快速獲得羅漢果三倍體的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速獲得羅漢果三倍體的方法，該法采用誘導(dǎo)效率高、毒性小的新型染色體加倍劑Oryzalin，依據(jù)雌花大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的花部特征，浸泡處理減數(shù)分裂時(shí)期的雌花，抑制減數(shù)分裂中染色體正常分離，誘導(dǎo)未減數(shù)雌配子產(chǎn)生，待處理雌花開花，用二倍體雄株花粉進(jìn)行授粉，獲得三倍體后代。本發(fā)明有效解決了羅漢果常規(guī)三倍體培育方法培育時(shí)間長，以及人工誘導(dǎo)未減數(shù)雄配子途徑培育羅漢果三倍體中需篩選分離未減數(shù)配子等技術(shù)問題，成功實(shí)現(xiàn)在1個(gè)生長周期內(nèi)操作簡便地培育獲得三倍體，為創(chuàng)制豐富的羅漢果三倍體新種質(zhì)及培育三倍體無籽新品種提供了技術(shù)支持。
【專利說明】快速獲得羅漢果三倍體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物遺傳育種領(lǐng)域，具體是培育植物三倍體的技術(shù)，尤其涉及一種快速獲得羅漢果三倍體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]三倍體(triploid)是指體細(xì)胞具有3個(gè)染色體組的植物，是多倍體中的一種類型。三倍體不僅具有多倍體的巨大特性，還具有不孕性，可用于優(yōu)良無籽植物的培育。目前，采用四倍體人工誘導(dǎo)，四倍體與二倍體雜交的途徑，已培育出三倍體無籽西瓜(Citrulluslanatus)(李建吾，馬長生，孫中偉，張潔.無籽西瓜新品種’豫藝菠蘿蜜’.園藝學(xué)報(bào)，2005, 32，(2):374)、無籽枸杞(Lycium barbarum)(李健，王錦秀，王立英，黃占明.無籽枸杞新品種選育研究.西北植物學(xué)報(bào)，2001，21 (3):446-450)等植物新品種。
[0003]通過誘導(dǎo)二倍體植株未減數(shù)配子產(chǎn)生(具孢子體染色體數(shù)目的配子)，并與二倍體植株(染色體數(shù)目減半的正常配子)雜交可快速獲得三倍體，該方法和上述方法(首先獲得四倍體，然后與二倍體植株雜交獲得三倍體)相比，可在I個(gè)植物生長周期獲得三倍體，顯著縮短三倍體培育時(shí)間。未減數(shù)配子(unreduced gamete),是指具有孢子體染色體數(shù)目的配子，包括未減數(shù)雄配子(unreduced male gamete)和未減數(shù)雌配子(unreduedfemale gamete)。通過未減數(shù)雄配子途徑，已在楊樹(Populus spp.)(李風(fēng)蘭，張志毅，張民俠.白楊染色體加倍技術(shù)研究及三倍體育種(III)-加倍體某些形態(tài)特征的觀察.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，16(2): 15-18)、桑樹(Morus alba)(楊今后，楊新華.桑樹雄性配子人工二倍化培育優(yōu)良三倍體的研究.蠶業(yè)科學(xué)，2001, 27(3): 177-180)、文旦柚(Citrusgrandis)(楊曉玲，程舟，李珊，北島宣，長谷川耕二郎.秋水仙素誘導(dǎo)文旦柚2n配子獲得自交三倍體.園藝學(xué)報(bào)，2006，33(5):1045-1047)等植物中獲得三倍體。通過未減數(shù)雌配子途徑，已獲得百合(Lilium Oriental) (WU H Z，ZHENG S X，HE Y Q1YAN G J, BI Y F，ZHUY Y.Diploid female gametes induced by colchicine in Oriental lilies.ScientiaHorticulturae, 2007, 114:50-53),楊樹(Populus spp.)(李云，朱之悌，田硯亭，張志毅，康向陽.2001.秋水仙堿處理白楊雌花芽培育三倍體植株的研究.林業(yè)科學(xué)，37 (5):68-74)等植物三倍體。未減數(shù)雌配子與未減數(shù)雄配子相比較，受精過程中未減數(shù)雌配子與正常配子不存在競爭受精問題，未減數(shù)雌配子可100%形成三倍體，具有三倍體創(chuàng)制效率高、遺傳變異豐富等特點(diǎn)，是未減數(shù)配子利用的新趨勢。
