利用玉米秸稈酶解液制備促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及利用玉米秸桿酶解液制備促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]牡丹歸芍藥科(Paeoniaceae)、芍藥屬(Paeonia)，一直以來都是中國最重要的觀賞植物和藥用植物之一，已有1600多年的歷史。目前，牡丹在國內(nèi)的主要栽培地點(diǎn)為荷澤、洛陽、北京、臨夏、天彭、銅陵等。近年來，牡丹的油用價(jià)值日漸凸顯，油用牡丹的發(fā)展呈現(xiàn)出快速擴(kuò)張的態(tài)勢。對(duì)于觀賞牡丹來講，一個(gè)突出的問題是，由于不同地區(qū)氣候環(huán)境和土壤性質(zhì)的差異造成的土壤微生態(tài)活性降低，是引種地區(qū)栽培牡丹生長狀況不良、觀賞性狀下降的重要原因之一。而對(duì)于油用牡丹，如何科學(xué)施肥并顯著提高牡丹籽的產(chǎn)量則是非常迫切的問題。在牡丹的栽培過程中，還面臨著一些真菌病害的威脅，主要有灰霉病(Botrytispaeoniae)、紅斑病(Cladosporium aeoniae)和褐斑病(Cercospora paeoniae)等。因此，研制促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的微生物菌劑具有顯著和迫切的現(xiàn)實(shí)意義。其中，篩選對(duì)牡丹兼具促生和拮抗病原菌功能的植物促生細(xì)菌菌種資源是限制微生物菌劑發(fā)展的重要瓶頸因素。
[0003]目前大多數(shù)菌劑的發(fā)酵都采用淀粉質(zhì)原料，但我國耕地資源緊張，糧食生產(chǎn)壓力巨大，難以支撐龐大發(fā)酵工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，需要尋找更豐富的可再生資源作為生產(chǎn)原料以用于菌劑的生產(chǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問題是提供一種縮短生產(chǎn)周期并且菌體含量達(dá)到淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)水平的制備促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑的方法。
[0005]本發(fā)明所提供的制備促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑的方法，包括:
[0006](I)將玉米秸桿在 180-2000C (如 180°C或 200°C )和 1.0-2.0Mpa (如 1.0Mpa 或
2.0Mpa)條件下進(jìn)行水熱處理，得到經(jīng)過預(yù)處理的玉米秸桿；
[0007](2)將所述經(jīng)過預(yù)處理的玉米秸桿粉碎后，用纖維素酶進(jìn)行酶解，分別收集酶解液和酶解殘?jiān)?br> [0008](3)用所述酶解液、(NH4)2S04、MgSO4, CaCO3、玉米漿和水配制發(fā)酵培養(yǎng)基，每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中所述酶解液的含量滿足每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量為20-50g (如20g)；
[0009](4)向所述發(fā)酵培養(yǎng)基中接入促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的細(xì)菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后收集發(fā)酵液，將所述發(fā)酵液和所述酶解殘?jiān)旌?，得到促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑。
[0010]上述方法中，所述(I)中，所述水熱處理時(shí)間可為10-20min (如1min或20min)。
[0011]上述方法中，所述(2)可為將所述經(jīng)過預(yù)處理的玉米秸桿粉碎后，按以干重計(jì)每克秸桿加入10-15FPU (纖維素酶活單位)(如15FPU)的比例加入纖維素酶，在55-80°C (如55°C )、pH為4.8-5.0的條件下在水中酶解24_48h (如48h)，得到玉米秸桿酶解物，將所述玉米秸桿酶解物進(jìn)行離心，分別收集上清液和沉淀，所述上清液即為所述酶解液，所述沉淀即為所述酶解殘?jiān)?br> [0012]上述方法中，所述(3)中，每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，(NH4)2SO4的含量為10g，MgSO4的含量為0.4g、CaCO3的含量為6g、玉米漿的含量為2g。
[0013]上述方法中，所述(4)中，所述發(fā)酵液和所述酶解殘?jiān)砂凑?:1的質(zhì)量比進(jìn)行混合。
[0014]上述方法中，所述(2)中，所述粉碎是將所述經(jīng)過預(yù)處理的玉米秸桿粉碎至50-100 目。
[0015]上述方法中，所述促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的細(xì)菌為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymy xa) CSM1101,其在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為CGMCC N0.8527。
