七葉一枝花種子繁殖的兩步育苗法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種七葉一枝花種子繁殖的兩步育苗法，該方法第一步對(duì)種子的進(jìn)行預(yù)處理，并使其在無菌條件下萌發(fā)，待萌發(fā)的種子胚根長(zhǎng)至2.5～3cm時(shí)剝?nèi)ヅ呷榧胺N皮；第二步在培養(yǎng)基上培養(yǎng)成無菌植株苗，這種方法5-6個(gè)月即能生成無菌苗，與現(xiàn)有的七葉一枝花的育苗技術(shù)相比較，實(shí)現(xiàn)了在保證萌發(fā)率較高的情況下大幅縮短萌發(fā)時(shí)間，5-6個(gè)月即可繁育出具有一片子葉的種苗，由于使用了培養(yǎng)基，種苗生長(zhǎng)發(fā)育良好，使用本發(fā)明方法通過在實(shí)驗(yàn)室獲得無菌苗，移栽至大田，出苗率可達(dá)70-75％。
【專利說明】七葉一枝花種子繁殖的兩步育苗法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種七葉一枝花種子繁殖的兩步育苗法，屬于植物種植【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]七葉一枝花(Paris polyphylla var.chinensis)又叫重樓、七葉蓮、蚤休等,最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》記載的是以藥用部位根狀莖之名“蚤休”，是百合科(Liliaceae)重樓屬(Paris)多年生草本植物的總稱(國(guó)家藥典委員會(huì)，2010)。
[0003]七葉一枝花的株高為30~100cm，葉片5~11枚，形狀為長(zhǎng)圓狀披針形、窄卵形，一朵黃綠色的花生長(zhǎng)于輪生葉片的莖頂；莖單一直立生長(zhǎng)，多呈白綠色和紫紅色，生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期一般為275~376天；褐色、具有斜向環(huán)節(jié)、橫生、肥大且常彎曲的根狀莖生長(zhǎng)于地下，直徑1.3~3cm，長(zhǎng)3~8cm，在其頂端有凹陷的莖殘基或芽痕，且有收縮根；花期一般在5~7月份；果期在8~10月份，果實(shí)為蒴果，蒴果裂開，種子為多數(shù)的紅色肉質(zhì)漿果，種子從繁殖到藥用需要5~10年，資源再生很慢。導(dǎo)致藥用野生七葉一枝花的資源瀕臨枯竭。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始廣泛關(guān)注七葉一枝花的引種栽培、不同外植體的組織培養(yǎng)和種子的快速萌發(fā)繁殖技術(shù)。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中研究七葉一枝花繁殖方式主要是有性繁殖和營(yíng)養(yǎng)繁殖。七葉一枝花種子具有“二次休眠”的特性，使其繁殖周期長(zhǎng)，技術(shù)的關(guān)鍵是打破種子休眠，促使種子快速萌發(fā)。目前采用較多是根莖的切塊繁殖，不僅消耗了藥用部分，而且易造成種質(zhì)資源退化，抗逆性降低。研究表明，高溫和低溫都能抑制七葉一枝花種子的萌發(fā)和胚根的生長(zhǎng)，在9°C的低溫，其發(fā)根率為O。研究七葉一枝花種子的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，成熟種子的胚分化不完全，種子具有“二次休眠”的生理特性，若單獨(dú)使用高溫和低溫，則對(duì)種子休眠的解除沒有效果，只有通過高溫和低溫的交替處理，才能打破種子的休眠，促進(jìn)種子的萌發(fā)和長(zhǎng)出幼苗。
[0005]對(duì)七葉一枝花種子的研究還發(fā)現(xiàn)，每年9~10月采摘成熟的開裂的七葉一枝花種子，去掉紅色的外種皮后把種子置于低溫4°C保存，結(jié)果I年內(nèi)，實(shí)驗(yàn)時(shí)種子可以隨時(shí)取用，這就給試驗(yàn)帶來很大的方便。但是，通過對(duì)新種子和舊種子萌發(fā)率的檢測(cè)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，新種子的萌發(fā)率比保存一年的舊種子高。種子在低溫條件儲(chǔ)存，雖然可能引起了細(xì)胞內(nèi)的某些生理生化的變化或打破了胚的生理平衡，從而可以增強(qiáng)種子的脫分化的能力，但是種子層積的時(shí)間過久，也可能細(xì)胞內(nèi)某些酶的生理結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而影響了種子的萌發(fā)率。
[0006]從上述分析中可以看出，目前七葉一枝花種子萌發(fā)繁殖技術(shù)存在下述不足:一是種子具有“二次休眠”特性，萌發(fā)繁殖時(shí)間較長(zhǎng)；二是萌發(fā)率不高；三是不適合大規(guī)模生產(chǎn)，雖然有些育苗法能實(shí)現(xiàn)縮短育苗時(shí)間，但卻存在出苗率低的問題。因此有必要研究開發(fā)更好的促使七葉一枝花種子快速萌發(fā)繁育的技術(shù)，既能實(shí)現(xiàn)快速繁育，又能保證高的出苗率。
[0007]技術(shù)方案
