把大豆根瘤菌轉(zhuǎn)移到向日葵根系上進行生物固氮的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種在農(nóng)作物領(lǐng)域的培育技術(shù)，特別是利用超遠緣復(fù)式育種技術(shù)把大豆的根瘤菌轉(zhuǎn)移到向日葵根系上進行生物固氮的新方法，本發(fā)明通過向日葵與大豆的有性繁殖(雜交)，把大豆的固氮酶轉(zhuǎn)移到向日葵上，使向日葵根系結(jié)瘤，但是超遠緣關(guān)系的向日葵和大豆是不能雜交授粉的，必須首先進行無性繁殖(嫁接)，從而拉近彼此的親緣關(guān)系，才能使有性繁殖成為可能，這種復(fù)式育種技術(shù)的關(guān)鍵在于必須首先保證向日葵和大豆的嫁接成功，特別是要在其幼苗剛剛出土，還均未長出真葉前嫁接，只有這時的幼苗才相互交流最活躍，變異的可能性也最大。但是，剛出土的幼苗極其脆弱，植株嫩小，嫁接難度是很高的。
【專利說明】把大豆根瘤菌轉(zhuǎn)移到向日葵根系上進行生物固氮的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種在農(nóng)作物領(lǐng)域的培育技術(shù)，特別是利用超遠緣復(fù)式育種技術(shù)把大豆的根瘤菌轉(zhuǎn)移到向日葵根系上進行生物固氮的新方法，即通過向日葵與大豆的有性繁殖，把大豆的固氮酶轉(zhuǎn)移到向日葵上，從而使向日葵根系上能夠結(jié)瘤，但是超遠緣關(guān)系的向日葵和大豆是不能雜交授粉的，為了使向日葵和大豆能夠成功雜交，必須使向日葵和大豆首先進行無性繁殖，因為無性繁殖可以提高二者之間的親和力，這樣在提高二者親和力的基礎(chǔ)上，才能使有性繁殖雜交成功，這種復(fù)式育種技術(shù)的關(guān)鍵在于必須首先保證向日葵和大豆的嫁接成功。
【背景技術(shù)】
[0002]生物科學(xué)技術(shù)是當前最活躍的高新科技之一，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，取得了巨大的經(jīng)濟效益，具有廣闊的發(fā)展前景。而生物固氮工程則是生物科技的前沿領(lǐng)域，被列為國際農(nóng)業(yè)組織的重點課題。
[0003]空氣主要由氧氣和氮氣組成，氮氣約占空氣的80%。自然界中有一些生物能夠直接吸收空氣中的氮素作為養(yǎng)料，它們將分子態(tài)氮先還原成氨，再轉(zhuǎn)化為氨基酸和蛋白質(zhì)。這就是生物固氮。豆科植物的根部長有許多小球，它們是由根瘤菌共生形成的根瘤，就具有固氮作用，這些根瘤能直接吸收空氣中的氮氣，把它轉(zhuǎn)化為氮肥，供植物吸收使用。但是世界上大部分土壤都缺乏氮素養(yǎng)分，為了使農(nóng)作物高產(chǎn)，就需要施用大量氮肥?？墒侨斯ず铣傻胤柿?化肥)要料耗費大量的能源，不僅成本高，而且污染水源和空氣，破壞生態(tài)環(huán)境，危及人類健康，進口化肥也需要巨額資金，長期使用化肥還會破壞土地結(jié)構(gòu)，使土壤板結(jié)。而生物固氮則能克服上述 缺點，由前述可知，豆科植物的每一個根瘤都是一座小化肥廠，這些小化肥廠的原料來自空氣，取之不盡，這種小化肥廠不需設(shè)備，也不污染環(huán)境，能源則是用之不竭的太陽能。如果能讓其它非豆科作物也具有固氮能力，不再施用化肥，用生物固氮取而代之，其意義是非常重大的。目前國內(nèi)尚有一例“利用遠緣嫁接進行根瘤菌轉(zhuǎn)移的方法”申請?zhí)枮?01010046310.9(公開(公告)日:2010.06.23)的專利技術(shù)，該技術(shù)利用嫁接進行根瘤菌轉(zhuǎn)移的思路是正確的，但有兩點不足:一，砧木和接穗長到1-6片葉時嫁接為時已晚，雖然此時植株健壯，易于嫁接成活，但是此時植株屬性已基本定性，已過活潑期，已經(jīng)很難改變彼此的性狀。二，該技術(shù)只有嫁接，沒有雜交，本來嫁接的目的是為雜交創(chuàng)造條件的，因為只有雜交才能培育出新品種，嫁接是培育不出新品種的，嫁接只是手段而不是目的。
