一種改善奶牛瘤胃菌群葡萄糖前體物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種改善奶牛瘤胃菌群葡萄糖前體物的制備方法，屬于奶牛葡萄糖前體物【技術領域】。以微生物制劑和葡萄糖前體物為主要原料，科學復配中草藥提取物、復合酶及其它營養(yǎng)物質(zhì)，有效補充和維持了奶牛瘤胃所需的微生物菌群及生長和生理所需的內(nèi)源性葡萄糖。經(jīng)試驗每頭奶牛日產(chǎn)奶量可提高16.81％；奶牛產(chǎn)后首次發(fā)情時間縮短近10天，產(chǎn)后第一情期奶牛的受胎率提高16.2％，產(chǎn)后奶牛群體的發(fā)情比例增加16％；奶牛產(chǎn)后各種疾病的發(fā)生率平均降低13.0-30.5％。本發(fā)明葡萄糖前體物的制備方法，將粘度較高的甘油和丙二醇與其它物料均勻混合，工藝簡單、操作方便、生產(chǎn)效率高、物料混合效果好，可實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。
【專利說明】一種改善奶牛瘤胃菌群葡萄糖前體物的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及奶牛葡萄糖前體物，特別涉及一種改善奶牛瘤胃菌群葡萄糖前體物的制備方法。
【背景技術】
[0002]一般情況下，反芻動物日糧中大部分糖在瘤胃發(fā)酵過程中形成VFA(揮發(fā)性脂肪酸)，只有少量葡萄糖在消化道中被吸收。成年反芻動物血糖比較低，但并不意味著可以忽視葡萄糖代謝的意義。葡萄糖作為重要的營養(yǎng)性單糖，是所有動物體內(nèi)不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，在動物細胞代謝中擔負著重要的作用。葡萄糖供應不足，牛易發(fā)生酮病，妊娠羊易發(fā)生毒血癥，嚴重影響動物的生長和健康。因此，人們加強了對葡萄糖營養(yǎng)代謝的研究。隨著同位素技術的廣泛應用，人們對不同營養(yǎng)狀況和生理狀況下葡萄糖的代謝規(guī)律有了進一步的了解。目前，國際上的研究工作主要集中在對反芻動物各個組織內(nèi)葡萄糖營養(yǎng)代謝規(guī)律的探討以及激素對碳水化合物代謝的調(diào)控，而國內(nèi)對反芻動物葡萄糖的營養(yǎng)代謝研究尚處于起步階段。
[0003]反芻動物所需能量并不能單獨由脂肪酸提供，體內(nèi)某些組織和器官也特別需要葡萄糖，如:中樞神經(jīng)系統(tǒng)、脂肪組織、胚胎和乳腺、肌肉組織等，a.胚胎生長和乳的生成需要大量的葡萄糖，綿羊妊娠后期，胚胎葡萄糖代謝可占母羊葡萄糖總量的40% -70% ;羊乳中乳糖含量相當于血液中的90倍。據(jù)研究，每天高產(chǎn)奶牛合成乳糖所需的葡萄糖高達2000g ；懷雙羔的綿羊產(chǎn)乳每天需要200g葡萄糖；奶產(chǎn)量高的反芻動物合成乳糖所耗用的葡萄糖占全身葡萄糖總量的60% -85%。b.綿羊神經(jīng)系統(tǒng)每天需要葡萄糖17g，占動物全身葡萄糖總量的15%-20%，而人腦要占70%-80%，其它反芻動物介于人類和綿羊之間。c.已知每合成Ig體脂肪酸需0.65g葡萄糖。由此，葡萄糖對反芻動物所需能量非常重要。
[0004]反芻動物體內(nèi)葡萄糖的來源分為外源葡萄糖和內(nèi)源葡萄糖，1.外源葡萄糖:飼料內(nèi)的可溶性糖和淀粉經(jīng)瘤胃幾乎大部分被降解，直接在消化道內(nèi)被吸收的葡萄糖數(shù)量甚微，大量進食精料的牛羊有一部分淀粉可避開瘤胃發(fā)酵，進入小腸被利用，飼料淀粉的降解程度與飼料種類和加工方法有關。在放牧條件下，綿羊消化道內(nèi)直接吸收利用的葡萄糖幾乎可以忽略不計。據(jù)推算，進食粗飼料為主的羊每天只有5-10g飼料來源的葡萄糖可被吸收；機體每天需要的大量葡萄糖要靠葡萄糖異生作用在體內(nèi)合成。2.內(nèi)源葡萄糖:一只處于維持狀態(tài)的羊，如果每天只能從飼料獲得5-10g葡萄糖的話，那么由機體葡萄糖異生作用合成的內(nèi)源葡萄糖的數(shù)量可達80-120g?？梢?，反芻動物不是不需要或少需要葡萄糖，而是獲得的葡萄糖的來源與單胃動物不同。內(nèi)源葡萄糖是反芻動物體內(nèi)所需葡萄糖的主要來源，這是反芻動物葡萄糖代謝和利用的主要特點之一。
[0005]和其它反芻動物一樣，奶牛葡萄糖代謝在泌乳初期代謝改變主要表現(xiàn)為肝臟糖異生增加和周圍組織糖氧化作用減弱，以保證葡萄糖能夠直接進入乳腺組織用于合成乳糖。Reynokls et al (2003)等研究發(fā)現(xiàn)，圍產(chǎn)期和泌乳早期奶牛內(nèi)臟器官門脈系統(tǒng)葡萄糖的凈通量為零，甚至出現(xiàn)輕微的負數(shù)。預產(chǎn)期前9天到產(chǎn)后21天內(nèi)臟器官葡萄糖的總輸出量升高267%，這幾乎全部來源于肝臟的糖異生作用。反芻動物肝臟糖原異生的主要底物為瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的丙酸鹽、三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的乳酸鹽、蛋白質(zhì)代謝或內(nèi)臟門脈系統(tǒng)吸收的氨基酸以及脂肪組織降解所釋放的丙三醇(Seal and ReynoklS1993)。圍產(chǎn)期從丙酸鹽、乳酸鹽和甘油異生的葡萄糖占肝臟葡萄糖凈釋放量的50% -60%、15% -20%和2% -4% (Reynoklset al2003)。由氨基酸異生的葡萄糖至少可達葡萄糖總量的20%-30%，其中由丙氨酸異生的葡萄糖在產(chǎn)前9天為2.3%，到產(chǎn)后Ild上升到5.5%。與上述結果和相一致，Overton等(1998)報道了產(chǎn)后Id的肝臟對丙氨酸的醫(yī)生能力是產(chǎn)前21d的2倍。盡管在數(shù)量上看從氨基酸池釋放的氨基酸相對奶產(chǎn)量而言并不重要，但上述結果表明氨基酸可作為一種適應性底物用于產(chǎn)后早期階段葡萄糖的合成。
[0006]作為葡萄糖異生作用的前體物有許多，最有意義的前體物是丙酸、甘油、氨基酸和乳酸；其它還有戊酸、核酸、檸檬酸和其它各種有機酸，由于戊酸等幾種有機酸在血液中含量很低，因此，生糖作用有限。
[0007]實踐證明:所有高產(chǎn)奶牛在泌乳早期總是不同程度地受到酮病的威脅。特別是亞臨床酮病，由于不產(chǎn)生典型的臨床癥狀，較難于識別出來，只是表現(xiàn)出奶牛采食量下降、產(chǎn)奶量降低、精神沉郁。這些現(xiàn)象卻又通常被解釋為“新產(chǎn)牛采食量低下、產(chǎn)犢應激、管理不善等綜合因素所引起”。而真正的原因是由于奶牛體內(nèi)葡萄糖的供應量滿足不了生理狀態(tài)快速變化時的巨大需求。簡而言之，奶牛缺糖。