[0016]上述方法中，所述(4)在30°C培養(yǎng)18-30小時(shí)(如24_30小時(shí))進(jìn)行發(fā)酵。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)14小時(shí)時(shí)補(bǔ)加所述酶解液，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖含量為20g/L，繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)結(jié)束發(fā)酵；在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)結(jié)束發(fā)酵。
[0017]由上述方法制備的促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑及該菌劑的用途也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0018]本發(fā)明所提供的促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑的用途，所述用途為下述CD-C3)中任一種:
[0019]Cl)促進(jìn)牡丹生長和拮抗病原菌；
[0020]C2)促進(jìn)牡丹生長；
[0021]C3)拮抗病原菌。
[0022]上述用途中，所述促進(jìn)牡丹生長可體現(xiàn)為下述BI) -B7)中的任一種:
[0023]BI)縮短牡丹種子生根時(shí)間；
[0024]B2)提高牡丹種子生根率；
[0025]B3)縮短牡丹種子的發(fā)芽時(shí)間；
[0026]B4)提高牡丹種子的發(fā)芽率；
[0027]B5)提高牡丹的主根長度；
[0028]B6)提聞牡丹苗聞；
[0029]B7)提高牡丹幼苗生物量；
[0030]所述拮抗病原菌可為拮抗牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉(Cladosporium paeoniae)和茍藥雜色尾抱霉菌(Cercospora varricolor Winter)中的三種、任兩種或任一種。所述提高牡丹幼苗生物量體現(xiàn)為提高牡丹幼苗的鮮重或干重。
[0031]本發(fā)明還提供了一種利用促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑促進(jìn)牡丹生長的方法。
[0032]本發(fā)明所提供的促進(jìn)牡丹生長的方法，包括在生根前將浸種后的牡丹種子用所述促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑處理1-3小時(shí)(如I小時(shí))再進(jìn)行生根培養(yǎng)的步驟。
[0033]上述方法中，將浸種后的牡丹種子用所述菌劑處理的方式因所述菌劑的物理狀態(tài)而異，如果所述菌劑為液態(tài)，直接用所述菌劑浸泡所述浸種后的牡丹種子即可，所述菌劑中的所述多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa) CSMl 101的含量可為18Cfu/ml-109cfu/ml (如109cfu/ml);如果所述菌劑為固態(tài),需要向所述菌劑中加水制成液體菌劑，再用該液體菌劑浸泡所述浸種后的牡丹種子，所述液體菌劑中的所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) CSMl 101 的含量可為 108cfu/ml-109cfu/ml (如 109cfu/ml)。
[0034]上文中，所述牡丹可為鳳丹(Paeonia ostii)。
[0035]本發(fā)明以玉米秸桿作為發(fā)酵生產(chǎn)促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑的原料，針對(duì)淀粉質(zhì)原料發(fā)酵蒸煮、液化等預(yù)處理高能耗的缺點(diǎn)，采用水熱處理技術(shù)、纖維素酶酶解技術(shù)對(duì)玉米秸桿進(jìn)行預(yù)處理，具有如下特點(diǎn):1、采用水熱處理技術(shù)對(duì)玉米秸桿進(jìn)行預(yù)處理，省去了淀粉質(zhì)原料長時(shí)間的蒸煮過程，降低了發(fā)酵生產(chǎn)促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑的能耗，縮短了生產(chǎn)周期。2、采用玉米秸桿酶解液替代淀粉質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑，其活菌數(shù)可達(dá)2.58X101(lCfu/mL，芽孢生成率為80%以上，達(dá)到了淀粉質(zhì)原料的生產(chǎn)水平；玉米秸桿酶解殘?jiān)苯幼鳛榇龠M(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑的載體，提高了玉米秸桿的綜合利用率。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明菌劑處理的牡丹種子(菌劑組層積處理)的生根時(shí)間比對(duì)照組層積處理提前了 10天；菌劑組層積處理的生根率達(dá)到95.0%，比對(duì)照組層積處理(未用菌劑處理)的生根率提高了 33.8%;菌劑組層積處理的主根長度為69.0mm，是對(duì)照組層積處理的1.68倍；菌劑組層積處理的主根長度> 40mm的種子百分率達(dá)到90±0.5%，是對(duì)照組層積處理的1.3倍；菌劑組層積處理的發(fā)芽時(shí)間比對(duì)照組層積處理縮短了 10天；菌劑組層積處理的發(fā)芽率達(dá)到99.0%，是對(duì)照組層積處理的1.2倍；菌劑組層積處理的苗高是對(duì)照組層積處理的1.77倍，菌劑組層積處理的干重是對(duì)照組層積處理的2.27 倍。說明以多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM1101CGMCC N0.8527 為活性成分的促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑不但拮抗牡丹病原菌還顯著地促進(jìn)了牡丹種子的生根(胚根萌發(fā))和發(fā)芽(胚芽萌發(fā))和牡丹幼苗的生長。
