防治植物真菌病害的生防菌株g58及其菌劑制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了防治植物真菌病害的生防菌G58及其菌劑制備方法和應(yīng)用。該生防菌命名為BacillusamyloliquefaciensG58，保藏號(hào)CGMCCNO.8977；該生防菌菌劑的制備方法為將活化后的菌株G58接種于NA培養(yǎng)液培養(yǎng)22～26h獲得種子液，將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)48～72h獲得發(fā)酵液，即為生防菌菌劑；含菌株G58的生防菌劑對(duì)于水稻紋枯病表現(xiàn)出顯著的防治效果，防效可達(dá)73.6%。菌株G58具有抗菌譜廣，定植能力強(qiáng)，效果穩(wěn)定，制備成本低，應(yīng)用方法簡(jiǎn)單，環(huán)境友好，無(wú)毒害等特點(diǎn)，在植物真菌病害防治方面具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】防治植物真菌病害的生防菌株G58及其菌劑制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及防治植物真菌病害的生防菌株G58及其菌劑制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)，每年由于糧食、蔬菜等作物病害問題引起的作物損失至少有10%~15%，而其中70%~80%的植物病害均是由真菌引起的。一種作物上可發(fā)現(xiàn)幾種甚至幾十種真菌病害。許多病原真菌形成特殊的組織或孢子可耐受環(huán)境的變化，經(jīng)歷嚴(yán)寒和酷暑。真菌在田間主要通過(guò)氣流、水流傳播；此外,風(fēng)、雨、昆蟲也可傳播真菌病害。因此，病原真菌較難控制，容易廣泛傳播。由于真菌性病害的特點(diǎn)和傳播途徑，目前一般多采用化學(xué)藥劑進(jìn)行保護(hù)性防治，或通過(guò)改進(jìn)栽培管理措施加以防治。
[0003]化學(xué)防治方法簡(jiǎn)單，效果顯著。然而化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用已經(jīng)帶了一系列嚴(yán)重的負(fù)面影響。出現(xiàn)了土壤和農(nóng)產(chǎn)品中大量農(nóng)藥殘留，農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量下降；土壤中大量有益微生物被殺死，產(chǎn)生了抗藥性病原微生物，病害防治更加困難等問題。目前農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和農(nóng)產(chǎn)品安全問題備受關(guān)注，這就要生產(chǎn)者在利用土地環(huán)境資源的同時(shí)要保護(hù)和改善環(huán)境；保證農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量的同時(shí)更要關(guān)注農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量和安全。植物病害的生物防治是由英國(guó)植物病害學(xué)家Garrett于1965年提出的。生物防治是以生態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)防治植物病害?？梢员苊饣瘜W(xué)防治帶來(lái)的一系列植保、環(huán)境等問題。減少了化學(xué)農(nóng)藥的殘留，提高了農(nóng)產(chǎn)品安全性，促進(jìn)了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。芽孢桿菌是目前生物防治中應(yīng)用最為廣泛的微生物。芽孢桿菌可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，分泌抗菌物質(zhì)，溶菌作用以及誘導(dǎo)抗性等機(jī)制產(chǎn)生抗病作用。芽孢桿菌中研究最為透徹的是枯草芽孢桿菌，用枯草芽孢桿菌制備生防制劑防治植物病害的研究始終是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。而近年來(lái)解淀粉芽孢桿菌也被報(bào)到具有抗病、促生等作用，因此解淀粉芽孢桿菌在生物防治方面也受到越來(lái)越多的關(guān)注。
[0004]水稻紋枯病是由真菌立枯絲核菌ijihizoctonia soIaniKuhn)引起的水稻最主要的病害之一。水稻紋枯病以其常發(fā)性和對(duì)水稻產(chǎn)量造成的巨大損失而越來(lái)越受到重視，長(zhǎng)江以南許多省份已將其列為水稻生產(chǎn)上的第一大病害。該病一般減產(chǎn)10%~30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50%。考慮到健康和環(huán)境因素，歐盟已于2002年禁止使用井R霉素。因此，為了提高綜防效益，很有必要探索新的針對(duì)水稻紋枯病的防治策略。利用生防菌是水稻紋枯病防治的重要途徑，具有廣泛的應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問題，植物病害多發(fā)，防治困難，成本較高，化學(xué)農(nóng)藥殘留嚴(yán)重，土壤微生物區(qū)系被破壞，農(nóng)作物安全等問題，本發(fā)明提供了效果穩(wěn)定、定植能力強(qiáng)，抗菌譜廣，無(wú)環(huán)境污染的防治植物病害的生防菌株G58。