[0004]羅漢果(Siraitia grosvenorii)三倍體選育中，蔣水元等采用秋水仙素處理離體組培苗， 誘導(dǎo)獲得四倍體，所獲四倍體雌株大田栽培至花期，與二倍體雄株雜交，獲取三倍體種子；通過變溫或秋水仙素處理，誘導(dǎo)未減數(shù)雄配子(二倍體大花粉)產(chǎn)生，篩選分離獲得大花粉，再采用大花粉授粉二倍體雌株，獲得三倍體(蔣水元，蔣向軍，覃吉?jiǎng)伲S夕洋，劉鳳英.無籽羅漢果選育的初步研究.廣西植物，2009, 29 (4): 506-509)。上述兩種羅漢果三倍體的培育方法中，采用的染色體加倍劑秋水仙素，毒性大，對植物損傷較大，易產(chǎn)生染色體結(jié)構(gòu)變異；在離體條件誘導(dǎo)染色體加倍，再經(jīng)過四倍體大田栽培，與二倍體雜交獲得三倍體，培育時(shí)間較長；組培苗染色體加倍處理后，普遍存在嵌合體，需要多代鑒定和倍性純化，才能獲得倍性純合的四倍體，工作量較大；需具備組織培養(yǎng)設(shè)施條件。未減數(shù)雄配子誘導(dǎo)，需要篩選分離獲得未減數(shù)雄配子(二倍體大花粉)，再進(jìn)行授粉雜交，排除正常配子(正?；ǚ?與未減數(shù)雄配子的競爭受精，操作程序較繁瑣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種操作程序簡便、高效、安全的快速獲得羅漢果三倍體的方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用一些技術(shù)方案:快速獲得羅漢果三倍體的方法，采用Oryzalin浸泡處理減數(shù)分裂時(shí)期的羅漢果雌花，誘導(dǎo)未減數(shù)雌配子產(chǎn)生，然后用清水清洗解除，開花后采用二倍體雄株新鮮花粉進(jìn)行授粉，從后代中獲得三倍體植株。
[0007]Oryzalin浸泡處理使用30~90 μ M的Oryzalin水溶液。
[0008]Oryzalin浸泡處理時(shí)間為3~9h。
[0009]羅漢果雌花處于大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期。
[0010]羅漢果雌花子房的長度為7.0mm ( L<9.0mm。
[0011]開花后是經(jīng)處理的雌花開放的第I天。
[0012]授粉后收獲成熟果實(shí)，剝?nèi)」麑?shí)中的種子，進(jìn)行播種育苗，出苗后鑒定植株染色體倍性，從而獲得三倍體植株。
[0013]針對現(xiàn)有培育羅漢果三倍體存在工作量大、周期長、毒性大、收效差等問題，發(fā)明人建立了一種快速獲得羅漢果三倍體的方法。該法采用誘導(dǎo)效率高、毒性小的新型染色體加倍劑Oryzalin (氨磺靈)，依據(jù)雌花大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的花部特征(董志淵，馬小軍，周光雄.羅漢果大孢子發(fā)生及雌配子體發(fā)育與花部形態(tài)、胚珠變化的關(guān)系.熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2013, 21 (3):234-239)，采用Oryzalin浸泡處理減數(shù)分裂時(shí)期的雌花，抑制減數(shù)分裂中染色體正常分離，誘導(dǎo)未減數(shù)雌配子產(chǎn)生，待處理雌花開花，用二倍體雄株花粉進(jìn)行授粉，獲得三倍體后代。本發(fā)明有效解決了羅漢果常規(guī)三倍體培育方法(首先獲得四倍體，然后與二倍體植株雜交獲得三倍體)培育時(shí)間長(至少需要2個(gè)植物生長周期)，以及人工誘導(dǎo)未減數(shù)雄配子途徑培育羅漢果三倍體中需篩選分離未減數(shù)配子等技術(shù)問題，成功實(shí)現(xiàn)在I個(gè)生長周期內(nèi)操作簡便地培育獲得三倍體，為創(chuàng)制豐富的羅漢果三倍體新種質(zhì)及培育三倍體無籽新品種提供了技術(shù)支持。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是染色體計(jì)數(shù)顯微鏡圖，圖中:左為二倍體(對照)(2n = 2x = 28)，右為三倍體(2n = 3X = 42)。
