一種清除大型經濟海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于海藻生物【技術領域】，涉及一種清除大型經濟海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法。利用海洋中下水層底棲性的水蚤，將污染雜藻的大型海藻生活史微觀階段與水蚤相混合，利用水蚤的自然攝食行為去除污染雜藻。采用本發(fā)明能高效、徹底清除各種經濟海藻生活史微觀階段的污染雜藻，同時對經濟海藻安全無害。
【專利說明】一種清除大型經濟海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于海藻生物【技術領域】，涉及一種清除大型經濟海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法。
【背景技術】
[0002]大型海藻主要包括褐藻(brown seaweed)、紅藻(red seaweed)和綠藻(greenseaweed)。其中許多經濟種類是人工栽培的對象,例如褐藻類的海帶(Saccharina spp.)、裙帶菜(Undaria pinnatifida)、羊棲菜(Sargassum fusiforme),紅藻類的紫菜(Pyropiaspp.)、紅毛菜(Bangia spp.)、江蘺(Gracilaria spp.)、石花菜(Gelidium spp.)、麒麟菜(Eucheuma spp.),以及綠藻類的將苔與石藥(Ulva spp.)。
[0003]通過人工栽培獲得的海藻產品既可以提供健康食品(如紫菜、紅毛菜、海帶、裙帶菜、滸苔)、也可用于碘、甘露醇、藻膠等重要化工原料(如海帶、江蘺、石花菜、麒麟菜)、以及海洋藥物(如羊棲菜、紅毛菜)與蛋白試劑(如紫菜)的提取原料，具有很高的經濟價值。另外，栽培海藻在新能源(如發(fā)酵產乙醇、甲烷)、新材料(如海藻多糖紡織纖維)領域也具有突出的應用潛力。
[0004]大型經濟海藻的自然生活史除了宏觀階段(即常見的葉狀、管狀、分枝狀、膜狀、片狀藻體)，通常還存在微觀階段(例如海帶、裙帶菜、紫菜的單列細胞絲狀體)。除了自然發(fā)育過程，微觀階段還包括在實驗室培養(yǎng)或人工誘導條件下產生的特殊過程(例如石莼、滸苔的絲狀體)，以及可長期保存并維持的幼苗期(例如石莼、滸苔的幼苗)。 [0005]與陸地植物不同，大型海藻的生活史微觀階段可以獨立生活，既可以長期保存，又易于擴繁增殖形成遺傳均一的純系，由此成為種質保存與種質擴繁的主要對象；同時，通過發(fā)育調控還可進入宏觀生活史階段，體現(xiàn)植物細胞發(fā)育的全能性，因此，也常作為遺傳選育(如純系雜交)、基因工程等多種海藻生物技術操作的受體材料；尤為重要的是，微觀階段還是部分經濟海藻人工栽培過程的重要環(huán)節(jié)(例如紫菜貝殼絲狀體培育階段)。可以說，生活史微觀階段是大型經濟海藻栽培生產與科研操作的重要對象。
[0006]但是，由于生活史微觀階段的藻體十分微小，在保存和培養(yǎng)過程中極易受到絲狀或單細胞藍藻、硅藻等微藻的污染，對后續(xù)試驗或生產造成干擾。由于微藻在營養(yǎng)吸收與增殖速率等方面具有明顯優(yōu)勢，若不及時清除，往往會將目標藻完全包裹并導致死亡，對生產或科研造成嚴重影響。
[0007]現(xiàn)有解決方法包括:1)通過顯微操作對目標藻進行重新分離，這高度依賴相關設備和操作經驗，還需花費時間將目標藻從單一個體開始重新增殖；2)使用化學試劑選擇性控制雜藻生長，例如利用二氧化鍺通過干擾硅代謝抑制硅藻，但是，雜藻自身或通過孢子會產生耐受，因此往往只具有抑制效果，很難完全清除，另外，化學試劑也會對目標藻產生抑制和傷害；3)直接丟棄。因此，控制雜藻污染，需要發(fā)展新的思路和方法。

【發(fā)明內容】
[0008]針對上述在科研和生產過程中出現(xiàn)的突出問題，本發(fā)明的目的是提供一種清除大型經濟海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法。
[0009]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明技術方案如下:
