培養(yǎng)食用菌液體菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)基及液體菌種的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種食用菌液體菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，按照重量百分比包括：葡萄糖1.5％、玉米粉3％、蛋白胨0.2％、黃豆粉2％、MgSO4·7H2O0.1％、KH2PO40.1％、VB10.01％、豆油0.03％，余量為水。并提供一種食用菌液體菌種的制備方法，包括斜面菌種的活化、一級液體菌種的培養(yǎng)和液體發(fā)酵三個步驟。本發(fā)明的食用菌液體菌種生產(chǎn)方法，通過液體培養(yǎng)基配方優(yōu)化和發(fā)酵條件優(yōu)化等方案，能夠使液體菌種較固體菌種袋料栽培增產(chǎn)32.8％，污染率降低4％，節(jié)約制種時間，減少勞動力成本。
【專利說明】培養(yǎng)食用菌液體菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)基及液體菌種的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程【技術領域】，特別涉及一種培養(yǎng)食用菌液體菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)基及液體菌種的制備方法。
【背景技術】
[0002]隨著國內外市場對食用菌產(chǎn)品需求的增加，中國的食用菌產(chǎn)業(yè)以年均17%的速度增漲。食用菌生產(chǎn)方式由傳統(tǒng)的家庭作坊式操作、季節(jié)性生產(chǎn)的模式，逐漸向設施化、現(xiàn)代化、周年化、規(guī)?；a(chǎn)發(fā)展。生產(chǎn)方式的變革帶動了食用菌新技術、新工藝、新設備的開發(fā)。近年來，采用液體深層培養(yǎng)工藝制備食用菌液體菌種用于生產(chǎn)成為研發(fā)熱點，涌現(xiàn)出了許多液體發(fā)酵設備生產(chǎn)廠家及諸多在香菇、黑木耳、金針菇、平菇、灰樹花生產(chǎn)中采用液體菌種的報道。液體菌種在食用菌工廠化、周年化、規(guī)?；a(chǎn)總推廣應用，對于降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品質量具有顯著效果。日本、韓國在食用菌工廠化生產(chǎn)中，已普遍采用液體菌種。
[0003]比如，靈壽縣食用菌種植面積已達500萬平方米，年產(chǎn)量10萬噸，隨著食用菌種植規(guī)模的不斷發(fā)展，菌種的要求也將大大增加，每年需要固體原種40萬瓶，栽培種2000萬瓶，而需要如此大量的食用菌菌種，給農(nóng)民生產(chǎn)造成了許多困難，增加了大量的成本。而液體菌種具有五大優(yōu)勢:1、降低成本:每個栽培袋的液體菌種費只有固體菌種的五分之一，接種工效比固體接種高4-5倍；2、提高純度:液體菌種在完全無菌的密封環(huán)境中快速萌發(fā)，因而菌種純度高，確保出菇健壯；3、減少污染:液體菌種萌發(fā)速度超過了雜菌滋長速度，雜菌幾乎沒有滋生的機會，因此克服了雜菌污染的技術難題，保證了產(chǎn)品質量；4、快速萌發(fā)液體菌種具有流動滲透性，接種后各點萌發(fā)，生產(chǎn)速度快，比固體菌種可縮短1/2時間；5、效益顯著:液體菌種菌絲生長旺盛，菌齡短，出菇齊，質量與產(chǎn)量明顯高于傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式，因而贏得市場獲得效益。
[0004]鑒于此種情況，為了食用菌快速發(fā)展，研究開發(fā)適于食用菌生產(chǎn)的液體菌種，必將提高食用菌栽培的工業(yè)化水平，提高生產(chǎn)效率，增加農(nóng)民收入，促進食用菌產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，經(jīng)濟社會效益明顯。
[0005]但是，食用菌液體菌種在生產(chǎn)、接種和栽培中存在菌種活力低、污染率高、生產(chǎn)混亂等問題。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有技術的不足，提供一種菌種活力高、污染率低的食用菌液體菌種生產(chǎn)方法。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術方案如下:
[0008]一種食用菌液體菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，按照重量百分比包括:葡萄糖1.5%、玉米粉 3%、蛋白胨 0.2%、黃豆粉 2 %、MgSO4.7Η200.I %、KH2PO40.1 %、VB10.01 %、豆油0.03%，余量為水。[0009]其中，優(yōu)選地，所述食用菌為白靈菇或平菇-89。平菇-89即為平菇CCEF_(89)，是從國外品種中選育出的一個優(yōu)良菌株，它抗雜性強，產(chǎn)量高，質優(yōu)，該菌株已在河北、河南、山東、江蘇、陜西、山西及北京、天津等十幾個省市推廣栽種。
[0010]一種食用菌液體菌種的制備方法，包括以下步驟:
[0011]I)斜面菌種的活化:將斜面菌種置PDA培養(yǎng)基上，于25°C恒溫培養(yǎng)7天，作為一級菌種；
[0012]2) 一級液體菌種的培養(yǎng):將種子液體培養(yǎng)基置入300ml三角瓶中，每瓶的裝量為70~90ml，將種子液體培養(yǎng)基滅菌后在無菌環(huán)境下接種步驟I得到的一級菌種，置于搖床中培養(yǎng)7天；
[0013]3)液體發(fā)酵:將權利要求1所述的發(fā)酵液體培養(yǎng)基置入發(fā)酵罐中，將液體培養(yǎng)基滅菌后在無菌環(huán)境下接種步驟2所得的液體菌種，接種量按重量百分比計為培養(yǎng)基的8~12%，攪拌培養(yǎng)3天，制成菌絲體。
[0014]其中，優(yōu)選地，所述步驟2中采用的種子液培養(yǎng)基按重量百分比包括:玉米粉3%，麥麩 2%，葡萄糖 2%，蛋白陳 0.5%，MgSO4.7Η200.1%, KH2PO40.1%, VB11mg/!,豆油0.03%。
[0015]其中，優(yōu)選地，所述步驟2中的接種量按重量百比計，為培養(yǎng)基的8~12%。 [0016]其中，優(yōu)選地，所述步驟2中起始pH值為5.5~6.5，搖床轉速為200~220r/min。
[0017]其中，優(yōu)選地，所述步驟3中液體發(fā)酵的條件為:溫度為25°C，發(fā)酵罐壓力0.05MPa,攪拌槳轉速 160 ~200rpm,通氣量為 0.6 (V/V.min)。
[0018]其中，優(yōu)選地，所述食用菌為白靈菇或平菇-89。
[0019]在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳源是構成菌體細胞的重要物質，也是食用菌生命活動所需的主要能量來源。白靈菇或平菇-89對碳源的利用相當廣泛，既可以利用成分復雜的復合碳源，(玉米粉、淀粉等)，也可以利用單糖和雙糖等小分子碳源，如(葡萄糖、蔗糖等)，甚至可以吸收利用醇類，如(山梨醇)。液體培養(yǎng)若用單一的碳源，從菌絲干重考慮，單糖是葡萄糖最佳，而復合碳源中，玉米粉是最好的。從應用生產(chǎn)實際出發(fā)，玉米粉的價格遠遠低于葡萄糖的價格，從而玉米粉的經(jīng)濟效益遠遠高于葡萄糖的經(jīng)濟效益。
[0020]在白靈菇或平菇-89液體培養(yǎng)中，不同的碳源對菌絲體的形態(tài)有重要影響。其中，復合碳源的培養(yǎng)基能夠培養(yǎng)出大量的菌球，且菌球直徑較均勻一致，其中菌球直徑最小的是玉米粉培養(yǎng)基，菌球直徑平均為2.1mm,其次可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖。相比之下，小分子碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)出的以菌絲為多，菌球較少。究其原因，是因為復合碳源的成分較復雜，營養(yǎng)成分較豐富，且里面含有較多的固形物質，從而使培養(yǎng)基的黏度增加。由于在一定的范圍內，黏度增大有利于菌球的形成，過高或過低的黏度都不利于菌球的生長和繁殖。而小分子碳源，由于其能直接被菌絲吸收利用，在短期內即使菌絲分枝、延伸，菌絲生長以變粗變大為特征，從而在后期出現(xiàn)營養(yǎng)不足，并引起菌絲內部缺氧，形成較大的菌絲片段以致影響了菌球的形成。但觀察發(fā)現(xiàn)，用葡萄糖等小分子做碳源，在前期菌絲生長較旺盛，后期可能由于營養(yǎng)不足導致生物量有所下降。所以，將復合碳源與小分子碳源結合起來，效果最佳。
