能抑制和殺滅多種耐藥性細(xì)菌的多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及殺滅和抑制細(xì)菌特別是多種耐藥性細(xì)菌的多肽，其用于殺滅或抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和/或大腸桿菌有顯著的效果。本發(fā)明還涉及包含所定義的多肽的組合物，涉及所定義的多肽和組合物在制備藥物中的用途，以及用于體外殺滅或抑制多種耐藥性細(xì)菌。
【專利說(shuō)明】能抑制和殺滅多種耐藥性細(xì)菌的多肽

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及新多肽，特別是殺滅和抑制細(xì)菌的新多肽，具體是一組能抑制和殺滅多種耐藥性細(xì)菌的新多肽。

【背景技術(shù)】
[0002]超級(jí)細(xì)菌，指由于濫用抗生素使得其抗藥性越來(lái)越強(qiáng)的細(xì)菌，其抗藥性強(qiáng)到現(xiàn)在的各種抗生素已經(jīng)對(duì)其沒(méi)有作用，所以給這類細(xì)菌統(tǒng)稱超級(jí)細(xì)菌。超級(jí)細(xì)菌還特指耐甲氧芐青霉素(甲氧西林)金黃色葡萄球菌(MRSA)，它是皮膚細(xì)菌的一種，由于一般抗生素很難殺死它，所以很難診治。超級(jí)病菌也是一種耐藥性細(xì)菌，這種超級(jí)病菌能在人身上造成濃瘡和毒皰，甚至逐漸讓人的肌肉壞死。更可怕的是，抗生素藥物對(duì)它不起作用，病人會(huì)因?yàn)楦腥径鹂膳碌难装Y，高燒、痙攣、昏迷直到最后死亡。這種病菌的可怕之處并不在于它對(duì)人的殺傷力，而是它對(duì)普通殺菌藥物——抗生素的抵抗能力，對(duì)這種病菌，人們幾乎無(wú)藥可用。2010年，英國(guó)媒體爆出:南亞發(fā)現(xiàn)新型超級(jí)病菌NDM-1，抗藥性極強(qiáng)可全球蔓延。
[0003]由于超級(jí)細(xì)菌和超級(jí)病菌的出現(xiàn)，人類面臨極大的威脅。因此，在現(xiàn)有抗生素?zé)o能為力的情況下，研發(fā)新型殺滅或者抑制抗耐藥性細(xì)菌的藥物，極為迫切。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供殺滅和抑制細(xì)菌的新多肽，特別是能抑制和殺滅多種耐藥性細(xì)菌的新多肽。
[0005]具體地，本發(fā)明涉及一組能抑制和殺滅多種耐藥性細(xì)菌如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia),鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)和/或大腸桿菌等的新多肽。
[0006]本發(fā)明的能抑制和殺滅耐藥性細(xì)菌的新多肽，其由XFP-10B、XFP-1U XHP-12B、XHP-14E或XHP-24B所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列組成:
XFP-10B: KRffFKIffKRR
XFP-11: WRffffKIffKRffR
XHP-12B: WVKRIKRFLRffL
XHP-14E: KRIVKRIKDFLRffL
XHP-24B: LLKELffTKIKRARKAVLRKIKRLL0
[0007]各序列中的字母為氨基酸的縮寫(xiě):
A-丙氨酸Ala
R-精氨酸Arg D-天冬氨酸Asp E-谷氨酸Glu 1-異亮氨酸Ile
L-亮氨酸LeuK-賴氨酸Lys F-苯丙氨酸Phe T-蘇氨酸Thr W-色氨酸Trp V-纈氨酸Val。
[0008]本發(fā)明所述的新多肽的生產(chǎn)方法，為固相合成-Boc法。這里用的是經(jīng)典的多肽固相合成法中的Boc法，其中氨基酸使用D-氨基酸，在化學(xué)修飾時(shí)使N端乙?；?，C端氨基化。Boc合成法是采用TFA (三氟乙酸)可脫除的Boc為α-氨基保護(hù)基，側(cè)鏈保護(hù)采用芐醇類。合成時(shí)將一個(gè)Boc —氨基酸衍生物共價(jià)交聯(lián)到樹(shù)脂上，用TFA脫除Boc，用三乙胺中和游離的氨基末端，然后通過(guò)Dcc活化、耦聯(lián)下一個(gè)氨基酸，最終脫保護(hù)多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法。從1963年Merrifield發(fā)展成功了固相多肽合成方法以來(lái)，經(jīng)過(guò)不斷的改進(jìn)和完善，到今天固相法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個(gè)常用技術(shù)。