[0010]一種清除大型經濟海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法，利用海洋中下水層底棲性的水蚤，將污染雜藻的大型海藻生活史微觀階段與水蚤相混合，利用水蚤的自然攝食行為去除污染雜藻。
[0011]進一步的說，以海洋中下水層底棲性水蚤，通過飼喂淡水單細胞綠藻維持生長并使其增殖；將污染雜藻的大型海藻生活史微觀階段與水蚤相混合，利用水蚤的自然攝食行為去除污染雜藻。
[0012]所述將污染雜藻的大型海藻生活史微觀階段與與水蚤按20-30只/cm2藻體相混合，進行利用水蚤的自然攝食行為去除污染雜藻。其中，水蚤投放少些僅是清除的慢些而已。
[0013]待完全清除雜藻后再將海藻材料與水蚤分離。
[0014]所述海洋中下水層底棲性水蚤為日本虎斑猛水蚤(Tigriopus japonicus)。
[0015]所述大型經濟海藻生活史微觀階段為綠藻石莼、滸苔的幼苗以及絲狀體，褐藻裙帶菜、海帶的絲狀配子體， 紅藻紫菜或紅毛菜的絲狀孢子體。
[0016]所述雜藻為單細胞藍藻、絲狀藍藻與硅藻。
[0017]所述淡水單細胞綠藻為雨生紅球藻、小球藻。
[0018]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提出了一種新思路，具有如下有益效果:
[0019]1.本發(fā)明技術不依賴任何設備與試劑。使用海洋中下層底棲性的水蚤，潮間帶均有分布，分布廣泛、易于分離獲得，容易經高效增殖獲得生物量。
[0020]2.本發(fā)明的雜藻清除方法非常高效，一般只需處理30分鐘，而現(xiàn)有顯微分離方法高度依賴相關設備和操作經驗，還需花費很長時間將目標藻從單一個體開始重新增殖。而化學處理法一般需連續(xù)處理幾天到一周時間。
[0021]3.本發(fā)明對目標藻完全無害，非常安全。較化學處理等常用現(xiàn)有技術，依賴水蚤對雜藻的攝食行為進行清除，對目標藻不產生任何影響，而化學處理法往往會嚴重抑制目標藻的生長。
[0022]4.本發(fā)明可對絲狀藍藻、硅藻等污染雜藻進行徹底清除。而化學處理等現(xiàn)有技術往往只能抑制雜藻生長，雜藻自身或通過孢子會產生耐受，很難完全清除。
[0023]5.本發(fā)明技術適用的海藻材料非常廣泛，清除雜藻方法具有很高的通用性。使用的水蚤口器尺寸大于一般常見的絲狀藍藻直徑和單細胞藍藻、硅藻，小于褐藻、綠藻、紅藻等常見海藻微觀階段的尺寸，因此，會選擇性清除污染雜藻。
[0024]6.本發(fā)明為了避免海洋微藻飼喂的水蚤取用時對目標藻產生二次污染，使用淡水來源的微藻(例如雨生紅球藻)對水蚤進行飼喂，可完全保證水蚤的正常取食和生長，即使取用時淡水藻污染了目標藻，在海水培養(yǎng)液中也不會存活。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為本發(fā)明實施例提供的水蚤電鏡形態(tài)學特征，其中(左.完整個體；右.口器)。[0026]圖2為本發(fā)明實施例提供的水蚤光學顯微鏡形態(tài)學特征，其中箭頭示卵囊。
[0027]圖3為本發(fā)明實施例提供的基于COl基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，其中Sample為本發(fā)明分離的水蚤。
[0028]圖4為本發(fā)明實施例提供的水蚤攝食淡水單細胞綠藻，其中，左.攝食前；右.攝食后，示消化道內紅色，右下角為投喂的雨生紅球藻，標尺:50 μ m。
[0029]圖5為本發(fā)明實施例提供的水蚤完全去除滸苔幼苗污染的絲狀藍藻，其中，自左至右示同一個體的去除過程，箭頭示雜藻集中分布位置。
[0030]圖6為本發(fā)明實施例提供的水蚤完全去除石莼幼苗污染的硅藻，其中，上下行分別為兩個個體，自左至右示去除過程，箭頭示雜藻集中分布位置。
【具體實施方式】
[0031]下面結合實施例對本發(fā)明的方法及該方法所達到的效果作進一步詳細說明。
[0032]實施例1:水蚤的分離培養(yǎng)以及形態(tài)與分子鑒定
[0033]1.蚤種分離培養(yǎng)
[0034]從青島海域潮間帶采集下層底棲性水蚤，用消毒海水進行沖洗并分離兩個配對個體，通過飼喂底棲硅藻維持生長并增殖群體。 [0035]2.形態(tài)觀察