保藏說明
[0036]菌種名稱:多粘類芽孢桿菌
[0037]拉丁名:Paenibacilluspolymyxa
[0038]菌株編號(hào):CSM1101
[0039]保藏機(jī)構(gòu):中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心
[0040]保藏機(jī)構(gòu)簡稱:CGMCC
[0041]地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)
[0042]保藏日期:2013年12月09日
[0043]保藏中心登記入冊編號(hào):CGMCC N0.8527

【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1為菌劑組層積處理和對(duì)照組層積處理部分種子生根培養(yǎng)60天的照片。
[0045]a為對(duì)照組層積處理，b為菌劑組層積處理。

【具體實(shí)施方式】
[0046]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0047]下述實(shí)施例中所用的牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae) ACCC36053和牡丹枝孢霉(Cladosporium paeoniae) ACCC36063于本申請(qǐng)的申請(qǐng)日前均收藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中心(簡稱八00:，地址:北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街12號(hào)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，郵編100081 )，這兩個(gè)菌株的收藏日均為2006年8月31日，自收藏之日起，公眾可從中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中心獲得該菌株。
[0048]下述實(shí)施例中所用的牡丹褐斑病病原菌為芍藥雜色尾孢霉菌(Cercosporavarricolor Winter)(張建國，2001.牡丹的主要病害及防治.中國花丼園藝，23:32-34)公眾可從上海辰山植物園獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。
[0049]下述實(shí)施例中的牡丹為鳳丹(Paeoni a ostii) (Jigang Han, YaoSong, ZhigangLiu,etc.2011.Culturable bacterial community analysis in theroot domainsof two varieties of tree peony (Paeonia ostii).FEMS Microb1lLett, 322:15 - 24)公眾可從上海辰山植物園獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。
[0050]下述實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基如下:
[0051]半固體D δ bereiner 無氮培養(yǎng)基:鹿糖，1g ;蘋果酸，5g ；KH2PO4.H2O, 0.4g ；K2HPO4.H2O, 0.1g ；MgS04.7Η20，0.2g ;NaCl，0.1g ；CaCl2.2Η20，0.02g ；FeCl3,0.01g ；Na2MoO4.2Η20，0.02g ;瓊脂，3g ;用蒸餾水定容至 1000ml、pH7.0-7.2。121°C蒸氣滅菌 20min。
[0052]D o bereiner 無氮培養(yǎng)基:鹿糖，1g ;蘋果酸，5g ；KH2PO4.H2O, 0.4g ；K2HPO4.H2O,
0.1g ；MgSO4.7Η20，0.2g ;NaCl，0.1g ；CaCl2.2Η20，0.02g ；FeCl3,0.01g ；Na2MoO4.2H20,
0.02g ;瓊脂18g ;用蒸餾水定容至1000ml、ρΗ7.0-7.2。121°C蒸氣滅菌20min。
[0053]NB培養(yǎng)基:葡萄糖5.0g,蛋白胨5.0g,牛肉膏3.0g,用蒸懼水定容至1000ml,ρΗ7.0-7.2，121°C 滅菌 20min。
[0054]NA培養(yǎng)基:葡萄糖5.0g,蛋白胨5.0g,牛肉膏3.0g,瓊脂18g,用蒸懼水定容至1000ml, ρΗ7.0-7.2，121。。滅菌 20min。
[0055]PDA培養(yǎng)基:葡萄糖20g，瓊脂18g，馬鈴薯200g，加水100mL煮沸30min濾取汁液，加水補(bǔ)足 1000ml, ρΗ6.0-7.0,121°C滅菌 20min。
[0056]下述實(shí)施例中的纖維素酶購于生工生物工程(上海)股份有限公司。下述實(shí)施例中的纖維素酶酶活力單位(FPU)定義為Ig纖維素酶粉在55°C下60min內(nèi)水解濾紙所得葡萄糖μ mo I數(shù)。纖維素酶酶活力的具體測定方法如下:取纖維素酶10.0OgJP 100mlpH4.85的0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液充分溶解，得到纖維素酶液，將纖維素酶液稀釋后，吸取
0.5ml,加入0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液1.5ml, I X6cm新華一號(hào)濾紙條一張,55°C下水解60min。水解完畢后采用如下的DNS法測定體系中的葡萄糖含量，并計(jì)算纖維素酶的酶活力。
[0057]下述實(shí)施中，發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖含量的測定方法采用DNS法，具體如下:
[0058](I)DNS試劑的配制:200X酒石酸鉀鈉，溶于一定量的水中，加熱溶解，添加
10.0g3, 5-二硝基水楊酸，1g NaOH溶解后加入2g苯酹,0.5g無水亞硫酸鈉,全部加熱溶解后，冷卻至室溫，定容至1000ml。
[0059](2)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確稱取100.0mg分析純的無水葡萄糖(預(yù)先在105°C干燥至恒重)，用少量蒸餾水溶解后，定量轉(zhuǎn)移到10ml容量瓶中，再定容到刻度、搖勻，濃度為lmg/mL。取10支試管,分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、
1.0mLU.2mL、l.6mL后，用蒸餾水稀釋至2mL，再加入2.5mL DNS試劑混合均勻，在沸水中加熱5min。取出后即用水冷卻至室溫，定容到25ml，搖勻。30min后于520nm下測OD值。以O(shè)D520值為縱坐標(biāo),葡萄糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,形式為Y=aX+b。
[0060](3)發(fā)酵液中葡萄糖濃度的測定:取稀釋到一定濃度的發(fā)酵上清液(4000r/min，離心20min)，加入2.5mL DNS試劑混合均勻，在沸水中加熱5min。取出用水冷卻到室溫，定容至25mL，搖勻，靜置30min后于520nm出測OD52tl值。根據(jù)樣品的OD52tl值與標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中的葡萄糖含量。
[0061]實(shí)施例1、多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) CSM1101的分離與鑒定
[0062]一、多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa) CSMl 101 的分離
[0063]從安徽省銅陵市順安鎮(zhèn)金山村丹皮種植地的牡丹(Paeonia ostii,鳳丹)(株齡6年)植株的根際采集土樣，將土樣放入裝有無菌水和滅菌玻璃珠的小三角瓶中，200rpm/min振蕩20min ;取振蕩后的懸液做系列梯度稀釋，13UO4稀釋度懸液各吸取200 μ I均勻涂布D δ bereiner無氮培養(yǎng)基,置30°C培養(yǎng)4d后,挑取單菌落,在
[0064]D 6 bereiner無氮培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基平板上用平板劃線法進(jìn)行菌種純化。將分離純化所得的其中一個(gè)菌株命名為牡丹根際固氮菌CSM1101。
[0065]二、牡丹根際固氮菌CSM1101的鑒定
[0066]1.形態(tài)特征觀察和生理生化特性測定
[0067]形態(tài)學(xué)和生理生化特性鑒定參考“伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊”(Garrity，2001)和“一般細(xì)菌學(xué)常用鑒定方法”(東秀珠等，2001)，按照常規(guī)方法進(jìn)行。
[0068]牡丹根際固氮菌CSM1101的形態(tài)學(xué)特征如下:革蘭氏陽性，運(yùn)動(dòng)，菌體呈桿狀，直徑為0.6-0.8 μ m，長為2.0-7.6 μ m。芽孢柱狀，1.6-3.5X1.2-1.5 μ m，中生到次端生。孢子囊明顯膨大成紡錘型或棒狀。其菌落邊緣不整齊裂片狀，半透明到不透明。后其菌落粗糙，淺白色，中間略突起。菌落粘著在培養(yǎng)基表面。
[0069]牡丹根際固氮菌CSMl 101的生理生化特征測定結(jié)果如下:
[0070]水解淀粉:陰性；
[0071]水解酪蛋白:陰性；
[0072]水解明膠:陰性；
[0073]利用檸檬酸鹽:陰性；
[0074]酪氨酸分解:陰性；
[0075]苯丙氨酸脫氨酶實(shí)驗(yàn):陰性；
[0076]卵黃卵磷脂酶實(shí)驗(yàn):陰性；
[0077]吲哚產(chǎn)生:陰性；
[0078]馬尿酸鹽實(shí)驗(yàn):陰性；
[0079]接觸酶實(shí)驗(yàn):陽性；
[0080]硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn):陽性；
[0081]二羥丙酮產(chǎn)生:陽性；
[0082]抗溶菌酶實(shí)驗(yàn):陽性；
[0083]分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣:陽性；
[0084]分解阿拉伯糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣:陽性；
[0085]分解木糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣:陽性；
[0086]分解甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣:陽性；
[0087]耐鹽性試驗(yàn):7%NaCl生長；
[0088]在pH6.8的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)和pH5.7的沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中均可生長。在MR-VP肉湯上產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，pH6.0。
[0089]2.16S rDNA的序列擴(kuò)增和分析