[0021]碳源是發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎，它既是細胞結構的重要組成成分，又是菌體產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物和細胞內貯藏物質的主要原料。在碳源選擇上，還要考慮碳源對菌球數(shù)的影響。復合碳源的菌球數(shù)明顯多于小分子碳源，最多的是玉米粉培養(yǎng)基的菌球數(shù)，最差的是山梨醇；產(chǎn)生此結果的原因，主要是復合碳源營養(yǎng)更豐富，不僅為白靈菇液體培養(yǎng)提供了碳源，其中還含有某些生長因子，從而更有利于白靈菇的生長。因為菌球數(shù)多，可以達到單位體積內有更多的發(fā)菌點，更有利于下一級的培養(yǎng)。
[0022]復合碳源中，玉米粉在生物量、菌球直徑以及菌球數(shù)方面都是最佳的碳源，而小分子則以葡萄糖最佳?？紤]到生產(chǎn)中的成本，本試驗確定以玉米粉為復合碳源，小分子以葡萄糖為碳源。由于復合碳源是緩慢利用的營養(yǎng)物質，而小分子碳源有快速被菌絲體吸收的特點，為了相互彌補不足，通過在復合碳源中添加小分子碳源來達到最佳碳源的效果。
[0023]氮源是食用菌細胞合成蛋白質和核酸必不可少的主要原料，在深層發(fā)酵過程中起著非常重要的作用。從白靈菇和平菇-89在黃豆粉、蛋白胨、麥麩中均能很好的生長，而在尿素、硫酸銨、硝酸鉀中生長不良，說明白靈菇對無機氮的利用不佳，其中以黃豆粉作為氮源時，菌絲生長量最高，蛋白胨次之。從經(jīng)濟方面考慮，黃豆粉作為農(nóng)產(chǎn)品來源方便，成本低廉等特點，同時蛋白胨作為生長因了有利于菌絲的生長。
[0024]在一級液體菌種培養(yǎng)條件中，起始pH值在5.5-6.5之間菌絲都能較好的生長，其中在pH值6.5時菌妊生長量最高。接種量小于10%時，隨著接種量的增加，生物量也增加，但超過10%時，由于菌絲體產(chǎn)量基本不受接種量的影響，因此確定10%的接種量為最佳。以SOmL裝液量所得的菌絲生物量為最高，高于SOmL的裝液量菌絲生物量有所下降，原因是裝液量多，則通氣量就少，培養(yǎng)基中溶解氧也少，無法滿足菌體旺盛生長的需要，導致生物量下。搖床轉速過低，使通氣量不足，從而使生物量較低，轉速為210r/min時生物量最大。
[0025]在液體發(fā)酵中，通氣量為0.6(v/v.π?η)時，菌球大而多，色橙黃，泡沫情況較為適中。菌絲接種量為8~12%時，菌體初期生長繁殖迅速，發(fā)酵周期短，到過發(fā)酵終點時，產(chǎn)生的副產(chǎn)物較少。且觀察到培養(yǎng)3d左右時，pH下降為最低3.5，觀察菌絲體發(fā)現(xiàn)此時菌絲生長旺盛，粗壯，菌絲球數(shù)量較多。因此，pH值在3.5左右作為判斷培養(yǎng)終點參考指標之一。
[0026]且在發(fā)酵初期溶解氧含量最大，隨著發(fā)酵的進行菌絲逐漸適應環(huán)境開始大量生長后，溶解氧開始逐漸下降。
[0027]本發(fā)明的液體菌種在12h以內用完活力最高，保存溫度10°C最佳，應在3天內用接種。
[0028]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的食用菌液體菌種生產(chǎn)方法，通過液體培養(yǎng)基配方優(yōu)化和發(fā)酵條件優(yōu)化等方案，能夠使液體菌種較固體菌種袋料栽培增產(chǎn)32.8%，污染率降低4%,節(jié)約制種時間,減少勞動力成本。
【具體實施方式】
[0029]下面對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0030]一種食用菌液體菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，按照重量百分比包括:葡萄糖1.5%、玉米粉 3%、蛋白胨 0.2%、黃豆粉 2 %、MgSO4.7Η200.I %、KH2PO40.1 %、VB10.01 %、豆油0.03%，余量為水。
[0031] 一種食用菌液體菌種的制備方法，包括以下步驟:[0032]I)斜面菌種的活化:將斜面菌種置PDA培養(yǎng)基上，于25°C恒溫培養(yǎng)7天，作為一級菌種；