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一株新菌種:解淀粉芽孢桿舊(Mcillusamyloli quefaci ens ) G58。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述菌株在植物病害防治過(guò)程中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種含有amyloli quefaci e/75G58的植物病害防治劑。
[0009]本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供生防菌株菌劑的制備方法。
[0010]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種植物真菌病害生防菌株G58，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)年2於28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8977，建議的分類命名為及^/77心amy1liquefaciens^,已于2014年3月28日鑒定保藏的菌株是存活的。
[0011]上述生防菌株ifeci77i/5.amyloli quefaci e/75G58在植物病害防治過(guò)程中的應(yīng)用。
[0012]進(jìn)一步的，上述植物病害為植物真菌病害。
[0013]一種植物病害防治劑，其含有上述的植物真菌病害生防菌株Bacillusamyloli quefaci ensu'd。
[0014]生防菌株ifeci77i/5.<3〃?_77ο7Υ<7--?/<3--Υ--/75.658菌劑的制備方法,包括以下步驟:將生防菌株G58接種于NA平板在29~31°C條件下活化，將活化后的生防菌株G58接種于NA培養(yǎng)液，29~31°C，105~115 rpm條件下培養(yǎng)22~26h，獲得種子液；將種子液按1%~3%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30~37°C，15(Tl80rpm條件下培養(yǎng)48~72 h，獲得發(fā)酵液，即生防菌株amyloli quefaci (6/75658 菌劑。
[0015]進(jìn)一步的，上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方含有0.8~1.2g/L蔗糖、8~12 g/L酵母粉、0.6~1 g/L KCl, pH 為 5~6。
[0016]本發(fā)明的有益效果是:
I)本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌菌株G58菌劑制備過(guò)程簡(jiǎn)單，成本較低，無(wú)毒害，無(wú)環(huán)境污染，可替代或減少對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的應(yīng)用，減少農(nóng)藥殘留，定植能力強(qiáng)，改善土壤微生物環(huán)境，提高農(nóng)產(chǎn)品安全性。
[0017]2)本發(fā)明的生防菌株G58在試驗(yàn)室平板拮抗試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的競(jìng)爭(zhēng)抑制效果，極大程度的抑制了植物真菌病原菌生長(zhǎng)。競(jìng)爭(zhēng)抑制可以避免因抑菌物質(zhì)的分解帶來(lái)抑菌效果下降或消失的問題。同時(shí)，該菌也可產(chǎn)生抑菌物質(zhì)抑制植物真菌病原菌的生長(zhǎng)。
[0018]3)本發(fā)明的生防菌株G58在溫室試驗(yàn)結(jié)果中表明:含本發(fā)明所述的生防菌株G58的生防菌劑有效抑制了真菌病原菌的生長(zhǎng)，對(duì)于水稻紋枯病表現(xiàn)出顯著的防治效果，防效可達(dá)73.6%ο

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為生防菌株G58抑制水稻紋枯病(TPAizoc1flia平板拮抗試驗(yàn)。

【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
[0021]實(shí)施例1
一、生防菌株G58的分離、篩選和鑒定
一種植物真菌病害生防菌株G58，命名為amyloliquefaciensQ^,由廣東省增城市附近水稻田土壤分離得到。其具體分離、篩選、鑒定方法如下:
(O生防菌株G58的分離
