叢枝菌根真菌和根瘤菌雙接種促進(jìn)豆科植物吸收礦物磷的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】叢枝菌根真菌和根瘤菌雙接種促進(jìn)豆科植物吸收礦物磷的應(yīng)用，屬于豆科植物的培養(yǎng)方法【技術(shù)領(lǐng)域】。該應(yīng)用中單株豆科植物中叢枝菌根真菌接種菌量為30～50個(gè)孢子/ml，根瘤菌接種量為濃度1.0×109cfu.mL-1的根瘤菌菌液5～15mL。該應(yīng)用中礦物磷含量為每kg豆科植物培養(yǎng)基質(zhì)中含有0.1～0.2g難溶性磷，難溶性磷為有效磷含量為0.67g/kg的磷礦粉。本發(fā)明為叢枝菌根真菌和根瘤菌雙接種豆科植物吸收難溶性礦物質(zhì)提供了理論依據(jù)，為減少化學(xué)肥料使用及促進(jìn)豆科植物更好地利用營養(yǎng)物質(zhì)提供了理論依據(jù)。
【專利說明】叢枝菌根真菌和根瘤菌雙接種促進(jìn)豆科植物吸收礦物磷的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于豆科植物的培養(yǎng)方法【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及叢枝菌根菌和根瘤菌雙接種促進(jìn)豆科植物吸收礦物磷的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]叢枝菌根(arbuscular mycorrhiza, AM)真菌是一類內(nèi)生菌根真菌，廣泛存在于土壤中，能與陸地上90%以上的植物根系形成共生體，其宿主包括苔蘚植物、蕨類植物、裸子植物和被子植物。同時(shí)AM真菌的根外菌絲可以從外界環(huán)境中吸收水分和礦質(zhì)元素，促進(jìn)植物生長，改善植物營養(yǎng)狀況。根瘤菌是革蘭氏陰性細(xì)菌，廣泛分布于土壤中，可與相應(yīng)的豆科植物根系共生，侵染豆科植物的根部形成根瘤，進(jìn)而將空氣中的分子態(tài)氮轉(zhuǎn)化為植物可利用的氨。研究表明，豆科植物根系周圍生長著大量的AM真菌和根瘤菌，它們在長期的進(jìn)化過程中形成了 AM真菌-豆科植物-根瘤菌三重共生體系，從而為豆科植物的生長提供了豐富的營養(yǎng)。
[0003]磷素是植物所必需的，對(duì)于豆科植物來說，磷酸鹽濃度的高低影響著植物的生長和有效根瘤的形成，且相對(duì)較高的磷水平有利于根瘤的形成和氮的固定。但大田土壤中90%的磷素是難溶性的，植物不能直接吸收利用，施用過多磷肥又會(huì)造成營養(yǎng)流失，環(huán)境污染。AM真菌作為內(nèi)生菌根真菌，可與90%的植物形成共生體系，并可通過增加植物根際土壤中磷酸酶活性，增加植物對(duì)土壤中磷素的吸收，滿足根瘤生長和固氮作用對(duì)磷的需求。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供利用叢枝菌根真菌和根瘤菌雙接種促進(jìn)豆科植物吸收難溶性磷的方法的技術(shù)方案。
[0005]所述的叢枝菌根真菌和根瘤菌雙接種促進(jìn)豆科植物吸收礦物磷的應(yīng)用。
[0006]所述的應(yīng)用，其特征在于所述的單株豆科植物中叢枝菌根真菌接種菌量為30~50個(gè)孢子/ml，根瘤菌接種量為濃度1.0X 19Cfu.mL—1的根瘤菌菌液5~15 mL。
[0007]所述的應(yīng)用，其特征在于所述的叢枝菌根真菌為根內(nèi)球囊霉，來自根內(nèi)球囊霉與發(fā)根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根建立的共生系統(tǒng)，所述的根瘤菌經(jīng)YMA斜面培養(yǎng)基活化及YMA液體培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)獲得。
[0008]所述的應(yīng)用，其特征在于礦物磷含量為:每kg豆科植物培養(yǎng)基質(zhì)中含有0.1~
0.2g難溶性磷，所述的難溶性磷為有效磷含量為0.67g/kg的磷礦粉。
[0009]所述的應(yīng)用，其特征在于所述的根內(nèi)球囊霉與發(fā)根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根建立的共生系統(tǒng)為:以發(fā)根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根作為宿主。
[0010]本發(fā)明通過對(duì)叢枝菌根真菌和根瘤菌雙接種豆科植物的試驗(yàn)，得到了叢枝菌根真菌和根瘤菌雙接種能夠促進(jìn)豆科植物吸收難溶性磷的用途，為叢枝菌根真菌和根瘤菌雙接種豆科植物吸收難溶性礦物質(zhì)提供了理論依據(jù)，為減少化學(xué)肥料使用及促進(jìn)豆科植物更好地利用營養(yǎng)物質(zhì)提供了理論依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為三室隔離培養(yǎng)盒的示意圖；
圖2為不同濃度磷礦粉對(duì)莖葉總磷含量的影響圖。
[0012]圖2中磷礦粉中的有效磷含量為0.67g/kg，設(shè)置每kg河沙中0、0.06、0.12、和
0.24g磷礦粉，分別用P0、P1、P2、P3表示。