[0008] 為改進(jìn)現(xiàn)有的七葉一枝花種子萌發(fā)技術(shù)中，種子處理操作繁瑣、萌發(fā)時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種七葉一枝花種子繁殖的兩步育苗法，該方法采用兩步法萌發(fā)繁育七葉一枝花種苗，與現(xiàn)有的七葉一枝花的育苗技術(shù)相比較，實(shí)現(xiàn)了在保證萌發(fā)率較高的情況下大幅縮短萌發(fā)時(shí)間，一般5-6個(gè)月即可繁育出具有一片子葉的種苗，萌發(fā)率高達(dá)70~75 %，而且由于本發(fā)明使用了培養(yǎng)基，種苗生長(zhǎng)發(fā)育良好。
[0009]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所采用的技術(shù)方案是第一步對(duì)種子的進(jìn)行預(yù)處理，并使其在無菌條件下萌發(fā)；第二步待萌發(fā)的種子胚根長(zhǎng)至2.5~3cm時(shí)，剝離胚乳及種皮，然后在培養(yǎng)基上培養(yǎng)成無菌植株苗。
[0010]該方法的具體步驟如下:
[0011]第一步:預(yù)處理及萌發(fā)
[0012](I)對(duì)種子進(jìn)行預(yù)處理:將采摘的成熟的七葉一枝花種子去除穎殼，搓去紅色外種皮，剩下乳白色的種子，室溫條件下自然陰干7~14天；將種子裝入透氣袋內(nèi)，進(jìn)行高低溫交替變溫處理，即交替于O~4°C低溫環(huán)境放置η天，于18~22°C高溫環(huán)境放置η天，10≤η≤15，共持續(xù)60~90天；
[0013](2)浸種:將變溫處 理的種子先用ddH20于25~35°C浸泡24~48h，期間每隔5~6小時(shí)換水一次，再用200~400mg/L的GA3于18~22°C浸泡48~72h，將浸種后的種子用ddH20沖洗3~5次；
[0014](3)種子培養(yǎng):種子經(jīng)醫(yī)用酒精消毒30~45s、質(zhì)量百分比濃度0.1~0.15%HgCl2消毒10~15min,再轉(zhuǎn)移至雙層無菌濾紙上，暗培養(yǎng)30~60天，然后光培養(yǎng)15~30天，整個(gè)培養(yǎng)過程溫度控制在18°C~22°C，相對(duì)濕度70~80%，光照強(qiáng)度1000~llOOumol.m 2.s S光照時(shí)間每天10~12h ；
[0015]第二步:剝離胚乳及種皮后培養(yǎng)
[0016](4)剝離胚乳及種皮:挑選胚根長(zhǎng)度達(dá)到2.5~3cm的種子，用醫(yī)用酒精消毒30~45s，再用質(zhì)量百分比濃度0.1~0.15%的HgCl2消毒5~6min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)將胚乳及種皮完全剝離；
[0017](5)將剝離胚乳及種皮的種子先轉(zhuǎn)移至第一 1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng),該培養(yǎng)基配方包含:0.5mg/L6-BA、0.4mg/L NAA、0.lmg/LGA3 ;待呈卷曲狀子葉將展開時(shí)換至第二 1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，此培養(yǎng)基配方包含0.lmg/LGA3 ;整個(gè)培養(yǎng)過程溫度控制在18°C~22°C，相對(duì)濕度70%~80%，光照強(qiáng)度1000~IIOOumol.π2.s—1，光照時(shí)間10~12h，在兩種培養(yǎng)基上共培養(yǎng)45天~60天，便可得到發(fā)育成具有根莖葉的完整植株苗。
[0018]由上述技術(shù)方案可知本發(fā)明分兩步對(duì)七葉一枝花種子進(jìn)行繁殖育苗，即首先通過將采摘的種子進(jìn)行去除外種皮的預(yù)處理、高低溫交替進(jìn)行變溫處理，赤霉素溶液浸泡、濾紙無菌培養(yǎng)，然后剝?nèi)ヅ呷楹头N皮，再依次轉(zhuǎn)移至兩種不同的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行無菌培養(yǎng)，最終獲得具有一片子葉的無菌苗，整個(gè)過程只要5-6個(gè)月時(shí)間，而且出苗率可高達(dá)70~75%，在保證出苗率的前提下大大縮短了育苗時(shí)間。
【具體實(shí)施方式】
[0019]將采摘的七葉一枝花成熟的種子，去除穎殼，用手搓去紅色外種皮，并用細(xì)孔篩篩去外種皮，得到乳白色的種子，室溫條件下自然陰干7~14天，晾干水分，放在4°C冰箱備用。
[0020]將種子裝入透氣袋內(nèi)，進(jìn)行高低溫交替變溫處理，即先于O~4°C低溫環(huán)境放置15天，再于18~22°C高溫環(huán)境放置15天，兩種溫度狀況下交替各放置15天，持續(xù)45~60天；將變溫處理后的種子先用ddH20于30°C浸泡24~48h，期間每隔5~6小時(shí)換水一次，然后用200~400mg/L的GA3于18~22°C浸泡48~72h。浸種結(jié)束后，將浸種后的種子用ddH20沖洗3~5次。