[0015]圖2是DNA流式細(xì)胞分析圖，圖中:左為二倍體(對照)，右為三倍體(DNA含量增加0.5倍)。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下實(shí)施例中Oryzalin水溶液按照如下方法事先配制:首先采用少量DMSO(二甲基亞砜)溶解所需摩爾濃度的Oryzalin藥劑，然后將DMSO溶液滴加入蒸餾水中，滴加過程中不斷搖勻蒸餾水，保證無藥劑析出，DMSO用量為最終配制水溶液的I %。
[0017]實(shí)施例1
[0018]<1>田間選擇羅漢果品種類型“青皮果”的無病蟲害發(fā)生、生長健壯的雌株。
[0019]〈2>進(jìn)入現(xiàn)蕾期，選擇標(biāo)記雌株大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的雌花(子房的長度為7.0mm < L<9.0mm)。
[0020]〈3>將標(biāo)記雌花放入0.5mL的離心管中，加入30 μ M Oryzalin水溶液0.5mL,進(jìn)行浸泡處理3h。
[0021]<4>處理結(jié)束后,取出雌花,用清水清洗,去除Oryzalin。
[0022]<5>0ryzalin處理雌花開放的第I天，采用二倍體雄株新鮮花粉進(jìn)行人工授粉。
[0023]<6>待雌花膨大形成果實(shí)，且果實(shí)顏色由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色時(shí)，采摘果實(shí)。
[0024]〈7>剝?nèi)」麑?shí)中的種子，人工去除種殼，播種育苗，植株具2-4片真葉時(shí)，取根尖進(jìn)行染色體鑒定，具體方法如下:于晴天上午10-12點(diǎn)，取生長旺盛的根尖，放入0.002M的8-羥基喹啉溶液中預(yù)處理6h,轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液(無水酒精:冰醋酸=3:1)固定16h,蒸餾水清洗根尖3次后，加入lmol/L HC1，60°C水浴條件下水解8_10min，蒸餾水清洗根尖3次，卡寶品紅染液染色2min，壓片，顯微鏡下進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)(圖1)。染色體鑒定為三倍體的植株取幼嫩葉片放入培養(yǎng)皿里，加入1000 μ I WPS提取緩沖液；用刀片切碎葉片，30 μ m微孔濾膜過濾，加入PI染色液，染色lmin，PARTEC倍性分析儀上樣檢測(圖2)。
[0025]結(jié)果:30μΜ Oryzalin處理3h獲得的后代植株中，三倍體比率為2.57%，無嵌合體發(fā)生。
[0026]實(shí)施例2
[0027]<1>田間選擇羅漢果品種類型“青皮果”的無病蟲害發(fā)生、生長健壯的雌株。
[0028]〈2>進(jìn)入現(xiàn)蕾期，選擇標(biāo)記雌株大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的雌花(子房的長度為
7.0mm < L<9.0mm)。
[0029]〈3>將標(biāo)記雌花放入0.5mL的離心管中，加入60 μ M Oryzalin水溶液0.5mL,進(jìn)行浸泡處理9h。
[0030]<4>處理結(jié)束后,取出雌花,用清水清洗,去除Oryzalin。
[0031]<5>0ryzalin處理雌花開放的第I天，采用二倍體雄株新鮮花粉進(jìn)行人工授粉。
[0032]<6>待雌花膨大形成果實(shí)，且果實(shí)顏色由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色時(shí)，采摘果實(shí)。
[0033]〈7>剝?nèi)」麑?shí)中的種子，人工去除種殼，播種育苗，植株具2-4片真葉時(shí)，取根尖進(jìn)行染色體鑒定，具體方法如下:于晴天上午10-12點(diǎn)，取生長旺盛的根尖，放入0.002M的8-羥基喹啉溶液中預(yù)處理6h,轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液(無水酒精:冰醋酸=3:1)固定16h,蒸餾水清洗根尖3次后，加入lmol/L HC1，60°C水浴條件下水解8_10min，蒸餾水清洗根尖3次，卡寶品紅染液染色2min，壓片，顯微鏡下進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。染色體鑒定為三倍體的植株取幼嫩葉片放入培養(yǎng)皿里，加入1000 μ I WPS提取緩沖液；用刀片切碎葉片，30 μ m微孔濾膜過濾，加入PI染色液，染色lmin，PARTEC倍性分析儀上樣檢測。