[0004]本發(fā)明則是克服了以上不足，經(jīng)過多年試驗，完成了利用超遠緣復(fù)式育種技術(shù)把大豆的根瘤菌轉(zhuǎn)移到向日葵根系上進行生物固氮的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單，成本低廉的超遠緣復(fù)式育種技術(shù)從而把大豆的根瘤菌轉(zhuǎn)移到向日葵根系上進行生物固氮的新方法。所謂超遠緣是指向日葵和大豆是兩種沒有任何親緣關(guān)系，其屬性相差很遠的兩種植物，向日葵是菊科，大豆是蝶形花科(國內(nèi)也稱豆科)，因?qū)傩韵嗖钐h，屬于綱間嫁接，故難以成活，國外至今尚無嫁接成活的先例。
[0006]本發(fā)明的第一步是無性繁殖(嫁接):首先保證向日葵和大豆的嫁接成活，嫁接時機必須是在砧木向日葵和接穗大豆都是幼苗剛剛出土，向日葵和大豆均未長出真葉，只有子葉之時，就要立即進行嫁接，因為這時幼苗的可塑性最強，其相互之間的交流最活躍，變異的可能性也最大。但是，由于剛出土的幼苗極其脆弱，植株嫩小，嫁接是非常困難的，本發(fā)明就是連續(xù)反復(fù)試驗多年，最終掌握了技術(shù)秘訣，才取得了嫁接的成功。第二步是有性繁殖(雜交):在向日葵和大豆嫁接成活后，其植株逐漸長大，直到砧木向日葵的頂端花盤開花，接穗大豆也進入花期，則及時收集大豆的花粉，將其撒到向日葵的花盤上，進行雜交授粉。當接穗大豆進入結(jié)莢到鼓粒期時，砧木向日葵根系上的根瘤也開始逐漸長大直到成熟。
[0007]本發(fā)明的機理是通過向日葵與大豆的有性繁殖(雜交)，把大豆的固氮酶轉(zhuǎn)移到向日葵上，從而使向日葵根系上能夠結(jié)瘤，但是超遠緣關(guān)系的向日葵和大豆是不能雜交受粉的，為了使向日葵和大豆能夠成功雜交，必須使向日葵和大豆首先進行嫁接，即無性繁殖，因為無性繁殖可以提高二者之間的親和力，拉近彼此的親緣關(guān)系，這樣，兩者從沒有關(guān)系到建立起親緣關(guān)系的基礎(chǔ)上，才能使有性繁殖成為可能，這種復(fù)式育種技術(shù)的關(guān)鍵在于必須首先保證向日葵和大豆的嫁接成功，也就是首先完成向日葵和大豆的無性繁殖，在此基礎(chǔ)上才能進行向日葵和大豆的有性繁殖。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0009]把純種大豆的種子和純種向日葵的種子播種到試驗田里，待向日葵和大豆幼苗剛剛出土，則以向日葵為砧木，大豆為接穗進行嫁接，嫁接成功后，等到接穗大豆開花時，將其花粉收集撒到砧木向日葵的花盤上，進行雜交授粉。這種通過首先無性繁殖然后再有性繁殖的復(fù)合培育技術(shù)即可選育出優(yōu)良的H)代雜種，在H)代向日葵的根系上就會長出根瘤。
[0010]本發(fā)明具有如下特點:
[0011]1，該超遠緣復(fù)式育種技術(shù)操作簡單，成本低廉，當年即可在向日葵的根系上長出根瘤。
[0012]2，該超遠緣復(fù)式育種技術(shù)屬于常規(guī)育種范疇的超遠緣嫁接和雜交技術(shù)，不存在轉(zhuǎn)基因育種在國際上發(fā)生的關(guān)于食品安全的爭議。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為砧木向日葵上嫁接的大豆接穗生長良好的早期植株。
[0014]圖2為嫁接的植株到了開花結(jié)實階段。
[0015]圖3為向日葵和大豆嫁接的愈合部特寫。
[0016]圖4為向日葵根系上長出的根瘤。
【具體實施方式】
[0017]下面對本發(fā)明做進一步的說明，其【具體實施方式】如下:
[0018] 1，播種:
[0019]選用外形飽滿，無瑕疵的純種大豆的種子和純種向日葵的種子(不可使用轉(zhuǎn)基因大豆和向日葵)，點播在試驗田里，試驗田以沙壤為宜，播深2-3厘米，大豆的播種方向隨機，向日葵的播種方向則必須是尖頭在下，大頭在上，虛土覆蓋。[0020]2，嫁接:
[0021]①嫁接前的準備:單面刀片、醫(yī)用酒精(75%)、無靜電塑料條(I厘米寬)、不銹鋼鑷子、竹針(粗細如縫衣針，長度I厘米)、無菌手套。嫁接時必須佩戴無菌手套，所有工具均要酒精消毒，尤其是竹針要提前消毒干燥后放入無菌袋中備用。
[0022]②嫁接的時機:向日葵和大豆的幼苗剛出土 2-3天，向日葵要子葉展開，尚未生長真葉時，大豆則要求子葉尚未展開時(形同黃豆芽)，則以向日葵為砧木，大豆為接穗進行嫁接，簡言之，必須在向日葵和大豆幼苗均未長出真葉前嫁接。
[0023]③嫁接的要領(lǐng):用刀片從向日葵的一對子葉中間垂直向下切開，切深10±1毫米，接穗大豆則把下部切成楔形長9± I毫米，幼苗切口部位必須預(yù)先用消毒酒精擦拭，兩者迅速插接在一起，再用竹針橫穿結(jié)合部固定，然后用塑料條包扎結(jié)合部防止水分蒸發(fā)。嫁接過程越快越好，整個過程不宜超過20秒鐘，以防氧化失敗。砧木和接穗要粗細一致，嫁接不得錯位，砧木和接穗的表皮必須對齊，至少要有一邊對齊，否則會造成營養(yǎng)不能交流而失敗。橫穿竹針的工序必不可少，其作用有二，一是防止嫁接后的排異現(xiàn)象使接穗從接口中被推出而脫落，二是促進生成愈傷組織，提高嫁接結(jié)合部的愈合能力。
[0024]④雜交的操作:嫁接成功的植株開始逐漸長大，早期生長的植株見圖1，在植株生長到砧木向日葵的頂端花盤開花時，見圖2，此時要及時收集大豆的花粉，將其撒到向日葵的花盤上，進行雜交授粉，向日葵的花盤開花時間較長，大約有一個星期，在此期間每天都要人工授粉，以使向日葵受精充分，防止癟粒發(fā)生。向日葵和大豆嫁接的愈合部特寫見圖3。向日葵的花盤成熟后，其果實就是Ftl代雜種，然后從中選出優(yōu)良雜種供F1代繼續(xù)培育使用。
[0025]⑤根瘤的形成: 在向日葵開花時，其根系上開始結(jié)瘤，當接穗大豆進入結(jié)莢到鼓粒期時，向日葵根系上的根瘤開始逐漸長大直到成熟，顏色也逐漸變深而成褐色。向日葵根系上的根瘤見圖4。當向日葵完全成熟后，其根瘤自行破裂，增加了土壤中的氮素。
【權(quán)利要求】
1.一種把大豆的根瘤菌轉(zhuǎn)移到向日葵根系上從而進行生物固氮的方法，其特征在于首先使向日葵和大豆進行無性繁殖，要求嫁接的時機是必須在向日葵和大豆的幼苗剛出土2-3天，向日葵要求子葉剛剛展開，尚未生長真葉時，大豆則要求子葉尚未展開時，以向日葵為砧木，大豆為接穗進行嫁接，簡言之，必須在向日葵和大豆幼苗均未長出真葉前進行嫁接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的把大豆的根瘤菌轉(zhuǎn)移到向日葵根系上從而進行生物固氮的方法，其特征在于嫁接時用刀片從砧木向日葵的一對子葉中間垂直向下切開，切深10±1毫米，接穗大豆則把下部切成楔形長9± I毫米，兩者迅速插接在一起，再用竹針橫穿結(jié)合部固定，然后用塑料條包扎結(jié)合部防止水分蒸發(fā)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的把大豆的根瘤菌轉(zhuǎn)移到向日葵根系上從而進行生物固氮的方法，其特征在于砧木和接穗要粗細一致，嫁接不得錯位，砧木和接穗的表皮必須對齊，至少要有一邊對齊，否則會造成營養(yǎng)不能交流而失敗，嫁接過程越快越好，整個過程不宜超過20秒鐘，以防氧化失敗。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的把大豆的根瘤菌轉(zhuǎn)移到向日葵根系上從而進行生物固氮的方法，其特征在于嫁接成活的植株生長到砧木向日葵的頂端花盤開花時，要及時收集大豆的花粉，將其撒到向日葵的花盤上，進行雜交授粉，向日葵的花盤開花時間較長，約一個星期，在此期間每天都要人工授粉，待Ftl代結(jié)實成熟后，從中選出優(yōu)良雜種供F1代繼續(xù)培育使用。
【文檔編號】A01G1/06GK103918488SQ201410181094
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月4日
【發(fā)明者】王孚望 申請人:王孚望