[0008]雖然發(fā)生亞臨床酮病的奶牛表面上并不表現(xiàn)什么癥狀，但通常奶牛的產(chǎn)奶潛力受到很大影響。最近，美國Hoard’ s Dairyman雜志通過美國的牧場調(diào)查發(fā)現(xiàn),各種新產(chǎn)牛常見病的發(fā)病率從高到低依次是:酮病(臨床型和亞臨床型)、胎衣滯留、產(chǎn)褥熱、皺胃移位和子宮內(nèi)膜炎。加拿大Onatrio省的調(diào)查也發(fā)現(xiàn)，新產(chǎn)牛出現(xiàn)問題最多的是酮病(臨床型和亞臨床型)，其次是乳房炎(臨床型和亞臨床型)，然后是蹄病、胎衣滯留、產(chǎn)乳熱和皺胃移位。由此可見，酮病(臨床型和亞臨床型)在奶牛養(yǎng)殖發(fā)達國家是新產(chǎn)牛發(fā)病率最高的疾病。在中國，由于相關的調(diào)查研究工作尚未普及，但不可否認，酮病是隱藏在奶牛場內(nèi)部的最大產(chǎn)奶量“殺手”之一。
[0009]科學、合理、有效地為奶牛提供代謝葡萄糖可有效提高產(chǎn)奶量、降低酮病和皺胃變位的發(fā)病率、有效提高奶牛泌乳早期干物質(zhì)采食量和縮短產(chǎn)犢間隔和首次發(fā)情配種時間。
[0010]解決奶牛在泌乳早期葡萄糖供應不足的有效方法就是在飼料中添加生糖體，即葡萄糖前體物。
[0011]奶牛瘤胃菌群失調(diào)癥是由于不合理的奶牛飼養(yǎng)管理方式，抗生素藥物的不合理使用，造成奶牛消化道，特別是瘤胃內(nèi)有益微生物減少或消失，微生物生態(tài)平衡被破壞而引起奶牛瘤胃消化吸收機能減弱，植物性神經(jīng)紊亂，進一步造成奶牛漸進性營養(yǎng)消耗性衰竭，最終造成奶牛淘汰甚至死亡，獸醫(yī)臨床上稱奶牛頑固性厭食癥。和其它反芻動物一樣，奶牛最主要的特征之一就是能廣泛利用高纖維飼料，這一特征得益于瘤胃微生物，奶牛飼料中的纖維素主要依靠瘤胃內(nèi)的細菌、纖毛蟲和真菌來分解，在纖維素的分解消化中，細菌和真菌發(fā)揮80 %的作用，纖毛蟲起平衡控制作用，在瘤胃微生物協(xié)同作用下，纖維素逐段被分解，最終產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，被奶牛所吸收利用。
[0012]一部分瘤胃微生物是有害無益的，如甲烷菌，它的主要作用就是合成甲烷；甲烷被認為是僅次于二氧化碳的引起全球變暖的重要氣體，奶牛體內(nèi)甲烷的產(chǎn)生也是瘤胃內(nèi)發(fā)酵能量損失的主要原因，約6-15%的飼料能量以甲烷的形式被損耗。
[0013]因此，合理補充奶牛瘤胃所需有益微生物可降低能量物質(zhì)的消耗，促進內(nèi)源性葡萄糖的吸收和代謝。
[0014]中國專利CN102247570B公開了一種治療奶牛酮病的中藥組合物，使用該中藥組合物治療奶牛酮病58例，治愈率達86%，但沒有從根本上解決泌乳早期葡萄糖供應不足的問題，治標不治本，對原發(fā)性酮病治療效果不佳。中國專利CN101822317B公開了一種防治奶牛酮病的復方飼料添加劑及制備方法。它是由中藥當歸、赤芍、川芎、熟地、益母草、廣木香、黨參、黃芪、山楂、陳皮制成的提取物與丙酸鈉、硫酸鈷、硫酸銅、硫酸錳、煙酸、維生素D3、磷酸二氫鈣、檸檬酸共同組成的復方制劑，可補氣健脾、活血補血、增加糖原緩解酸中毒、補充缺少的微量元素，補糖補鈣磷，達到對酮病進行快速有效的預防和治療，其中中藥提取物采用水煮法提取，有效成分提取率低，成本高，同時葡萄糖前體物復配不全，綜合效果不佳，不能很好維持奶牛瘤胃的微生物菌群。中國專利CNlO1305774B公開了 一種奶牛圍產(chǎn)期復合營養(yǎng)補充劑，由下列重量組份的預混劑原料構成:過瘤胃維生素E:0.5-1份、過瘤胃β -胡蘿卜素:0.2-0.3份、過瘤胃煙酸5-6份、過瘤胃生物素:0.015-0.02份、過瘤胃膽堿:3-4份、賴氨酸鋅0.35-0.45份、葡萄糖氧化酶制劑:50-60份、紅砂糖適量添加到100份。具有提高奶牛機體免疫力、保護肝腎功能，能夠預防奶牛產(chǎn)后疾病；具有改善繁殖性能，縮短產(chǎn)犢間隔的功能；具有促進代謝，增加奶產(chǎn)量等功能，同樣沒有解決泌乳早期奶牛內(nèi)源性葡萄糖供應不足的問題，對酮病等疾病的防止、治療和奶牛的生產(chǎn)性能等效果不太理想。中國專利CN102499331B —種奶牛瘤胃調(diào)控劑及其制備方法。所述瘤胃調(diào)控劑為將釀酒酵母、熱帶假絲酵母和米曲霉菌進行培養(yǎng)，然后混合發(fā)酵后得到的產(chǎn)物，其中，發(fā)酵時釀酒酵母、熱帶假絲酵母和米曲霉菌的體積比為0.9?1.1: 1.8?2.2: 0.9?1.1。優(yōu)點是促進和維護瘤胃內(nèi)微生物區(qū)系平衡，穩(wěn)定瘤胃PH值，緩解高精料引起的奶牛酸毒，降低瘤胃中氨的濃度，促進其對氮的利用，改善其微生態(tài)環(huán)境，但主要是通過刺激瘤胃中纖維分解菌和乳酸菌的繁殖達到上述目的，沒有針對性的補充瘤胃所需有益菌。
[0015]綜上所述，制備一種有效改善奶牛瘤胃微生物菌群、顯著提高奶牛所需內(nèi)源性葡萄糖的葡萄糖前體物很有必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]本發(fā)明所解決的技術問題是克服現(xiàn)有奶牛營養(yǎng)物質(zhì)的不足，針對奶牛的進食特點和消化、吸收及代謝特性，提供一種可改善奶牛瘤胃消化菌群、有效補充奶牛生長和生理所需的內(nèi)源性葡萄糖以防止和治療奶牛頑固性厭食癥和因缺乏葡萄糖而引起的各種疾病的葡萄糖前體物的制備方法。
[0017]為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案:
[0018]一種改善奶牛瘤胃菌群葡萄糖前體物的制備方法，包括如下步驟:
[0019]所述葡萄糖前體物由以下重量份數(shù)的原料制備:
[0020]微生物制劑45-55份，丙二醇22-28份，甘油22_28份，丙酸鈣22_28份，硅鋁酸鹽22-28份，中草藥提取物18-22份，煙酰胺12-18份，煙酸12-18份，乳酸鈉10-15份，氯化鈉10-15份，復合酶8-12份，檸檬酸5-10份，過瘤胃葡萄糖5_10份，過瘤胃氨基酸3_8份，過瘤胃膽堿5-8份，復合維生素3-5份，復合礦物質(zhì)2-4份。[0021]所述微生物制劑是以居瘤胃梭菌(Clostridium ruminocolum)和黑曲霉(Aspergillus niger)經(jīng)混合發(fā)酵、低溫負壓真空濃縮、流化床干燥、低溫粉碎而制得；
[0022]所述居瘤胃梭菌(Clostridium ruminocolum)菌株為中國專利CN101148651B公開的一株居瘤胃梭菌(Clostridium ruminocolum)HI,該梭菌具有降解纖維素及木聚糖酶、木糖和酯類物質(zhì)的活性；已于2007年8月6日保藏于中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心，保藏地址:中國北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號，保藏編號=CGMCC N0.2125 ；