[0090]采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN公司)提取基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板。PCR 引物(Pf5’ -CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 和 Pr5’ -CGGGATCCAAGGAGGTGATCCAGCC-3’)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用Perkin-ElmerGeneAmp PCRSystem9700PCR 擴(kuò)增細(xì)菌的 16S rDNA。反應(yīng)體系為 10XPCR buffer, 2.5uL ；dNTP (2.5mM)(TaKaRa), 2uL, Pf (10pmol/uL)0.1uL, Pr (10pmol/uL)0.1uL, Taq 聚合酶(5U/uL) (TaKaRa),0.125uL，基因組DNA0.5uL，加ddH20至25uL。PCR反應(yīng)條件為，94°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，52°C復(fù)性lmin，72°C延伸lmin，72°C最后延伸10min，30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司純化并測序。將菌株的16S rDNA序列在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比較分析。
[0091]結(jié)果表明測得的牡丹根際固氮菌CSM110116S rDNA序列全長1496bp，如SEQIDN0.1。在GENBANK進(jìn)行blastn分析的結(jié)果表明，其序列與Paenibacillus polymyxa strainM-1 (EF656457)的相似性達(dá)到99%。
[0092]根據(jù)牡丹根際固氮菌CSM1101的形態(tài)特征、生理生化特征和16s rDNA序列同源性分析結(jié)果，將牡丹根際固氮菌CSM1101鑒定為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)。多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa) CSMl 101已于2013年12月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8527。
[0093]實(shí)施例2、多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) CSMl 101的生物活性
[0094]一、多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) CSM1101的固氮活性測定
[0095]固氮活性測定采用乙炔還原法。在15mmX 15mm螺口試管中加入2.5mL半固體D δ bereiner 無氮培養(yǎng)基，接種多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa) CSMl 10ICGMCCN0.8527后，塞好棉塞，30°C培養(yǎng)24h ;再換無菌膠塞密封，抽出10%氣體，注入相同體積的乙炔，30°C培養(yǎng)24h。抽取氣樣在Varian VISTA6000型氣相色譜儀上測定ARA (acetyienereduct1n activity,乙炔還原活性)。實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)重復(fù)，取其平均值并計(jì)算方差不大于5%。
[0096]測定結(jié)果表明,CSM1101在D6 bereiner無氮培養(yǎng)基中表現(xiàn)出了較高的固氮活性。其乙炔還原活性為12.6C2Hxnmol mL-h-1.,
[0097]二、多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa) CSM1101 的抑菌活性
[0098]以牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae) ACCC36053、牡丹枝孢霉(Cladosporiumpaeoniae) ACCC36063> 茍藥雜色尾抱霉菌(Cercospora varricolorWinter)中的任一菌株單獨(dú)為病原菌，均采用平板對(duì)峙法測定抑菌率，具體方法如下:病原菌菌株在PDA斜面上活化后，加入無菌水制成病原菌懸浮液，將病原菌懸浮液加到融化后冷卻到45-50°C的PDA培養(yǎng)基中混勻倒平板，在30°C培養(yǎng)4天，得到病原菌平板，用直徑為6mm的打孔器打取病原菌菌餅。
[0099]按照如下方法測定多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) CSMl 101對(duì)每種病原菌的抑菌率:實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)病原菌設(shè)兩個(gè)處理，即CSM1101組和對(duì)照組。將20個(gè)無菌PDA平板均分為兩組，即CSM l 101組和對(duì)照組，每組10個(gè)平板，進(jìn)行以下接種處理:在CSM1101組的無菌PDA平板中心接種直徑為6mm的病原菌菌餅，將多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM1101CGMCC N0.8527斜面活化菌種接種于距病原菌菌餅3cm處。同時(shí)，在對(duì)照組的無菌PDA平板中心只接種直徑為6_的病原菌菌餅。將經(jīng)過上述接種處理的CSM1101組平板和對(duì)照組平板在30°C培養(yǎng)5-7天，待對(duì)照組平板(僅接種病原菌)長滿整個(gè)培養(yǎng)皿時(shí)，測量對(duì)照組的病原菌菌落直徑和CSM1101組的病原菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率。
[0100]抑菌率(％)=(對(duì)照組的病原菌菌落直徑-CSM1101組的病原菌菌落直徑)/對(duì)照組的病原菌菌落直徑X100。