[0036]挑取典型完整個體，利用掃描電鏡和光學顯微鏡觀察形態(tài)特征并成像，電鏡可見水蚤的口器直徑約為10 μ m,大于常見的絲狀藍藻直徑、以及單細胞藍藻與硅藻，同時小于常見大型經濟海藻微觀階段的細胞尺寸。光鏡可見雌性個體形成卵囊，內含大量卵，有很高的繁殖速率(見圖1、圖2)。
[0037]3.分子鑒定
[0038]為了避免外源生物的污染，提取基因組總DNA前使用Tris-EDTA-NaCl緩沖液反復沖洗樣本。參照產品說明書，使用微量組織樣品試劑盒(Qiagen)，取整只個體提取DNA。針對甲殼類設計PCR通用引物(正向引物crcoxf:5 ’ -GGTCCTGTAATCATAAAGAYATYGG-3 ’，反向引物 crcoxrl:5，-GCGACTACATAATAAGTRTCRTG-3，與 crcoxr2:5，-TCTATCCCAACTGTAAATATRT-GRTG-3’ )擴增線粒體編碼的COl基因片段。反應采用50 μ I體系，反應條件如下:940C 5min;36 個循環(huán)(94°C lmin, 46°C 30s, 72°C 1.5min) ;72°C IOmin0 擴增產物經電泳驗證后使用凝膠回收試劑盒進行純化(Omega)。純化產物送測序公司雙向測序(參見SEQ IDN0.1)。
[0039]選擇相關參考序列，將水蚤線粒體COl基因片段利用NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)測得樣本序列與日本虎斑猛水蚤Tigriopus japonicus線粒體COl基因序列高度同源,與該種參考序列(NCBI Acc N0.JN129180.1)相似度為98%，由此確定分離的水蚤樣本為節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、燒足亞綱(Copepoda)、猛水蚤目(Harpacticoida)、虎斑猛水蚤屬(Tigriopus)的日本虎斑猛水蚤(Tigriopus japonicus)(見圖3)。
[0040]SEQ ID N0.1為水蚤COl部分基因序列，
[0041]TAAAGATATTGGAACTTTGTATTTAATTGCTGGCGCATGAGCGGGTTTTGTAGGAGCCGCTATAAGTGTTTTAATCCGCCTGGAGTTAGGGCAGTGTGGGAGGTTTTTAGGTAATGATCAGCTTTATAATGTTCTTGTAACTGCTCATGCTTTCGTAATGATTTTTTTTATGGTTATACCTGTTTTAATTGGAGGATTTGGTAATTGACTTGTACCCCTGATGCTGGGAGCCCCAGATATGGCTTTTCCACGTCTTAATAATYTAAGATTTTGGTTTTTGATTCCAGCTTTATTAATGTT
ATTGTTAAGGAGGGCTGTAGAAGCAGGGGCTGGAACCGGGTGAACTGTGTATCCCCCATTAAGAGCTGTTGGTCATG
CGGGAAGTTCGGTTGATTTTGCTATCTTCTCACTTCATTTGGCGGGTGTTTCTTCATTGCTGGGGGCTGTGAATTTT
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ATTCTTGTTTTTATGATGTGAGGGGTGGGGGAGATCCTATTCTTTACCAACACTTATTTTGATTTTTTGGGCATCCC
GAAGTTTACATTTTAATTCTCCCAGGGTTTGGATTAATTTCGCATATTATTTCtCAAGAAACCTCTAAAAAAGAAGT
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TTTACTGTGGGTCTGGACACGGACACTCGTGCCTATTTTACTTCTGCAACTATAATTATTGCTGTTCCCACTGGTAT
CAAAATTTTCAGGTGGGTAGGCACTTTGTACGGTAGTAAACCTAGATATAGGGCTTCTTTTAGCTGGGCCCTGGGCT
TTATTTTCCTGTTTACTTTAGGAGGGTTGACGGGTATTATTTATCCA
[0042]4.淡水 單胞藻飼喂