[0023]所述黑曲霉(Aspergillus niger)菌株具體為產(chǎn)高活力纖維素酶的菌株黑曲霉(Aspergillus niger) L1-2013-03。該菌株已于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC N0.7927。
[0024]所述微生物制劑的制備方法包括如下步驟:
[0025](I)黑曲霉CGMCC N0.7927、居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125菌種活化
[0026]將保存完好的黑曲霉CGMCC N0.7927的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，28_33°C培養(yǎng)36-48h進行菌種活化，如此活化2-4次；
[0027]將保存完好的居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，35_41°C培養(yǎng)24-36h進行菌種活化，如此活化2-3次；
[0028]所述黑曲霉CGMCC N0.7927斜面培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯(煮汁)200g，葡萄糖20g，瓊脂20g,中草藥提取物5-20g,蒸餾水IOOOmL, pH值5.8，121°C滅菌20min ；
[0029]所述居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏3g，氯化鈉5g，蛋白胨IOg,瓊脂15g,中草藥提取物5-10g,蒸懼水IOOOmL, pH值6.8,121。。滅菌20min ；
[0030](2)黑曲霉CGMCC N0.7927液體種子擴大培養(yǎng)
[0031]①一級種子培養(yǎng):將步驟(I)活化后的黑曲霉CGMCC N0.7927斜面菌種以無菌水洗下孢子，接入500毫升搖瓶中，液體種子培養(yǎng)基裝量100毫升，28-33°C、80-120rpm搖床培養(yǎng) 36-48h ；
[0032]②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0033]③三級種子培養(yǎng):將二級種子以8%接種量接入5000暈升三級種子搖瓶中，液體培養(yǎng)基裝量1000毫升，28-33°C、80-120rpm搖床培養(yǎng)36_48h ；
[0034]④一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以8%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，控制pH值為5-6，培養(yǎng)溫度28-30°C，攪拌速度200-400rpm，通風量(V/V) 1:0.8-1.2，培養(yǎng)時間 36-48h，溶解氧 10-20% ；
[0035]所述黑曲霉CGMCC N0.7927 —級、二級、三級種子培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯(煮汁)200g,葡萄糖20g,中草藥提取物15-20g,海藻糖10-30g,蒸懼水IOOOmL, pH值5.5,121°C 滅菌 20min ；
[0036]所述黑曲霉CGMCC N0.7927 一級種子罐培養(yǎng)基組成為:玉米粉50_60g，豆粉15-25g，麩皮10-15g，中草藥提取物15-20g，海藻糖10_30g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，純凈水lOOOmL，pH值5-7，121°C滅菌20min ；
[0037]所述黑曲霉CGMCC N0.7927 一級種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0xl09-8.0xlO9個/ml ；[0038](3)居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125液體種子擴大培養(yǎng)
[0039]①一級種子培養(yǎng):將步驟(1)活化后的居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125斜面菌種接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養(yǎng)溫度35-41°C，培養(yǎng)時間 10-15h ；
[0040]②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0041]③三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000毫升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養(yǎng)溫度35-41 °C，培養(yǎng)時間10_15h ；
[0042]④一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度37-39 °C，攪拌速度200_400rpm，通風量(V/V) 1:1-2,罐壓0.05Mpa,培養(yǎng)時間 10-20h ；
[0043]所述居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125 一級、二級、三級種子培養(yǎng)基重量組成為:
[0044]酵母粉0.3-0.5 %，葡萄糖1-1.5 %，蛋白胨0.3-0.5 %，牛肉膏0.5-0.8 %，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，中草藥提取物1.5-2%，海藻糖1_3%，不足部分純凈水補足，pH值6.8，121-123? 滅菌 30-40min。
[0045]所述居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125種子罐培養(yǎng)基重量組成為:
[0046]麥芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草藥提取物1.5_2%，海藻糖1_3%，蛋白胨0.1-0.5%，玉米漿0.1-0.5%，磷酸氫二鉀0.8-1.5%，硫酸鎂0.05-0.1%，不足部分純凈水補足，pH 值 6.8，121-123°C滅菌 30_40min。
[0047]所述居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125 一級種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0xl09-8.0xlO9個/ml ；
[0048](4)黑曲霉CGMCC N0.7927、居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125 一級種子罐液體種子混合