[0021]用醫(yī)用酒精消毒浸種后的種子30~45s，再用質(zhì)量百分比濃度為0.1~0.15%HgCl2消毒10~15min,然后將種子轉(zhuǎn)移至雙層無菌濾紙上，暗培養(yǎng)30~60天，再光培養(yǎng)15~30天，整個(gè)培養(yǎng)過程溫度控制在18°C~22°C，相對(duì)濕度70~80%，光照強(qiáng)度1000umol.m-2.s'光照時(shí)間每天 12h。 [0022]挑選胚根長(zhǎng)度達(dá)到2.5~3cm的種子，用醫(yī)用酒精消毒30~45s，再用質(zhì)量百分比濃度0.1~0.15%的HgCl2消毒5~6min,在超凈工作臺(tái)內(nèi)將胚乳及種皮完全剝離。
[0023]將剝離胚乳及種皮的種子轉(zhuǎn)移至1/2MS (0.5mg/L6-BA, 0.4mg/L NAA, 0.lmg/LGA3)第一培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待子葉呈卷曲狀子葉將展開時(shí)換至1/2MS(0.lmg/LGA3)第二培養(yǎng)基上培養(yǎng)，約45天~60天便可發(fā)育成具有根莖葉的完整植株。整個(gè)培養(yǎng)過程溫度控制在18°C~22°C，相對(duì)濕度70%，光照強(qiáng)度1000umol.m_2.s_S光照時(shí)間12h。
[0024]通過實(shí)踐驗(yàn)證，采用本發(fā)明提供的這種萌發(fā)時(shí)間短、出苗率較高的七葉一枝花種子萌發(fā)繁育技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)成無菌苗后移栽到大田，出苗率可達(dá)70-75%，可以為七葉一枝花藥材的生產(chǎn)在育苗期節(jié)省I年半以上的時(shí)間，在生產(chǎn)實(shí)踐中具有重要的意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【權(quán)利要求】
1.一種七葉一枝花種子繁殖的兩步育苗法，其特征在于:第一步對(duì)種子的進(jìn)行預(yù)處理，并使其在無菌條件下萌發(fā)；第二步待萌發(fā)的種子胚根長(zhǎng)至2.5~3cm時(shí)，剝離胚乳及種皮，然后在培養(yǎng)基上培養(yǎng)成無菌植株苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的七葉一枝花種子繁殖的兩步育苗法，其特征在于具體采用如下步驟: 第一步:預(yù)處理及萌發(fā) (1)對(duì)種子進(jìn)行預(yù)處理:將采摘的成熟的七葉一枝花種子去除穎殼，搓去紅色外種皮，剩下乳白色的種子，室溫條件下自然陰干7~14天；將種子裝入透氣袋內(nèi)，進(jìn)行高低溫交替變溫處理，即交替于O~4°C低溫環(huán)境放置η天，于18~22°C高溫環(huán)境放置η天，.10≤η≤15，共持續(xù)60~90天； (2)浸種:將變溫處理的種子先用ddH20于25~35°C浸泡24~48h，期間每隔5~6小時(shí)換水一次，再用200~400mg/L的GA3于18~22°C浸泡48~72h，將浸種后的種子用ddH20沖洗3~5次； (3)種子培養(yǎng):種子經(jīng)醫(yī)用酒精消毒30~45s、質(zhì)量百分比濃度0.1~0.15% HgCljg毒10~15min,再轉(zhuǎn)移至雙層無菌濾紙上，暗培養(yǎng)30~60天，然后光培養(yǎng)15~30天,整個(gè)培養(yǎng)過程溫度控制在18°C~22°C，相對(duì)濕度70~80%，光照強(qiáng)度1000~llOOumol.m_2.s_\光照時(shí)間每天10~12h ； 第二步:剝離胚乳及種皮后培養(yǎng) (4)剝離胚乳及種皮:挑選胚根長(zhǎng)度達(dá)到2.5~3cm的種子，用醫(yī)用酒精消毒30~45s，再用質(zhì)量百分比濃 度0.1~0.15%的HgCl2消毒5~6min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)將胚乳及種皮完全剝離； (5)將剝離胚乳及種皮的種子先轉(zhuǎn)移至第一1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng),該培養(yǎng)基配方包含:.0.5mg/L6-BA、0.4mg/L NAA、0.lmg/LGA3 ;待呈卷曲狀子葉將展開時(shí)換至第二 1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，此培養(yǎng)基配方包含0.lmg/LGA3 ;整個(gè)培養(yǎng)過程溫度控制在18°C~22 °C，相對(duì)濕度.70%~80%，光照強(qiáng)度1000~IlOOumol.πm2.s'光照時(shí)間10~12h，在兩種培養(yǎng)基上共培養(yǎng)45天~60天，便可得到發(fā)育成具有根莖葉的完整植株苗。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103931502SQ201410176881
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月29日
【發(fā)明者】宋發(fā)軍, 劉學(xué)群, 王春臺(tái), 余曉東, 張鵬 申請(qǐng)人:中南民族大學(xué)