其基本原理是:先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價(jià)鍵的結(jié)構(gòu)同一個(gè)不溶性的高分子樹(shù)脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng)過(guò)脫去氨基保護(hù)基并同過(guò)量的活化羧基組分反應(yīng)，接長(zhǎng)肽鏈。重復(fù)(縮合一洗滌一去保護(hù)一中和及洗滌一下一輪縮合)操作，達(dá)到所要合成的肽鏈長(zhǎng)度，最后將肽鏈從樹(shù)脂上裂解下來(lái)，經(jīng)過(guò)純化等處理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC (叔丁氧羰基)保護(hù)的稱為BOC固相合成法。用Boc法已成功地合成了許多生物大分子，如活性酶、生長(zhǎng)因子、人工蛋白等。
[0009]具體包括:
一、樹(shù)脂合成
1)Peptide a cid Merrifield Resin and PAM Resin
2)Peptidecarboxamide MBHA Resin
二、肽鏈合成
1)氨基酸的偶聯(lián)；
2)N-端Boc基團(tuán)的切除；
在HF切割以前須將N-端Boc保護(hù)基團(tuán)用TFA除去。手工切割N-端Boc基團(tuán)方法是用TFA/DCM比為1:1的溶液在室溫條件下洗滌反應(yīng)15分鐘。
[0010]三、切割
I)切割前的樹(shù)脂準(zhǔn)備:所有樹(shù)脂在切割前必須完全的洗凈和干燥。
特殊情況處理:
A) His的Dnp保護(hù)基團(tuán)的切割:用最小體積的DMF溶脹樹(shù)脂；用20mol的苯硫酚處理1-2小時(shí)；將樹(shù)脂轉(zhuǎn)移到黏結(jié)玻璃漏斗中，在用HF液體或TFMSA處理前以DMF，甲醇和冷乙醚頻繁沖洗。
[0011]B)含Trp的多肽樹(shù)脂的脫甲酰基:以體積比為1: 10哌啶/DMF液放入圓底燒瓶中，并在冰浴中冷卻；加入多肽樹(shù)脂(lg/10ml)，在OOC下攪拌反應(yīng)2小時(shí)；用DMF (5倍體積)洗兩次，DCM兩次，MeOH兩次；用HF切割前高真空干燥上述所得樹(shù)脂至少4小時(shí)。
[0012]2) HF 切割
標(biāo)準(zhǔn)HF切割法(0.2mmol)
A)將多肽樹(shù)脂，聚四氟乙烯管和凈化劑混合物加入反應(yīng)容器中。含Cys的多肽用HF/苯甲醚/DMS/p-苯甲硫酚(10:1:1:0.2)，而不含Cys的用HF/DMS/苯甲醚(10:1:1)。
B)將蓋子旋緊，切割前在冰的純甲醇中冷卻至少5分鐘。
C)在參照生產(chǎn)商的說(shuō)明下蒸餾1ml的HF到瓶中。因?yàn)楹珹rg(Tos)的多肽切割會(huì)持續(xù)2小時(shí)以上。
D)反應(yīng)最后，通過(guò)氮?dú)饬髡舭l(fā)HF和DMS。
E)用TFA從樹(shù)脂上吸取出切除下的多肽。
F)負(fù)壓下過(guò)濾移走樹(shù)脂，用TFA洗樹(shù)脂兩次。過(guò)濾篩選，加入8-10倍的冷乙醚。有時(shí)需要蒸發(fā)大多數(shù)TFA以得到粗品的沉淀物。
3)切割后期處理:
A)沉淀,在真空下在Hirsch漏斗中用硬濾紙過(guò)濾沉淀的肽。用冷醚沖洗沉淀物，在合適的緩沖溶液中溶解太。然后凍干
B)離心，加入少量體積的叔丁甲醚在殘留物中做底，研磨，直到得到懸浮物，那懸浮物轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的離心管中，密閉離心，自動(dòng)離心機(jī)在這過(guò)程中是必須的，將醚從管中小心的倒出，用醚重復(fù)洗滌，溶解殘留物在合適的緩沖溶液里，后凍干
C)水溶性肽，沉淀后，加水到殘留物中，然后把混合物轉(zhuǎn)移到分離漏斗中，少量乙醇可能會(huì)用于助容。
D)充分搖晃堵塞的漏斗，分散堵塞物，靜止讓兩層分離，分離下層液(水)
E)加多量水到漏斗中，重復(fù)上述的搖晃一靜止一分離三次，移去上層液，然后放置于干凈的燒瓶中，將混合液移到分離漏斗中
F)加少量的新配二乙基醚，重復(fù)上述的搖晃一靜止一分離二到三次，每次都把醚層移去，把水層放到分離漏斗中，收集水層到干凈的燒瓶，凍干。
[0013]本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供包含前述所定義的多肽的組合物。
