基于土壤動物區(qū)系去除的轉基因植物種植風險評價方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種基于土壤動物區(qū)系去除的轉基因植物種植風險評價方法，主要包括步驟：去除動物區(qū)系、添加土壤濾液、植物種植、添加試驗動物、取樣分析等。本發(fā)明通過利用高溫滅菌殺死剔除土壤動物成體及卵、利用土壤濾液復原農(nóng)田原位微生物，同時結合實驗室標準化土壤動物飼喂，在近自然的原位土壤中評估轉基因植物種植對單一土壤動物存活率、單代及多代繁殖率的影響。本發(fā)明改進了之前所用的田間調查不能有效控制環(huán)境因素、室內(nèi)培養(yǎng)皿飼喂不能充分反映田間土壤環(huán)境的缺欠。本發(fā)明具有轉基因植物種植原位評估和特定敏感類群研究的雙重優(yōu)勢，綜合建立了近自然狀態(tài)下評估轉基因植物種植對單一敏感土壤動物類群影響的方法體系。
【專利說明】基于土壤動物區(qū)系去除的轉基因植物種植風險評價方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領域，具體涉及一種通過遺傳工程獲得的植物的生態(tài)風險評價方法。
【背景技術】
[0002]土壤動物是指長期或生活史中某一個階段在土壤或地表凋落物層中度過的動物。土壤動物在凋落物分解、土壤肥力提高、地下生態(tài)系統(tǒng)物質循環(huán)與能量流動方面有重要影響。以往關于轉基因植物對土壤非靶標動物影響的研究，一方面集中在樣地原位調查方面，即在轉基因植物和對照品種田中，通過原位取樣、土壤動物分離來評估轉基因植物對土壤動物種群的影響；另一方面主要為利用培養(yǎng)基，通過室內(nèi)喂飼，研究轉基因植物凋落物殘體對土壤動物特定類群的影響。前一種方法為田間實際情況調查，存在的問題是所有動物集中在一起，不能剝離區(qū)分特定敏感類群對轉基因植物種植的響應；后一種方法可以單獨評估轉基因植物種植對特定土壤敏感類群的影響，但不足之處是實驗條件為培養(yǎng)基，不是真實反應田間土壤狀態(tài)，進而真實反映轉基因植物種植的自然土壤環(huán)境。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對本領 域研究方面的不足，本發(fā)明的目的是提出一種基于土壤動物區(qū)系去除的轉基因植物種植風險評價方法。
[0004]實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術方案為:
[0005]一種基于土壤動物區(qū)系去除的轉基因植物種植風險評價方法，包括步驟:
[0006]I)去除動物區(qū)系:將轉基因植物種植區(qū)農(nóng)田原位土壤取出后，過2mm篩，去除大土塊，然后進行高溫滅菌，對整個動物區(qū)系進行去除，之后分裝到容器中，土壤填入1cm深。
[0007]2)添加土壤濾液:將土壤濾液20ml添加到去除土壤動物區(qū)系的原位土壤中，還原微生物區(qū)系。
[0008]3)植物種植:將轉基因植物和對照品種種子分別種植到步驟I)和2)處理后得到的農(nóng)田土壤中；
[0009]4)添加試驗動物:在已種植的轉基因植物及對照品種的桶中添加試驗動物，每個容器添加實驗室培養(yǎng)的單一土壤動物類群10頭個體。
[0010]5)取樣:實驗開始后20天、35天、70天進行取樣，利用體視鏡下人工計數(shù)法，采集試驗動物種群數(shù)量，計算存活率、單一世代和多世代繁殖率，比較種植轉基因植物和對照品種的土壤，評估轉基因植物種植對單一土壤動物類群適合度的影響。
[0011]實驗開始20天后(此時土壤動物尚未完成一個世代)計算存活率，公式為:
[0012]存活率=20天后個體數(shù)/原本加入個體數(shù)(10頭)(I)
[0013]35天后(土壤動物已完成繁殖并且幼蟲已孵化出來)計算單一世代繁殖率，公式為:
[0014]單一世代繁殖率=35天后個體數(shù)/20天后個體存活數(shù)(2)[0015]70天后計算多世代繁殖率，公式為:
[0016]多世代繁殖率=70天后個體數(shù)/20天后個體存活數(shù)。(3)