[0033]2) 一級液體菌種的培養(yǎng):將種子液體培養(yǎng)基置入300ml三角瓶中，每瓶的裝量為70~90ml，將種子液體培養(yǎng)基滅菌后在無菌環(huán)境下接種步驟I得到的一級菌種，置于搖床中培養(yǎng)7天；
[0034]3)液體發(fā)酵:將權利要求1所述的發(fā)酵液體培養(yǎng)基置入發(fā)酵罐中，將液體培養(yǎng)基滅菌后在無菌環(huán)境下接種步驟2所得的液體菌種，接種量按重量百分比計為培養(yǎng)基的8~12%，攪拌培養(yǎng)3天，制成菌絲體。
[0035]液體菌種的制作及其栽培的工藝流程:斜面菌種一一級液體菌種的培養(yǎng)一液體菌種一接到栽培料中并進行培養(yǎng)一栽培管理一出菇。
[0036]供試栽培料配方:玉米芯40 %、木屑40 %、玉米面8 %、稻糠8 %、石膏I %、過磷酸鈣1%，糖2%，磷酸二氫鉀0.2%、含水率60%，pH值為6.5。
[0037]將栽培袋為17 X 33cm，厚度為0.045cm的聚內烯塑料袋，每袋裝料為400g。把栽培料裝到袋中，用食指把袋的兩個角壓入袋內，壓緊培養(yǎng)料，然后繼續(xù)裝料并用乎壓實，裝滿后，在袋中間用錐形木棒扎一孔，拔出木棒，目的是可以將液體菌種倒入培養(yǎng)基里面。然后將栽培袋高壓滅菌，滅菌冷卻后，在無菌環(huán)境下接液體菌種。
[0038]實施例1
[0039]一種白靈 菇液體菌種的制備方法，包括以下步驟:
[0040]I)斜面菌種的活化:將斜面菌種置PDA培養(yǎng)基上，于25°C恒溫培養(yǎng)7天，作為一級菌種；
[0041]2) 一級液體菌種的培養(yǎng):將種子液體培養(yǎng)基置入300ml三角瓶中，每瓶的裝量為80ml，將種子液體培養(yǎng)基滅菌后在無菌環(huán)境下接種步驟I得到的一級菌種，接種量按重量百比計，為培養(yǎng)基的8~12%，置于搖床中培養(yǎng)7天；種子液體培養(yǎng)基為:玉米粉3%，麥麩2%，葡萄糖 2%，蛋白陳 0.5%，MgSO4.7Η200.1%, KH2PO40.1%, VB11mg/!,豆油 0.03%。起始PH值為5.5，搖床轉速為210r/min。
[0042]3)液體發(fā)酵:將液體發(fā)酵培養(yǎng)基置入發(fā)酵罐中，將液體培養(yǎng)基滅菌后在無菌環(huán)境下接種步驟2所得的液體菌種，接種量按重量百分比計為培養(yǎng)基的10%，攪拌培養(yǎng)3天，制成菌絲體。液體發(fā)酵的條件為:溫度為25°C，發(fā)酵罐壓力0.05MPa，攪拌槳轉速180rpm，通氣量為 0.6 (V/V.min)。
[0043]液體種子培養(yǎng)基:葡萄糖1.5 %、玉米粉3 %、蛋白胨0.2 %、黃豆粉2 %、MgSO4.7Η200.I %, KH2PO40.HVB10.01 %、豆油 0.03%，余量為水。
[0044]實施例2
[0045]一種白靈菇液體菌種的制備方法，包括以下步驟:
[0046]I)斜面菌種的活化:將斜面菌種置PDA培養(yǎng)基上，于25°C恒溫培養(yǎng)7天，作為一級菌種；
[0047]2) 一級液體菌種的培養(yǎng):將種子液體培養(yǎng)基置入300ml三角瓶中，每瓶的裝量為70ml，將種子液體培養(yǎng)基滅菌后在無菌環(huán)境下接種步驟I得到的一級菌種，接種量按重量百比計，為培養(yǎng)基的12%，置于搖床中培養(yǎng)7天；種子液體培養(yǎng)基為:玉米粉3%，麥麩2%，葡萄糖 2%，蛋白陳 0.5%，MgSO4.7Η200.1%, KH2PO40.1%, VB11mg/!,豆油 0.03%。起始pH值為6.0，搖床轉速為200r/min。
[0048]3)液體發(fā)酵:將液體發(fā)酵培養(yǎng)基置入發(fā)酵罐中，將液體培養(yǎng)基滅菌后在無菌環(huán)境下接種步驟2所得的液體菌種，接種量按重量百分比計為培養(yǎng)基的8%，攪拌培養(yǎng)3天，制成菌絲體。液體發(fā)酵的條件為:溫度為25°C，發(fā)酵罐壓力0.05MPa，攪拌槳轉速160rpm，通氣量為 0.6 (V/V.min)。
[0049]液體種子培養(yǎng)基:葡萄糖1.5 %、玉米粉3 %、蛋白胨0.2 %、黃豆粉2 %、MgSO4.7Η200.I %, KH2PO40.HVB10.01 %、豆油 0.03%，余量為水。
[0050]實施例3
[0051]一種白靈菇液體菌種的制備方法，包括以下步驟:
[0052]I)斜面菌種的活化:將斜面菌種置PDA培養(yǎng)基上，于25°C恒溫培養(yǎng)7天，作為一級菌種；