[0014]該組合物可以包含一種或者多種本發(fā)明前述所定義的多肽，以及為實(shí)現(xiàn)組合物的功能與作用而添加的非多肽的成分，例如為了實(shí)現(xiàn)促進(jìn)酶解的活性酶，或者是增加分散能力的表面活性劑。
[0015]該組合物，其還包含殺細(xì)菌劑。殺細(xì)菌劑可以是本領(lǐng)域所知的抗生素。
[0016]該組合物可包含合適的載體物質(zhì)和/或傳遞媒介，當(dāng)該組合物用作藥物時(shí)，該媒介可以將本發(fā)明的新型多肽傳送到希望的位點(diǎn)。
[0017]上述組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域的已知方法制備。
[0018]本發(fā)明的第三個(gè)方面是:
提供前述所定義的多肽以及上述的組合物在制備藥物中的用途，用于殺滅或抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia),鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)和 / 或大腸桿菌。
[0019]特別是在制備獸用或人用治療或預(yù)防藥物中的用途，用于殺滅或抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌，鮑曼不動(dòng)桿菌和/或大腸桿菌。
[0020]以及用于體外殺滅或抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和/或大腸桿菌方面的用途。
[0021]體外殺滅或抑制的方法是將本發(fā)明的前述所定義的多肽以及上述的組合物與所述的細(xì)菌接觸。
[0022]本發(fā)明的多肽以及組合物，在上述的用途應(yīng)用中的劑量和使用條件可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)確定。
[0023]經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，本發(fā)明的前述所定義的多肽用于殺滅或抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和/或大腸桿菌有顯著的效果。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1是多肽XFP-1l殺滅肺炎克雷伯菌的效果圖。
[0025]圖2是多肽XFP-10B殺滅鮑曼不動(dòng)桿菌(A)、肺炎克雷伯菌(B)和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(C)的效果圖。
[0026]圖3多肽XFP-12B殺滅鮑曼不動(dòng)桿菌㈧、肺炎克雷伯菌⑶和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(C)的效果圖。
[0027]圖4多肽XHP-14E殺滅鮑曼不動(dòng)桿菌(A)、肺炎克雷伯菌(B)和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(C)的效果圖。
[0028]圖5是多肽XHP-24B殺滅鮑曼不動(dòng)桿菌㈧、肺炎克雷伯菌⑶和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(C)的效果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0029]實(shí)施例1
最小抑菌濃度(MIC)評(píng)估，采用微量肉湯稀釋法。
[0030]A、抗菌藥物和培養(yǎng)基制備
抗菌藥物和培養(yǎng)基制備同常量肉湯稀釋法。
[0031]藥敏試驗(yàn)用抗菌藥物濃度范圍:根據(jù)NCCLS抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，藥物濃度范圍應(yīng)包含耐藥、中介和敏感分界點(diǎn)值。
[0032]培養(yǎng)基:NCCLS推薦使用Mueller-Hinton (MH)肉湯，pH7.2~?.4。需氧菌及兼性厭氧菌在此培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。接種物的制備，用接種環(huán)挑取形態(tài)相似待檢菌落:3~5個(gè)，接種于4~5πι1的水解酪蛋白(MH)肉湯中，35°C孵育2~6h。增菌后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液用生理鹽水或MH肉湯校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，約含1~2 X 108CFU/ml。