[0017]以上結果與利用培養(yǎng)皿飼養(yǎng)所得結果進行驗證，各參數(shù)間無特別加權。
[0018]優(yōu)選地，所述轉基因植物為旱作轉基因植物，如轉基因玉米、大豆、棉花、小麥等。
[0019]其中，所述步驟I)高溫滅菌的條件為110-120°C，25-35min。
[0020]其中，所述步驟2)中土壤濾液按如下方法制備:原位根際土 10gjP 500ml蒸餾水攪勻后靜置24小時，依次用Imm, 180 μ m, 75 μ m,45 μ m,45 μ m和20 μ m孔徑的篩網(wǎng)進行過濾，濾掉土壤動物成體及卵。
[0021]優(yōu)選地，其特征在于，所述步驟3)中每個作物品種設置5個重復。
[0022]其中，所述步驟3)中植物種植后，將種植環(huán)境設置為植物和土壤動物的最適溫度和濕度重合區(qū)間，具體為溫度15-25°C和濕度50% -75%，其他環(huán)境條件為正常室內(nèi)條件，無特殊要求。
[0023]或者，所述步驟3)中植物種植后，將種植環(huán)境設置未來氣候變化的溫度和/或濕度條件，例如將種植環(huán)境設置為溫度增加2°C和濕度增加25%，具體為溫度17-27°C和濕度75% -100%，擴展到未來氣候變化條件下轉基因植物的風險評價研究。該氣候變化條件下的評價可在氣候室中進行。
[0024]其中，所述步驟4)中單一土壤動物的培養(yǎng)方法為:土壤動物實驗培養(yǎng)采用ISO標準方法(IS011267:1999(E))，在石膏:活性炭=9:1的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，添加啤酒酵母作為食物，全黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20土 1°C，相對濕度90-100 %，每周用去離子水調節(jié)一次，保持整個培養(yǎng)基濕潤。
[0025] 優(yōu)選地，單一土壤動物的培養(yǎng)需要同步化，將三天內(nèi)產(chǎn)的卵收集到一起，卵孵化成幼蟲后的第12天(12日齡)，將幼蟲添加到已經(jīng)種植的轉基因植物及對照品種的容器中。
[0026]其中，所述單一土壤動物選自根結線蟲、跳蟲、變形蟲或螨蟲。
[0027]本發(fā)明的有益效果在于:
[0028]提供了轉基因植物種植對于單一敏感類群評價的近自然方法，改進了之前所用的田間調查不能有效控制環(huán)境因素和室內(nèi)培養(yǎng)皿實驗不能充分反映田間土壤環(huán)境的缺欠。
[0029]本發(fā)明具有轉基因植物種植原位評估和特定敏感類群研究的雙重優(yōu)勢，解決了自然狀態(tài)下評估轉基因植物種植對單一敏感類群影響的方法體系。
【具體實施方式】
[0030]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0031 ] 實施例中，使用的轉基因植物為轉基因玉米Bt799、對照品種為鄭58，種子由中國農(nóng)業(yè)大學提供；實施例2中，使用的轉基因植物為轉基因玉米NC6304YGRR、對照品種為NC6304，種子由孟山都公司提供。
[0032]單一土壤動物為實驗室標準化土壤動物白符跳，F(xiàn)CDK系列，取自中國科學院上海植物生理生態(tài)研究所柯欣實驗室。
[0033]實施例1:
[0034]I)去動物區(qū)系:將0.1m3(長X寬X高=ImX ImX0.1m)轉基因植物種植區(qū)原位土壤從農(nóng)田中取出后，過2mm篩，去除大的土塊，然后進行高溫(110°C，30分鐘)滅菌，對整個生物區(qū)系進行去除，得到去除動物區(qū)系的土壤分裝到10個透明玻璃容器(高15cm，直徑1cm), 土壤填入1cm深。
[0035]2) 土壤濾液制備和加入土壤濾液:用原位根際土 10gJP 500ml蒸餾水攪勻后靜置24小時,依次用I謹，180 μ m, 75 μ m, 45 μ m, 45 μ m和20 μ m孔徑篩網(wǎng)進行過濾，濾掉土壤動物成體及卵，將準備好的土壤濾液20ml添加到盛裝去除土壤動物區(qū)系的土壤的容器中，還原微生物區(qū)系。