[0053]2) 一級液體菌種的培養(yǎng):將種子液體培養(yǎng)基置入300ml三角瓶中，每瓶的裝量為90ml，將種子液體培養(yǎng)基滅菌后在無菌環(huán)境下接種步驟I得到的一級菌種，接種量按重量百比計，為培養(yǎng)基的8%，置于搖床中培養(yǎng)7天；種子液體培養(yǎng)基為:玉米粉3%，麥麩2%，葡萄糖 2%，蛋白陳 0.5%，MgSO4.7Η200.1%, KH2PO40.1%, VB11mg/!,豆油 0.03%。起始pH值為6.5，搖床轉速為220r/min。
[0054]3)液體發(fā)酵:將液體發(fā)酵培養(yǎng)基置入發(fā)酵罐中，將液體培養(yǎng)基滅菌后在無菌環(huán)境下接種步驟2所得的液體菌種，接種量按重量百分比計為培養(yǎng)基的12%，攪拌培養(yǎng)3天，制成菌絲體。液體發(fā)酵的條件為:溫度為25°C，發(fā)酵罐壓力0.05MPa，攪拌槳轉速200rpm，通氣量為 0.6 (V/V.min)。
[0055]液體種子培養(yǎng)基:葡萄糖1.5 %、玉米粉3 %、蛋白胨0.2 %、黃豆粉2 %、MgSO4.7Η200.I %, KH2PO40.HVB10.01 %、豆油 0.03%，余量為水。
[0056]上述實施例制的白靈菇液體菌種質量技術指標如表1所示:
[0057]表1白靈菇液體菌種質量技術指標
[0058]
【權利要求】
1.一種食用菌液體菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，按照重量百分比含有:葡萄糖 1.5%、玉米粉3%、蛋白胨0.2%、黃豆粉2%、]\%504.7Η200.IKH2PO40.HVB10.01%,豆油0.03%，余量為水。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種食用菌液體菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于:所述食用菌為白靈菇或平菇-89。
3.一種食用菌液體菌種的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)斜面菌種的活化:將斜面菌種置PDA培養(yǎng)基上,于25°C恒溫培養(yǎng)7天，作為一級菌種； 2)一級液體菌種的 培養(yǎng):將種子液體培養(yǎng)基置入300ml三角瓶中，每瓶的裝量為70~90ml，將種子液體培養(yǎng)基滅菌后在無菌環(huán)境下接種步驟I得到的一級菌種，置于搖床中培養(yǎng)7天； 3)液體發(fā)酵:將權利要求1所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基置入發(fā)酵罐中，將液體培養(yǎng)基滅菌后在無菌環(huán)境下接種步驟2所得的液體菌種，接種量按重量百分比計為培養(yǎng)基的8~12%，攪拌培養(yǎng)3~7天，制成菌絲體。
4.根據(jù)權利要求3所述的一種食用菌液體菌種的制備方法，其特征在于，所述步驟2中采用的種子液培養(yǎng)基按重量百分比含有:玉米粉3 %，麥麩2 %，葡萄糖2 %，蛋白陳0.5 %，MgSO4.7Η200.I %, KH2PO40.1 %，VB11mg/!,豆油 0.03%。
5.根據(jù)權利要求3所述的一種食用菌液體菌種的制備方法，其特征在于，所述步驟2中的接種量按重量百比計，為培養(yǎng)基的8~12%。
6.根據(jù)權利要求3所述的一種食用菌液體菌種的制備方法，其特征在于，所述步驟2中起始PH值為5.5~6.5，搖床轉速為200~220r/min。
7.根據(jù)權利要求3所述的一種食用菌液體菌種的制備方法，其特征在于，所述步驟3中液體發(fā)酵的條件為:溫度為25°C，發(fā)酵罐壓力0.05MPa，攪拌槳轉速160~200rpm，通氣量為 0.6 (V/V.min)。
8.根據(jù)權利要求3~7所述的一種食用菌液體菌種的制備方法，其特征在于，所述食用菌為白靈菇或平菇-89。
【文檔編號】C05G1/00GK104025903SQ201410218431
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月22日 優(yōu)先權日:2014年5月22日
【發(fā)明者】李俊九 申請人:河北綠地久樂生物科技股份有限公司