稱取10.0 g混合均勻的土壤樣品,加入90 ml無(wú)菌水,于30 ° C, 180 rpm下,振蕩30min，制成KT1菌懸液，再稀釋成梯度為10_2~10_6的菌懸液，吸取適當(dāng)梯度的菌懸液100μι均勻涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂(10_5、10_6)平板上，每個(gè)稀釋度重復(fù)三次，于30 ° C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I~2 d。按照細(xì)菌形狀，大小，色澤等生理性狀的不同，挑取單菌落再涂平板直到獲得單一形態(tài)的菌株，最后通過(guò)鏡檢，進(jìn)一步觀察其形態(tài)，確為單一形態(tài)即為純化，純化后4° C冷藏備用。
[0022](2)生防菌株G58的篩選
采用平板拮抗試驗(yàn)方法進(jìn)行生防菌株的篩選。
[0023]吸取濃度為I X 105CFU/ml的植物真菌病原菌菌液100 μL放入PDA平板中涂布均勻，利用無(wú)菌打孔器在平板上打3個(gè)孔，每孔中分別注入在30 ° C培養(yǎng)24h的不同分離菌株的培養(yǎng)液50μ1,每個(gè)處理重復(fù)三次。30 ° C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~5 d后,觀察有無(wú)抑菌圈，計(jì)算抑菌活性。
[0024]抑菌活性用抑菌圈直徑表示:抑菌圈直徑=透明圈直徑一孔徑(8 mm)。
[0025]將具有抑菌活性的菌株在NA平板上連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)10次(每隔7 d一次)，測(cè)定每次繼代培養(yǎng)菌株的拮抗效果。
[0026]根據(jù)對(duì)水稻紋枯病、柑橘炭疽病、辣椒炭疽病、玉米炭疽病、番茄葉霉病、小麥赤霉病、冬瓜枯萎病、甘蔗黑腐病、棉花黃萎病、油菜菌核病等的抑菌活性以及傳代后抑菌活性的穩(wěn)定性，篩選出一株效果穩(wěn)定的廣譜抗植物真菌病害菌株，將菌株純化后，用50%的甘油保存于_70°C超低溫冰箱。
[0027](3)生防菌株G58的鑒定
經(jīng)形態(tài)、染色、生理生化反應(yīng)及分子生物學(xué)鑒定為Bacillus amyloliquefaciens，命名為 G58。
[0028]a.防治植物真菌病害的解淀粉芽孢桿菌G58的形態(tài)特征
觀察經(jīng)NA平板劃線培養(yǎng)24h后形成的單菌落形態(tài)特征可知，GB58菌落形態(tài)較小、邊緣不整齊、表面無(wú)凸起、干燥、不透明，呈乳白色。液體靜止培養(yǎng)時(shí)有菌膜形成。通過(guò)革蘭氏染色、芽孢及鞭毛染色，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈短桿狀、革蘭氏陽(yáng)性菌、中生芽孢、周生鞭毛。
[0029]b.本發(fā)明的防治植物真菌病害的解淀粉芽孢桿菌G58生理生化特征(見表1) 需氧性，葡萄糖發(fā)酵型，接觸酶、淀粉水解、硝酸鹽還原、酪朊水解、明膠水解、糖醇類發(fā)酵、M.R.和V-P試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性；檸檬酸鹽水解、纖維素分解和酪氨酸水解試驗(yàn)結(jié)果為陰性。
[0030]表1生防菌株G58的生理生化特征

【權(quán)利要求】
1.一種防治植物真菌病害的生防菌株ifeci77i/5.amyloliquefaciens G58,保藏在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，其保藏號(hào)為CGMCC N0.8977。
2.權(quán)利要求1所述的生防菌株amyloliquefaci ens G58在植物病害防治過(guò)程中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的植物病害為植物真菌病害。
4.一種植物病害防治劑，其特征在于:所述防治劑中含有權(quán)利要求1所述的植物真菌病害生防菌株amyloli quefaci ens G58。
5.權(quán)利要求1所述的生防菌株amyloliquefaci ens G58菌劑的制備方法,其特征在于:包括以下步驟:將權(quán)利要求1所述的生防菌株G58接種于NA平板在29~31°C條件下活化，將活化后的生防菌株G58接種于NA培養(yǎng)液，29~31°C，105~115 rpm條件下培養(yǎng)22~26h，獲得種子液； 將種子液按廣3%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30~37°C，150~180rpm條件下培養(yǎng)48~72 h,獲得發(fā)酵液，即生防菌株amyloli quefaci ensG58菌劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生防菌株amyloliquefaci ens G58菌劑的制備方法，其特征在于:所述的發(fā)酵培養(yǎng)基配方含有0.8~1.2g/L蔗糖、8~12 g/L酵母粉、0.6~1 g/L KCl, pH 為 5~6。
【文檔編號(hào)】A01P3/00GK104164382SQ201410246750
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】顧文杰 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所