[0036]3)植物種植:轉基因玉米Bt799和對照品種鄭58種子種植到步驟2)中的土壤內(nèi)，每個品種設置5個重復。種植環(huán)境為植物和土壤動物的最適溫度和濕度重合區(qū)間，具體為溫度15-25°C和濕度50% -75%，其他環(huán)境條件為正常室內(nèi)條件，無特殊要求。
[0037]4) 土壤動物培養(yǎng):白符跳實驗培養(yǎng),在石膏:活性炭=9:1的培養(yǎng)皿中培養(yǎng),添加啤酒酵母作為食物，全黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20 土 1°C，相對濕度接近100%，每周用去離子水調節(jié)一次，保持整個培養(yǎng)基濕潤。同步化時需將三天內(nèi)產(chǎn)的卵收集到一起，于12日齡可以進行實驗，將實驗室培養(yǎng)的單一土壤動物類群10個個體添加到已經(jīng)種植的轉基因及對照品種的容器中。
[0038]5)取樣及分析，植物正常農(nóng)作管理后，實驗開始的20天、35天、70天后進行采樣，計算單一物種數(shù)量，計算存活率、單一世代和多世代繁殖率，評估轉基因作物種植對單一土壤動物類群的適合度影響。
[0039]具體數(shù)據(jù)見表1，存活率及繁殖率計算公式如(I)至式(3)。式(I)中原本加入個體數(shù)為10頭。研究發(fā)現(xiàn) 在去除土壤動物區(qū)系的玉米農(nóng)田土壤中，白符跳存活率為100% ；轉基因玉米種植對白符跳單一世代和二個世代后的繁殖率均無顯著影響。
[0040]表1、轉基因玉米Bt799和對照品種鄭58中跳蟲存活率、單一世代和多個
[0041]世代繁殖率(平均值土標準誤差)，不同小寫字母表示顯著影響。
[0042]

|Bt799I鄭 58
存活率(20天后)II
單一世代繁殖率(35 天后) 5.24+1.79a~ 8.55 + 2.74a
二個世代后繁殖率(70 天后)~15.36 + 4.21a 22.11 + 6.53a
[0043]實施例2:
[0044]I)去動物區(qū)系:將原位土壤從農(nóng)田中取出后，過2mm篩，去除大的土塊，然后進行高溫(110°C，30分鐘)滅菌，對整個生物區(qū)系進行去除，得到去除動物區(qū)系的土壤。
[0045]2)、土壤濾液制備和加入:用原位根際土 100g，加500ml蒸餾水攪勻后靜置24小時，依次用1mm，180 μ m, 75 μ m, 45 μ m, 45 μ m和20 μ m孔徑篩網(wǎng)進行過濾，濾掉土壤動物成體及卵，將準備好的土壤濾液20ml添加到去除土壤動物區(qū)系的原位土壤中，還原微生物區(qū)系O
[0046]3)作物種植:轉基因玉米NC6304YGRR和對照品種NC6304種子種植到步驟2)得到的土壤內(nèi)，每個品種設置5個重復。
[0047]4)根據(jù)未來氣候變化控制條件:將步驟3)種植植物后的容器置于氣候室，根據(jù)同時間日常溫度，控制氣候室內(nèi)溫度高于日常溫度2°C，具體為17-27°C，濕度為75-100%。
[0048]5) 土壤動物培養(yǎng):白符跳實驗培養(yǎng)在石膏:活性炭=9:1的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，添加啤酒酵母作為食物，全黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20± I°C，相對濕度接近100 %，每周用去離子水調節(jié)一次，保持整個培養(yǎng)基濕潤。同步化時需將三天內(nèi)產(chǎn)的卵收集到一起，于12日齡可以進行實驗，將實驗室培養(yǎng)的單一土壤動物類群10個個體添加到已經(jīng)種植的轉基因及對照品種的容器中。
[0049]6)取樣及分析植物正常農(nóng)作管理后，實驗開始的20天、35天、70天后進行采樣，計算單一物種數(shù)量，計算存活率、單一世代和多世代繁殖率，評估轉基因作物種植對單一土壤動物類群的適合度影響。