[0033]B、MIC 板制備
MIC板制備:無(wú)菌操作，將倍比稀釋后不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，第I至第11孔加藥液，每孔10μ 1，第12孔不加藥作為生長(zhǎng)對(duì)照，冰凍干燥后密封，_20°C以下保存?zhèn)溆谩?br> [0034]C、接種物制備
接種物制備:將用生長(zhǎng)法或直接菌懸液法制備的濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液，經(jīng)MH肉湯1: 1000稀釋后，向每孔中加100 μ 1，密封后置35°C普通空氣孵箱中，孵育16~20h判斷結(jié)果。此時(shí)，第I孔至第11孔藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、
0.25、0.125 μ g/ml。
[0035]D、結(jié)果判斷
結(jié)果判斷:以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照孔(即不含抗生素)內(nèi)細(xì)菌明顯生長(zhǎng)試驗(yàn)才有意義。當(dāng)在微量肉湯稀釋法出現(xiàn)單一的跳孔時(shí)，應(yīng)記錄抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最高藥物濃度。
[0036]結(jié)果見(jiàn)下表。 ___

【權(quán)利要求】
1.能抑制和殺滅耐藥性細(xì)菌的多肽，其由XFP-10B、XFP-11、XHP-12B、XHP-14E或XHP-24B所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列組成:
XFP-1OB: KRffFKIffKRR ；
XFP-11: WRffffKIffKRffR ；
XHP-12B: WVKRIKRFLRffL ；
XHP-14E: KRIVKRIKDFLRffL ；
XHP-24B: LLKELffTKIKRARKAVLRKIKRLL0
2.生產(chǎn)如權(quán)利要求1所定義的多肽的方法，其為固相合成-Boc法。
3.包含如權(quán)利要求1所定義的多肽的組合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于還包含殺細(xì)菌劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于還包含為實(shí)現(xiàn)殺細(xì)菌之外的功能與作用而添加的非多肽的成分。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于所述非多肽的成分包括:為了實(shí)現(xiàn)促進(jìn)酶解的活性酶，或者是增加分散能力的表面活性劑，以及傳送多肽到希望位點(diǎn)的傳遞媒介和/或合適的載體物質(zhì)。
7.如權(quán)利要求1所定義的多肽或者如權(quán)利要求3、4、5或6所述的組合物在制備藥物中的用途，用于殺滅或抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和/或大腸桿菌。
8.如權(quán)利要求1所定義的多肽或者如權(quán)利要求3、4、5或6所述的組合物在制備獸用或人用治療或預(yù)防藥物中的用途，用于殺滅或抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和/或大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求1所定義的多肽或者如權(quán)利要求3、4、5或6所述的組合物用于體外殺滅或抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和/或大腸桿菌方面的用途。
【文檔編號(hào)】A01N47/44GK104072583SQ201410195082
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年5月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月10日
【發(fā)明者】馮小榮, 彭千芮, 馮衛(wèi)星 申請(qǐng)人:馮小榮, 彭千芮, 馮衛(wèi)星