[0034]結(jié)果:60μΜ Oryzalin處理9h獲得的后代植株中，三倍體比率為8.23%，無嵌合體發(fā)生。
[0035] 實(shí)施例3
[0036]<1>田間選擇羅漢果品種類型“青皮果”的無病蟲害發(fā)生、生長健壯的雌株。[0037]〈2>進(jìn)入現(xiàn)蕾期，選擇標(biāo)記雌株大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的雌花(子房的長度為
7.0mm < L<9.0mm)。
[0038]〈3>將標(biāo)記雌花放入0.5mL的離心管中，加入90 μ M Oryzalin水溶液0.5mL，進(jìn)行浸泡處理6h。
[0039]<4>處理結(jié)束后,取出雌花,用清水清洗,去除Oryzalin。
[0040]<5>0ryzalin處理雌花開放的第I天，采用二倍體雄株新鮮花粉進(jìn)行人工授粉。
[0041]〈6>待雌花膨大形成果實(shí)，且果實(shí)顏色由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色時(shí)，采摘果實(shí)。
[0042]〈7>剝?nèi)」麑?shí)中的種子，人工去除種殼，播種育苗，植株具2-4片真葉時(shí)，取根尖進(jìn)行染色體鑒定，具體方法如下:于晴天上午10-12點(diǎn)，取生長旺盛的根尖，放入0.002M的8-羥基喹啉溶液中預(yù)處理6h,轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液(無水酒精:冰醋酸=3:1)固定16h,蒸餾水清洗根尖3次后，加入lmol/L HC1，60°C水浴條件下水解8_10min，蒸餾水清洗根尖3次，卡寶品紅染液染色2min，壓片，顯微鏡下進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。染色體鑒定為三倍體的植株取幼嫩葉片放入培養(yǎng)皿里，加入1000 μ I WPS提取緩沖液；用刀片切碎葉片，30 μ m微孔濾膜過濾，加入PI染色液，染色lmin，PARTEC倍性分析儀上樣檢測。
[0043] 結(jié)果:90μΜ Oryzalin處理6h獲得的后代植株中，三倍體比率為12.59%，無嵌合
體發(fā)生。
【權(quán)利要求】
1.一種快速獲得羅漢果三倍體的方法，其特征在于:采用Oryzalin浸泡處理減數(shù)分裂時(shí)期的羅漢果雌花，誘導(dǎo)未減數(shù)雌配子產(chǎn)生，然后用清水清洗解除，開花后采用二倍體雄株新鮮花粉進(jìn)行授粉，從后代中獲得三倍體植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速獲得羅漢果三倍體的方法，其特征在于:所述Oryzalin浸泡處理使用30~90 μ M的Oryzalin水溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速獲得羅漢果三倍體的方法，其特征在于:所述Oryzalin浸泡處理時(shí)間為3~9h。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速獲得羅漢果三倍體的方法，其特征在于:所述羅漢果雌花處于大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的快速獲得羅漢果三倍體的方法，其特征在于:所述羅漢果雌花子房的長度為7.0mm ^ L〈9.0mm。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速獲得羅漢果三倍體的方法，其特征在于:所述開花后是經(jīng)處理的雌花開放的第I天。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的快速獲得羅漢果三倍體的方法，其特征在于:授粉后收獲成熟果實(shí)，剝?nèi)」麑?shí)中的種子，進(jìn)行播種育苗，出苗后鑒定植株染色體倍性，從而獲得三倍體植株。
【文檔編號】A01H1/08GK103931491SQ201410167680
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月24日
【發(fā)明者】董志淵, 馬小軍, 繆劍華, 白隆華, 潘麗梅, 馮世鑫, 莫長明 申請人:廣西壯族自治區(qū)藥用植物園