[0049]將步驟(2)得到的黑曲霉CGMCC N0.7927種子罐液體種子與步驟(3)得到的居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125種子罐液體種子按體積比均勻混合；
[0050]所述體積比1:0.5-1 ；
[0051]所述混合液體種子菌體濃度為:7.0x109-8.0xlO9個/ml ；
[0052](5) 二級種子罐互生
[0053]將步驟(4)中均勻混合的一級種子罐液體種子以10%接種量接入總容積為300L的二級種子罐，互生培養(yǎng)基裝量240L，二級種子罐發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度33-39 °C，攪拌速度200-700r/m，通風量(V/V) 1:1-3,培養(yǎng)時間 15_24h ；
[0054]所述互生培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆粉15_25g，麩皮10-15g，中草藥提取物15-20g，海藻糖10-30g，酵母粉4_8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，純凈水lOOOmL，pH值5-7，121°C滅菌20min ；
[0055]所述二級種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7.0xlO9-S.0xlO9個/ml ；
[0056](6)菌種混合發(fā)酵
[0057]將步驟(5)中二級種子罐互生液體種子以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度28-30°C，攪拌速度 200-700r/m，通風量(V/V) 1:1-3,培養(yǎng)時間 15_20h;然后以 1-2 °C /h降溫速率緩慢降溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)10-12h ;繼續(xù)以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5°C，此時，將步驟(5)中二級種子罐互生液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)6-8h ;最后以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至10-15°C，恒溫培養(yǎng)10_12h ;繼續(xù)以1_2°C /h升溫速率緩慢升溫至37-39°C，恒溫培養(yǎng)15-20h ；
[0058]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精50_150g，玉米粉50_60g，豆粉15_25g，麩皮10-15g，中草藥提取物30-50g，海藻糖30-40g，酵母粉4_8g，玉米漿l_5g，硫酸銨l_3g，磷酸氫二鉀l_2g，磷酸二氫鉀l_2g，純凈水lOOOmL，pH值5-7，121°C滅菌20min ；
[0059]所述發(fā)酵罐發(fā)酵液菌體濃度為?.0xlO9-S.0xlO9個/ml ；
[0060](7)發(fā)酵液經(jīng)低溫負壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液，濃縮液與載體按質(zhì)量比為0.5:1均勻混合，于45°C流化床干燥，40°C低溫粉碎，粉碎粒度0.5-1.5mm，即得微生物制劑；
[0061]所述載體重量份數(shù)組成為:CaC0320-23份，糊精10_12份。
[0062]所述微生物制劑活菌數(shù)含量為1.5xl010-3xl010個/g。
[0063]所述甘油為食品級甘油，純度99.5% ；
[0064]所述硅鋁酸鹽為具有選擇性強吸附作用的硅鋁酸鹽或硅鋁酸鹽衍生物，與中草藥提取物科學復配，能吸附黃曲霉毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素等多種毒素，還具增強免疫力、護肝強腎等作用，而且不會吸附飼料中氨基酸、維生素、微量元素等營養(yǎng)成份；
[0065]所述中草藥提取物由以下重量份數(shù)的原料制備:當歸55-65份，川芎55-65份，砂仁50-60份，赤芍50-60份，熟地50-60份，神曲45-55份，麥芽45-55份，益母草45-55份，廣木香40-45份，黨參40-45份，蒼術40-45份，黃芪40-45份，金銀花40-45份，魚腥草35-45份，茯苓35-45份，棗仁35-45份，茯神35-45份，遠志30-40份，炒茴香30-40份，白術30-40份，厚樸30-40份，枳殼25-35份，甘草25-35份，山楂25-35份，陳皮25-35份。
[0066]所述中草藥提取物的制備方法為:分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C -90°C保持2-4h，然后降溫至45-60°C，加入混合物料總重量5-10%的混合酶制劑進行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為
5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制溫度至600C _78°C保持3-4h，過濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然后冷凍干燥、40°C低溫粉碎即得中草藥提取物，粉碎粒度0.5-2mm ；
[0067]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)β -葡聚糖酶10-20份，外β -葡聚糖酶10-20份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5_10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份；
[0068]所述乙醇和丙醇混合的質(zhì)量比為1:1-2，所述乙醇濃度≥75% ；
[0069]所述乳酸鈉為60%食品級乳酸鈉；
[0070]所述復合酶由以下重量份數(shù)的固體酶制劑均勻混合而成:中性蛋白酶22-28份，酸性蛋白酶22-28份，堿性木聚糖酶22-28份，酸性木聚糖酶22-28份，纖維素酶22-28份，β -葡聚糖酶15-20份，果膠酶15-20份，淀粉酶15-20份，甘露糖酶10-15份，植酸酶10-15份。
[0071] 所述檸檬酸為固體檸檬酸；
[0072] 所述每公斤復合維生素包含維生素A2800mg，維生素B13000mg，維生素C2000mg，核黃素1600mg，泛酸1900mg，維生素B61800mg，維生素B121200mg，肌醇5000mg，維生素E600mg,維生素D35500mg，維生素K34000mg ;其余量為載體，所述載體為米糠。