[0050]具體數(shù)據(jù)見表2，存活率及繁殖率計算公式為式(I)/(2)、(3)。式(I)中原本加入個體數(shù)為10頭。研究發(fā)現(xiàn)在去除土壤動物區(qū)系的玉米農(nóng)田土壤中，白符跳存活率與實例一中相同，同為100%，說明標準化土壤動物白符跳在此種土壤環(huán)境條件下存活正常。與實例一相同，證明未來氣候變化條件下，即增溫2°C和濕度增加25%，轉基因玉米種植對白符跳單一世代和二個世代后的繁殖率均無顯著影響。
[0051]表2、轉基因玉米NC6304YGRR和對照品種NC6304中跳蟲存活率、單一世代和多個世代繁殖率(平均值土標準誤差)，不同小寫字母表示顯著影響。
[0052]
【權利要求】
1.一種基于土壤動物區(qū)系去除的轉基因植物種植風險評價方法，其特征在于，包括步驟: 1)去除動物區(qū)系:將轉基因植物種植區(qū)農(nóng)田原位土壤取出后，過2mm篩，剔除大土塊，然后進行高溫滅菌，對整個動物區(qū)系進行去除，之后分裝到容器中，土壤填入1cm深； 2)添加土壤濾液:將土壤濾液20ml添加到去除土壤動物區(qū)系的原位土壤中，還原微生物區(qū)系； 3)植物種植:將轉基因植物和對照品種種子分別種植到步驟2)處理后得到的農(nóng)田土壤中； 4)添加試驗動物:在已種植轉基因植物及對照品種的容器中添加試驗動物，每個容器添加實驗室培養(yǎng)的單一土壤動物類群10頭個體； 5)取樣:添加試驗動物后20天、35天、70天進行取樣，利用體視鏡進行人工計數(shù)，采集試驗動物種群數(shù)量，計算存活率、單一世代和多世代繁殖率，比較種植轉基因植物和對照品種的土壤，評估轉基因植物種植對單一土壤動物類群適合度的影響。
2.根據(jù)權利要求1所述的轉基因植物種植風險評價方法，其特征在于，所述步驟I)高溫滅菌的條件為110-120°C，25-35min。
3.根據(jù)權利要求1所述的轉基因植物種植風險評價方法，其特征在于，所述步驟2)中土壤濾液按如下方法 制備:原位根際土 100g，加500ml蒸餾水攪勻后靜置24小時，依次用Imm, 180 μ m, 75 μ m, 45 μ m, 45 μ m和20 μ m孔徑的篩網(wǎng)進行過濾，濾掉土壤動物成體及卵。
4.根據(jù)權利要求1所述的轉基因植物種植風險評價方法，其特征在于，所述步驟3)中每個作物品種設置5個重復。
5.根據(jù)權利要求1-4任一所述的轉基因植物種植風險評價方法，其特征在于，所述步驟3)中植物種植后，將種植環(huán)境設置為植物和土壤動物的最適溫度和濕度重合區(qū)間，具體為溫度15-25 °C和濕度50% -75%。
6.根據(jù)權利要求1-4任一所述的轉基因植物種植風險評價方法，其特征在于，所述步驟3)中植物種植后，將種植環(huán)境設置為溫度增加2°C和濕度增加25%，具體為溫度17-27°C和濕度75% -100%。
7.根據(jù)權利要求1所述的轉基因植物種植風險評價方法，其特征在于，所述步驟4)中單一土壤動物的培養(yǎng)方法為:在石膏:活性炭=9:1的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，添加啤酒酵母作為食物，全黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20土 1°C，相對濕度90-100 %，每周用去離子水調節(jié)一次，保持整個培養(yǎng)基濕潤。
8.根據(jù)權利要求6所述的轉基因植物種植風險評價方法，其特征在于，單一土壤動物的培養(yǎng)后需要同步化，將三天內(nèi)產(chǎn)的卵收集到一起，卵孵化成幼蟲后的第12天，將幼蟲添加到已經(jīng)種植的轉基因植物及對照品種的容器中。
9.根據(jù)權利要求6所述的轉基因植物種植風險評價方法，其特征在于，所述單一土壤動物選自根結線蟲、跳蟲、變形蟲或螨蟲。
【文檔編號】A01G1/00GK104025843SQ201410216322
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月21日 優(yōu)先權日:2014年5月21日
【發(fā)明者】常亮, 宋新元, 王柏鳳, 吳東輝, 劉金文, 武奉慈, 劉娜, 龍麗坤, 王大銘 申請人:中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所, 吉林省農(nóng)業(yè)科學院