[0101]結(jié)果如表1所示，表明多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSMllOlCGMCCN0.8527 對(duì)牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae) ACCC36053、牡丹枝孢霉(Cladosporiumpaeoniae ) ACCC36063 和茍藥雜色尾抱霉菌(Cercospora varricolorWinter)均具有較強(qiáng)的平板抑菌活性，其抑菌率分別達(dá)到了 57.2%,65.7%和88.3%。
[0102]表1 多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa) CSMl 101CGMCC N0.8527 對(duì)病原
[0103]菌的抑菌率
[0104]

【權(quán)利要求】
1.制備促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑的方法，包括: (1)將玉米秸桿在180-200°c和1.0-2.0Mpa條件下進(jìn)行水熱處理，得到經(jīng)過預(yù)處理的玉米稻桿； (2)將所述經(jīng)過預(yù)處理的玉米秸桿粉碎后，用纖維素酶進(jìn)行酶解，分別收集酶解液和酶解殘?jiān)? (3)用所述酶解液、(NH4)2S04、MgS04、CaC03、玉米漿和水配制發(fā)酵培養(yǎng)基，每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中所述酶解液的含量滿足每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量為20-50g ； (4)向所述發(fā)酵培養(yǎng)基中接入促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的細(xì)菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后收集發(fā)酵液，將所述發(fā)酵液和所述酶解殘?jiān)旌?，得到促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述水熱處理時(shí)間為10-20min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述(2)為將所述經(jīng)過預(yù)處理的玉米秸桿粉碎后，按以干重計(jì)每克秸桿加入10-15FPU的比例加入纖維素酶，在55-80°C、pH為4.8-5.0的條件下在水中酶解24-48h，得到玉米秸桿酶解物，將所述玉米秸桿酶解物進(jìn)行離心，分別收集上清液和沉淀，所述上清液即為所述酶解液，所述沉淀即為所述酶解殘?jiān)?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于:每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，(NH4)2SO4的含量為10g，MgS04的含量為0.4g、CaC03的含量為6g、玉米漿的含量為2g ;和/或，所述發(fā)酵液和 所述酶解殘?jiān)凑?:1的質(zhì)量比進(jìn)行混合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的細(xì)菌為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) CSM1101，其在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為CGMCC N0.8527。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述(4)在30°C培養(yǎng)18-30小時(shí)進(jìn)行發(fā)酵。
7.由權(quán)利要求1-6中任一所述的方法制備的促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑。
8.權(quán)利要求7所述的促進(jìn)牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑的用途，所述用途為下述CD-C3)中任一種: Cl)促進(jìn)牡丹生長和拮抗病原菌； C2)所述促進(jìn)牡丹生長； C3)所述拮抗病原菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于:所述促進(jìn)牡丹生長體現(xiàn)為下述BI)-B7)中的任一種: BI)縮短牡丹種子生根時(shí)間； B2)提高牡丹種子生根率； B3)縮短牡丹種子的發(fā)芽時(shí)間； B4)提高牡丹種子的發(fā)芽率； B5)提高牡丹的主根長度； B6)提高牡丹苗高； B7)提高牡丹幼苗生物量； 所述拮抗病原菌為拮抗牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉(Cladosporium paeoniae)和巧藥雜色尾抱霉菌(Cercospora varricolor Winter)中的三種、任兩種或任一種。
10.促進(jìn)牡丹生長的方法，包括在生根前將浸種后的牡丹種子用權(quán)利要求7所述的促進(jìn)牡丹生長并拮抗 病原菌的菌劑處理1-3小時(shí)再進(jìn)行生根培養(yǎng)的步驟。
【文檔編號(hào)】A01P21/00GK104068063SQ201410116401
【公開日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月26日
【發(fā)明者】韓繼剛, 王云山, 蔣克謙, 王永強(qiáng) 申請(qǐng)人:上海禾頤農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司