[0073]所述每公斤復合礦物質(zhì)包括|丐6000mg,磷4200mg,鈉5IOOmg,銅800mg,鐵1800mg,鉀3800mg，錳1400mg，鈷1600mg，碘5000mg，鎂1450mg ;其余量為載體，所述載體為米糠。
[0074]制備方法:
[0075]I)按照上述配方比例準確稱取各原料，首先將丙二醇和甘油分別加入其質(zhì)量
0.5-1倍的無菌水進行稀釋，然后將稀釋液混合，同時水浴加熱至30-50°C，邊攪拌混合得混合物A，保溫待用；
[0076]2)將丙酸鈣、硅鋁酸鹽、乳酸鈉、氯化鈉、檸檬酸均勻混合得混合物B ；
[0077]3)將中草藥提取物、過瘤胃葡萄糖、過瘤胃氨基酸、過瘤胃膽堿、復合礦物質(zhì)均勻混合得混合物C ；
[0078]4)將微生物制劑、煙酰胺、煙酸、復合酶、復合維生素均勻混合得混合物D ；
[0079]5)將混合物B加入LDH-1型犁刀式混合機，啟動混合機，接著加入混合物A均勻混合10-20min ;然后加入混合物C,均勻混合5_10min ;最后加入混合物D,均勻混合3_5min,將最終混合物密封、包裝即得可改善奶牛瘤胃菌群的葡萄糖前體物。
[0080]使用方法:1.添加到精料、粗料或預混料中，混合均勻；
[0081]2.將本品添加10-20倍自來水，均勻混合后口服或噴灑在全混合日糧上；
[0082]使用量:新產(chǎn)牛:100_120g/頭、天；
[0083]泌乳牛:80_100g/頭、天；
[0084]干奶后期牛:100-120g/頭、天；
[0085]肉牛:20_25kg/噸日糧；
[0086]使用階段:
[0087]1.提高生產(chǎn)性能:產(chǎn)前20天至產(chǎn)后30天；
[0088]2.預防治療酮病:產(chǎn)后預防保健:產(chǎn)后第I天至第7天；
[0089]產(chǎn)后治療酮病:產(chǎn)后測定血酮含量，若含量達到1.2mmol/L以上進行灌服，連續(xù)灌服5天；
[0090]本發(fā)明居瘤胃梭菌菌株CGMCC N0.2125能夠降解纖維素及木聚糖、木糖和酯類，該菌含有降解纖維素的復合酶系，包括外切纖維素酶、內(nèi)切纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、酯酶、果膠酶，酶活分別為 4.1±1.19U/mg、118.7±4.5U/mg、167.36 ±22.9U/mg、45.9±3.52U/mg、4±0.5U/mg、35.3±1.77U/mg，該菌最適培養(yǎng)溫度 35-41 °C，最適 pH 值
6.5~7.5。
[0091]本發(fā)明黑曲霉菌株CGMCC N0.7927具有以下微生物學特征:1、形態(tài)學特征:生物學形態(tài)包括分生孢子、胞梗、頂囊、產(chǎn)胞結構等幾部分。分生孢子頭球形至輻射形，直徑150-450 μ m，分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)。胞梗莖1000-3000 (長度)X 12-20 (直徑)μπι，黃色或黃褐色，壁平滑；頂囊球形或近似球形，直徑45-75 μ m，表面全面可育；產(chǎn)胞結構雙層，梗基10-20 (長度)X 4.5-7.0 (直徑)μ m,瓶梗6-10 (長度)X 2.5-3.5 (直徑)μ m,分生孢子球形或近球形，直徑3-4.5 μ m，褐色，壁粗糙。2、培養(yǎng)學特征:菌株在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上生長迅速，28°C 4天孢子可鋪滿斜面；質(zhì)地絲絨狀或稍帶絮狀；分生孢子結構大量，褐黑色，無滲出液；菌落反面略帶黃色。3、生理生化特征:黑曲霉菌株CGMCC N0.7927可在玉米秸桿、稻草、木屑、馬鈴薯、玉米粉、可溶性淀粉、糖蜜等碳源上生長，最適pH范圍5-6，最適生長溫度范圍28-33°C，最適產(chǎn)酶溫度范圍28-30°C。
[0092]本發(fā)明黑曲霉菌株CGMCC N0.7927的篩選技術路線為:出發(fā)菌株一斜面培養(yǎng)一孢子懸液的制備一誘變處理一平板分離一初篩一復篩一遺傳穩(wěn)定性測定一擴大實驗(發(fā)酵性能測定)。
[0093]按誘變篩選方案，對突變株逐級篩選淘汰，最后對優(yōu)良菌株經(jīng)發(fā)酵性能測試篩選，得到一株高產(chǎn)酶性能菌株黑曲霉菌AspergiIIus niger L1-2013-03,發(fā)酵96小時后纖維素酶的外切β -葡聚糖酶、內(nèi)切β -葡聚糖酶、β -葡萄糖苷酶和濾紙酶活力分別達到620U/mL、1289U/mL、456U/mL 和 732U/mL。
[0094]有益效果:
[0095]1.本發(fā)明制備的葡萄糖前體物針對奶牛的進食特點和消化、吸收及代謝特性，以微生物制劑和葡萄糖前體物為主要原料，科學復配中草藥提取物、復合酶及其它奶牛所需營養(yǎng)物質(zhì)，不僅補充和維持了奶牛瘤胃所需的微生物菌群，保證了瘤胃的正常功能，促進和提高了營養(yǎng)物質(zhì)的消化率和吸收率；而且為奶牛提供了生產(chǎn)、生長和預防、治療疾病的最豐富、最全面的營養(yǎng)物質(zhì)，特別是有效補充了奶牛生長和生理所需的內(nèi)源性葡萄糖，有效維持奶牛機體能量平衡。
[0096]2.本發(fā)明制備的葡萄糖前體物可有效提高產(chǎn)奶量，每頭奶牛日產(chǎn)奶量可提高16.81% ;有效縮短奶牛產(chǎn)后第一次發(fā)情的時間近10天，提高產(chǎn)后第一情期奶牛的受胎率16.2%，增加產(chǎn)后奶牛群體的發(fā)情比例16%，有效提高奶牛的繁殖性能；可顯著降低奶牛產(chǎn)后頑固性厭食癥、酮病、乳房炎、子宮內(nèi)膜炎、瘤胃變位、產(chǎn)褥熱和胎衣不下等疾病的發(fā)生率，平均降低13.0-30.5%, t檢驗差異顯著(P < 0.05)。
[0097]3.本發(fā)明的中草藥提取物采用酶解和醇沉提取，最大限度地提取了種草藥中的有效成分，提高了原料利用率，降低了生產(chǎn)成本。并且，將本發(fā)明的中草藥提取物應用在微生物制劑的制備方法中，提高了瘤胃微生物對中草藥的抗性，為后期消化系統(tǒng)的正常運行奠定了堅實的基礎，同時克服了現(xiàn)有技術中因應用中草藥而對瘤胃有益微生物抑制或破壞的缺陷；本發(fā)明微生物制劑的制備方法對微生物具有抗應激及復壯作用，微生物制劑中的微生物對中草藥有效成分已經(jīng)具備抗藥性，后期飼喂的中草藥有效成分不會抑制和影響添加微生物的正常生長和繁殖。
[0098]4.本發(fā)明的硅鋁酸鹽具有選擇性吸附功能和強大的吸附作用，只吸附奶牛進食中因霉菌而產(chǎn)生的霉菌毒素，不吸附微生物和營養(yǎng)物質(zhì)，提高了奶牛產(chǎn)奶的安全性和有效預防霉菌毒素引起的各種疾病。
[0099]5.本發(fā)明的制備方法，將粘度較高的甘油和丙二醇與其它物料均勻混合，工藝簡單、操作方便、生產(chǎn)效率高、物料混合效果好，可實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。