[0043]為了避免海洋微藻飼喂的水蚤取用時對目標藻產生二次污染，改用淡水單胞藻(雨生紅球藻)對水蚤進行飼喂，光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)水蚤對淡水單胞藻可正常取食(見圖4)。
[0044]實施例2:用水蚤清除污染滸苔幼苗的絲狀藍藻
[0045]滸苔幼苗可用于保存種質，絲狀藍藻是常見的污染生物，非常容易與苗體發(fā)生嚴重的纏繞并最終完全包裹，因完全抑制光合作用并競爭營養(yǎng)導致保存的幼苗種質死亡。
[0046]取處于長期休眠狀態(tài)并于假根部嚴重污染絲狀藍藻的幼苗，與適量水蚤(約20只)在培養(yǎng)皿中混合，處理約半小時。整個過程每隔IOmin進行鏡檢拍照(見圖5)。圖中可見，絲狀藍藻與假根發(fā)生嚴重纏繞，但水蚤對藍藻的清除非常徹底而高效。
[0047]實施例3:用水蚤清除污染石莼幼苗的硅藻
[0048]石莼幼苗可用于保存種質，硅藻是常見的污染生物，非常容易與苗體發(fā)生粘附，嚴重的會完全包裹，因完全抑制光合作用并競爭營養(yǎng)導致保存的幼苗種質死亡。
[0049]取處于長期休眠狀態(tài)并嚴重污染硅藻的石莼幼苗，與適量水蚤(約20只)在培養(yǎng)皿中混合，處理約半小時。整個過程每隔IOmin進行鏡檢拍照(見圖6)。圖中可見，單細胞硅藻與幼苗藻體發(fā)生嚴重粘附，但水蚤對硅藻的清除非常徹底而高效。
[0050]實施例4:用水蚤清除污染裙帶菜絲狀配子體的硅藻
[0051]裙帶菜絲狀配子體可用于保存種質與遺傳操作，以及生產上制備克隆苗，硅藻是常見的污染生物，非常容易與苗體發(fā)生粘附，現(xiàn)有技術常使用二氧化鍺抑制硅藻，但同樣會對裙帶菜配子體造成負面影響。
[0052]取嚴重污染硅藻的裙帶菜絲狀配子體，與適量水蚤(約20只)在培養(yǎng)皿中混合，處理約半小時，水蚤對硅藻的清除非常徹底而高效。
【權利要求】
1.一種清除大型經濟海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法，其特征在于:利用海洋中下水層底棲性的水蚤，將污染雜藻的大型海藻生活史微觀階段與水蚤相混合，利用水蚤的自然攝食行為去除污染雜藻。
2.按權利要求1所述的清除大型經濟海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法，其特征在于:以海洋中下水層底棲性水蚤，通過飼喂淡水單細胞綠藻維持生長并使其增殖；將污染雜藻的大型海藻生活史微觀階段與水蚤相混合，利用水蚤的自然攝食行為去除污染雜藻。
3.按權利要求1或2所述的清除大型經濟海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法，其特征在于:待完全清除雜藻后再將海藻材料與水蚤分離。
4.按權利要求1或2所述的清除大型經濟海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法，其特征在于:所述海洋中下水層底棲性水蚤為日本虎斑猛水蚤(Tigriopus japonicus)。
5.按權利要求1或2所述的清除大型經濟海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法，其特征在于:所述大型經濟海藻生活史微觀階段為綠藻石莼、滸苔的幼苗以及絲狀體，褐藻裙帶菜、海帶的絲狀配子體，紅藻紫菜或紅毛菜的絲狀孢子體。
6.按權利要求1或2所述的清除大型經濟海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法，其特征在于:所述雜藻為單細胞藍藻、絲狀藍藻與硅藻。
7.按權利要求1或2所述的清除大型經濟海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法，其特征在于:所述淡水單細 胞綠藻為雨生紅球藻、小球藻。
【文檔編號】A01G33/00GK103999763SQ201410157855
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年4月18日 優(yōu)先權日:2014年4月18日
【發(fā)明者】姜鵬, 吳春輝, 張光濤, 陳華新, 李富超, 趙瑾 申請人:中國科學院海洋研究所