【具體實施方式】
[0100]下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0101]實施例1微生物制劑的制備
[0102]所述微生物制劑的制備方法包括如下步驟:
[0103](I)黑曲霉CGMCC N0.7927、居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125菌種活化
[0104]將保存完好的黑曲霉CGMCC N0.7927的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)24h進行菌種活化，如此活化3次；
[0105]將保存完好的居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基，39°C培養(yǎng)24-36h進行菌種活化，如此活化2次；
[0106]所述黑曲霉CGMCC N0.7927斜面培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯(煮汁)200g，葡萄糖20g，瓊脂20g,中草藥提取物IOg,蒸懼水lOOOmL, pH值5.8,121。。滅菌20min ；
[0107]所述居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125斜面培養(yǎng)基組成為:牛肉膏3g，氯化鈉5g，蛋白胨IOg,瓊脂15g,中草藥提取物8g,蒸懼水lOOOmL, pH值6.8,121。。滅菌20min ；
[0108](2)黑曲霉CGMCC N0.7927液體種子擴大培養(yǎng)
[0109]①一級種子培養(yǎng):將步驟(I)活化后的黑曲霉CGMCC N0.7927斜面菌種以無菌水洗下孢子，接入500毫升搖瓶中，液體種子培養(yǎng)基裝量100毫升，30°C、IOOrpm搖床培養(yǎng)24h ；
[0110]②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0111]③三級種子培養(yǎng):將二級種子以8%接種量接入5000暈升三級種子搖瓶中，液體培養(yǎng)基裝量1000毫升，300C、IOOrpm搖床培養(yǎng)24h ；
[0112]④一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以8%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，控制pH值為5.5，培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速度300rpm，通風量(V/V) 1:1.2,培養(yǎng)時間42h，溶解氧15% ；
[0113]所述黑曲霉CGMCC N0.7927 —級、二級、三級種子培養(yǎng)基組成為:馬鈴薯(煮汁)200g,葡萄糖20g,中草藥提取物15g,海藻糖20g,蒸懼水lOOOmL, pH值5.5,121°C滅菌 20min ；
[0114]所述黑曲霉CGMCC N0.7927 一級種子罐培養(yǎng)基組成為:玉米粉55g，豆粉20g，麩皮12g，中草藥提取物18g，海藻糖20g，硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，純凈水lOOOmL, pH 值 5.5，121°C 滅菌 20min ；
[0115]所述黑曲霉CGMCC N0.7927 一級種子罐發(fā)酵液菌體濃度為8.0xlO9個/ml ；
[0116](3)居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125液體種子擴大培養(yǎng)
[0117]①一級種子培養(yǎng):將步驟(I)活化后的居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125斜面菌種接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養(yǎng)溫度39°C，培養(yǎng)時間12h ；
[0118]②二級種子培養(yǎng):將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；
[0119]③三級種子培養(yǎng):將二級種子以10%接種量接入5000暈升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養(yǎng)溫度39°C，培養(yǎng)時間12h ；
[0120]④一級種子罐培養(yǎng):將三級種子以10%接種量接入總容積為150L的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度39°C，攪拌速度300rpm，通風量(V/V) 1:1,罐壓0.05Mpa,培養(yǎng)時間15h ；
[0121]所述居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125 一級、二級、三級種子培養(yǎng)基重量組成為:
[0122]酵母粉0.4%，葡萄糖1.5%，蛋白胨0.4%，牛肉膏0.6%，磷酸氫二鉀1.2%，中草藥提取物1.5%，海藻糖2%，不足部分純凈水補足，pH值6.8，121°C滅菌30min。
[0123]所述居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125種子罐培養(yǎng)基重量組成為:
[0124]麥芽糊精10%，酵母粉0.6%，中草藥提取物1.6%，海藻糖2%，蛋白胨0.3%，玉米漿0.3%，磷酸氫二鉀1.2%，硫酸鎂0.08%，不足部分純凈水補足，pH值6.8，121°C滅菌30mino
[0125]所述居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125 一級種子罐發(fā)酵液菌體濃度為8.0xlO9個/ml ；
[0126](4)黑曲霉CGMCC N0.7927、居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125—級種子罐液體種子混合
[0127]將步驟(2)得到的黑曲霉CGMCC N0.7927種子罐液體種子與步驟(3)得到的居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125種子罐液體種子按體積比均勻混合；
[0128]所述體積比1:1;
[0129]所述混合液體種子菌體濃度為:8.0xlO9個/ml ；
[0130](5) 二級種子罐互生
[0131]將步驟(4)中均勻混合的一級種子罐液體種子以10%接種量接入總容積為300L的二級種子罐，互生培養(yǎng)基裝量240L，二級種子罐發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度36°C，攪拌速度500r/m，通風量(V/V) 1:1,培養(yǎng)時間20h ；
[0132]所述互生培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精100g，玉米粉55g，豆粉20g，麩皮12g，中草藥提取物18g，海藻糖20g，酵母粉6g，玉米漿3g，硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，純凈水 lOOOmL, pH 值 6，121°C滅菌 20min ；
[0133]所述二級種子罐發(fā)酵液菌體濃度為8.0xlO9個/ml ；
[0134](6)菌種混合發(fā)酵
[0135]將步驟(5)中二級種子罐互生液體種子以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度30°C，攪拌速度500r/m，通風量(V/V)l:l，培養(yǎng)時間18h ;然后以2°C /h降溫速率緩慢降溫至12°C，恒溫培養(yǎng)IOh ;繼續(xù)以2V /h降溫速率緩慢降溫至4°C，此時，將步驟(5)中二級種子罐互生液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)6h ;最后以2°C /h升溫速率緩慢升溫至12°C，恒溫培養(yǎng)IOh ;繼續(xù)以2V /h升溫速率緩慢升溫至38°C，恒溫培養(yǎng)20h ；
[0136]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥芽糊精100g，玉米粉55g，豆粉20g，麩皮12g，中草藥提取物40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米漿3g，硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，純凈水 lOOOmL, pH 值 6，121°C滅菌 20min ；
[0137]所述發(fā)酵罐發(fā)酵液菌體濃度為8.0xlO9個/ml ；
[0138](7)發(fā)酵液經(jīng)低溫負壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液，濃縮液與載體按質(zhì)量比為0.5:1均勻混合，于45°C流化床干燥，40°C低溫粉碎，粉碎粒度1mm，即得微生物制劑；
[0139]所述載體重量份數(shù)組成為:CaC0322份，糊精12份。
[0140]經(jīng)上述方法制備的微生物制劑活菌數(shù)含量為31101°個/g。
[0141]實施例2中草藥提取物的制備[0142]所述中草藥提取物由以下重量份數(shù)的原料制備:當歸60份，川芎60份，砂仁55份，赤芍55份，熟地55份，神曲50份，麥芽50份，益母草50份，廣木香42份，黨參42份，蒼術42份，黃芪42份，金銀花42份，魚腥草40份，茯苓40份，棗仁40份，茯神40份，遠志35份，炒茴香35份，白術35份，厚樸35份，枳殼30份，甘草30份，山楂30份，陳皮30份。
[0143]所述中草藥提取物的制備方法為:分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持3h，然后降溫至50°C，加入混合物料總重量8%的混合酶制劑進行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為6.2，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇(95% )和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇混合的質(zhì)量比為1: 1.5，控制溫度至70°C保持4h，過濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為25%，然后冷凍干燥、40°C低溫粉碎即得中草藥提取物；
[0144]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)葡聚糖酶15份，外β-葡聚糖酶15份，β -葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普魯蘭酶25份，β -淀粉酶12份，中性蛋白酶12份，酸性蛋白酶12份，超氧化物歧化酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶8份；
[0145]經(jīng)上述制備方法制備的中草藥提取物粒度為1.2mm，有效成分提取率達到95以上。
[0146]實施例3復合酶的復配
[0147]所述復合酶由以下重量份數(shù)的固體酶制劑均勻混合而成:中性蛋白酶25份，酸性蛋白酶25份，堿性木聚糖酶25份，酸性木聚糖酶25份，纖維素酶25份，β -葡聚糖酶18份，果膠酶18份，淀粉酶18份，甘露糖酶12份，植酸酶12份。
[0148]分別以實施例1-3制備的微生物制劑、中草藥提取物和復合酶為原料，與市售丙二醇、甘油、丙酸鈣、硅鋁酸鹽、煙酰胺、煙酸、乳酸鈉、氯化鈉、檸檬酸、過瘤胃葡萄糖、過瘤胃氨基酸、過瘤胃膽堿、復合維生素、復合礦物質(zhì)進行復配，制備可改善奶牛瘤胃菌群的葡萄糖前體物，具體原料配方見表1，制備方法見實施例4-6 ；
[0149]所述甘油為食品級甘油，純度99.5% ；
[0150]所述硅鋁酸鹽為具有選擇性強吸附作用的過鋁酸鹽及其衍生物；
[0151]所述乳酸鈉為60%食品級乳酸鈉；
[0152]所述檸檬酸為固體檸檬酸；
[0153]所述每公斤復合維生素包含維生素A2800mg，維生素B13000mg，維生素C2000mg，核黃素1600mg，泛酸1900mg，維生素B61800mg，維生素B121200mg，肌醇5000mg，維生素E600mg,維生素D35500mg，維生素K34000mg ;其余量為載體，所述載體為米糠。
[0154]所述每公斤復合礦物質(zhì)包括6000mg,磷4200mg,鈉5IOOmg,銅800mg,鐵1800mg,鉀3800mg，錳1400mg，鈷1600mg，碘5000mg，鎂1450mg ;其余量為載體，所述載體為米糠。
[0155]表I原料配方
[0156]
【權利要求】
1.一種改善奶牛瘤胃菌群葡萄糖前體物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:準確稱取微生物制劑45-55份，丙二醇22-28份，甘油22-28份，丙酸鈣22-28份，硅鋁酸鹽22-28份，中草藥提取物18-22份，煙酰胺12-18份，煙酸12-18份，乳酸鈉10-15份，氯化鈉10-15份，復合酶8-12份，檸檬酸5-10份，過瘤胃葡萄糖5_10份，過瘤胃氨基酸3_8份，過瘤胃膽堿5-8份，復合維生素3-5份，復合礦物質(zhì)2-4份；首先將丙二醇和甘油分別加入其質(zhì)量0.5-1倍的無菌水進行稀釋，然后將稀釋液混合，水浴加熱至30-5(TC，邊攪拌混合得混合物A，保溫待用；同時將丙酸鈣、硅鋁酸鹽、乳酸鈉、氯化鈉、檸檬酸均勻混合得混合物B，將中草藥提取物、過瘤胃葡萄糖、過瘤胃氨基酸、過瘤胃膽堿、復合礦物質(zhì)均勻混合得混合物C，將微生物制劑、煙酰胺、煙酸、復合酶、復合維生素均勻混合得混合物D ;然后將混合物B加入LDH-1型犁刀式混合機，啟動混合機，接著加入混合物A均勻混合10-20min ?’然后加入混合物C,均勻混合5-10min ;最后加入混合物D,均勻混合3_5min,將最終混合物密封、包裝即得可改 善奶牛瘤胃菌群的葡萄糖前體物； 所述微生物制劑是以居瘤胃梭菌(Clostridium ruminocolum)CGMCC N0.2125和黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC N0.7927經(jīng)混合發(fā)酵、低溫負壓真空濃縮、流化床干燥、低溫粉碎而制得。
2.如權利要求1所述的改善奶牛瘤胃菌群葡萄糖前體物的制備方法，其特征在于，所述微生物制劑的制備方法包括如下步驟:首先將居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125和黑曲霉CGMCC N0.7927斜面菌株活化，分別經(jīng)一級、二級、三級種子擴大培養(yǎng)至一級種子罐；然后將黑曲霉CGMCCN0.7927與居瘤胃梭菌CGMCC N0.2125 一級種子罐液體種子按體積比1:0.5-1均勻混合，以10%接種量接入二級種子罐互生培養(yǎng)，互生培養(yǎng)基裝量240L，培養(yǎng)溫度33-39°C，攪拌速度200-700r/m，通風量(V/V)l:l_3，培養(yǎng)時間15_24h ;最后二級種子罐互生液體種子以6%接種量接入發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度28-30°C，攪拌速度200-700r/m，通風量(V/V)l:l-3，培養(yǎng)時間15-20h ;然后以1-2 °C /h降溫速率緩慢降溫至10-15 °C，恒溫培養(yǎng)10-12h ;繼續(xù)以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至2-5°C，此時，將二級種子罐互生液體種子以4%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)6-8h;最后以1-2°C /h升溫速率緩慢升溫至10-15 °C，恒溫培養(yǎng)10-12h ;繼續(xù)以1-2 °C /h升溫速率緩慢升溫至37-39 °C，恒溫培養(yǎng)15-20h ;發(fā)酵液經(jīng)低溫負壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液，濃縮液與載體按質(zhì)量比為0.5:1均勻混合，于45°C流化床干燥，40°C低溫粉碎，粉碎粒度0.5-1.5mm，即得微生物制劑。
3.如權利要求2所述的改善奶牛瘤胃菌群葡萄糖前體物的制備方法，其特征在于，所述載體重量份數(shù)組成為:CaC0320-23份，糊精10-12份。
4.如權利要求1或2所述的改善奶牛瘤胃菌群葡萄糖前體物的制備方法，其特征在于，所述微生物制劑活菌數(shù)含量為1.5xl010-3xl010個/g。
5.如權利要求1所述的改善奶牛瘤胃菌群葡萄糖前體物的制備方法，其特征在于，所述硅鋁酸鹽為硅鋁酸鹽或硅鋁酸鹽衍生物。
6.如權利要求1所述的改善奶牛瘤胃菌群葡萄糖前體物的制備方法，其特征在于，所述中草藥提取物的制備方法為:準確稱取當歸55-65份，川芎55-65份，砂仁50-60份，赤芍50-60份，熟地50-60份，神曲45-55份，麥芽45-55份，益母草45-55份，廣木香40-45份，黨參40-45份，蒼術40-45份，黃芪40-45份，金銀花40-45份，魚腥草35-45份，茯苓35-45份，棗仁35-45份，茯神35-45份，遠志30-40份，炒茴香30-40份，白術30-40份，厚樸30-40份，枳殼25-35份，甘草25-35份，山楂25-35份，陳皮25-35份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C _90°C保持2_4h，然后降溫至45-60°C，加入混合物料總重量5-10%的混合酶制劑進行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)PH值為5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量的75%乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇混合的質(zhì)量比為1:1-2，控制溫度至60°C _78°C保持3-4h，過濾；濾液減壓濃縮至固形物含量為20%以上，然后冷凍干燥、40°C低溫粉碎即得粉碎粒度為0.5-2mm的中草藥提取物。
7.如權利要求6所述的改善奶牛瘤胃菌群葡萄糖前體物的制備方法，其特征在于，所述混合酶的重量份數(shù)組成為:內(nèi)β -葡聚糖酶10-20份，外β -葡聚糖酶10-20份，β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β -淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5_10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。
8.如權利要求1所述的改善奶牛瘤胃菌群葡萄糖前體物的制備方法，其特征在于，所述復合酶由以下重量份數(shù)的固體酶制劑均勻混合而成:中性蛋白酶22-28份，酸性蛋白酶22-28份，堿性木聚糖酶22-28份，酸性木聚糖酶22-28份，纖維素酶22-28份，β -葡聚糖酶15-20份，果膠酶15-20份，淀粉酶15-20份，甘露糖酶10-15份，植酸酶10-15份。
9.如權利要求1所述的改善奶牛瘤胃菌群葡萄糖前體物的制備方法，其特征在于，所述每公斤復合維生素包含維生素A2800mg，維生素B13000mg，維生素C2000mg，核黃素1600mg,泛酸 1900mg，維生素 B61800mg，維生素 B121200mg，肌醇 5000mg，維生素 E600mg，維生素D35500mg，維生 素K34000mg ;其余量為載體，所述載體為米糠。
10.如權利要求1所述的改善奶牛瘤胃菌群葡萄糖前體物的制備方法，其特征在于，所述每公斤復合礦物質(zhì)包括韓6000mg,磷4200mg,鈉5IOOmg,銅800mg,鐵1800mg,鉀3800mg,錳1400mg，鈷1600mg，碘5000mg，鎂1450mg ;其余量為載體，所述載體為米糠。
【文檔編號】A23K1/00GK103947904SQ201410204205
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月15日 優(yōu)先權日:2014年5月15日
【發(fā)明者】邵素英 申請人:邵素英