【具體實(shí)施方式】
[0013]以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)施例
[0014](I)育苗處理
選取籽粒飽滿的綠豆種子，10%H202消毒10 min，蒸餾水反復(fù)沖洗干凈后播種于盛有滅菌蛭石的培養(yǎng)杯中，置于智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待種子萌發(fā)，植株長出兩片真葉后選取長勢一致的綠豆苗進(jìn)行移栽。
[0015](2)菌劑的制備
將AM真菌根內(nèi)球囊霉iGlomus.1ntraradices)與毛根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根建立的共生系統(tǒng)倒入粉碎機(jī)中粉碎，然后倒入400目篩子中用自來水反復(fù)沖洗至培養(yǎng)基消失。漂洗干凈后，用蒸餾水稀釋到每毫升30~50個(gè)孢子后倒入試劑瓶，內(nèi)含有侵染根，孢子和菌絲。根瘤菌在YMA斜面培養(yǎng)基上活化后，后轉(zhuǎn)接到盛于200mLYMA液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，置于搖床上培養(yǎng)。
[0016](3)培養(yǎng)方法
將育好的綠豆苗轉(zhuǎn)移到三室隔離培養(yǎng)盒中(如圖1所示)，三室隔離培養(yǎng)盒是由不銹鋼的白色鐵皮制作，兩層孔徑大小為38 μ m的尼龍網(wǎng)將培養(yǎng)盒分成菌根室1、隔離室2和菌絲室3。菌絲室3的體積為5 cmX 10 cmX 13 cm,菌根室I的體積為3 cmX 10 cmX 10 cm,隔離室2的體積僅為I cmX 10 cmX 10 cm,并且隔離室2的尼龍網(wǎng)只允許菌絲通過而不允許植物根通過進(jìn)入菌絲室3，這樣有效地減少了菌根室和菌絲室之間的營養(yǎng)物質(zhì)流動(dòng)。同時(shí)菌根室I比菌絲室3高3cm，進(jìn)一步限制了兩室之間的營養(yǎng)物質(zhì)流動(dòng)。菌根室I中的培養(yǎng)基質(zhì)為滅菌的河沙，該河沙經(jīng)自來水反復(fù)沖洗后再用去離子水沖洗，然后IX 15 Pa滅菌2 h得到。
[0017]因根瘤菌是細(xì)菌，不能產(chǎn)生菌絲，不能透過隔離層吸收菌絲室的營養(yǎng)物質(zhì)，故本試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理，接種根瘤菌、AM真菌及根瘤菌和AM真菌雙接種。AM真菌接種菌劑為2 mL(孢子數(shù)約為60~100個(gè))，根瘤菌菌液5~15 mL (濃度約1.0X 109cfu.mL—1)，在接種根瘤菌之前先用根瘤菌菌液浸泡根5min,后都置于智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),光照溫度為25 °C,夜間溫度為18°C。每隔6d向菌根室加5mL的Hoagland限氮限磷營養(yǎng)液(如表1)。30d后往菌絲室施加滅菌河沙，繼續(xù)培養(yǎng)10d，保證菌根室I的菌絲可以延伸進(jìn)入到菌絲室3，在此培養(yǎng)過程中每隔6d在菌根室I和菌絲室3加入5mL的Hoagland限氮限磷營養(yǎng)液。
[0018] 表1 Hoagland限氮限磷營養(yǎng)液
【權(quán)利要求】
1.叢枝菌根真菌和根瘤菌雙接種促進(jìn)豆科植物吸收礦物磷的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的單株豆科植物中叢枝菌根真菌接種菌量為30~50個(gè)孢子/ml，根瘤菌接種量為濃度1.0X 19Cfu.mL—1的根瘤菌菌液5~15 mL。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的叢枝菌根真菌為根內(nèi)球囊霉，來自根內(nèi)球囊霉與發(fā)根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根建立的共生系統(tǒng)，所述的根瘤菌經(jīng)YMA斜面培養(yǎng)基活化及YMA液體培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)獲得。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于礦物磷含量為:每kg豆科植物培養(yǎng)基質(zhì)中含有0.1~0.2g難溶性磷，所述的難溶性磷為有效磷含量為0.67g/kg的磷礦粉。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的根內(nèi)球囊霉與發(fā)根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根建立 的共生系統(tǒng)為:以發(fā)根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根作為宿主。
【文檔編號(hào)】A01G31/00GK104025983SQ201410247847
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月6日
【發(fā)明者】金海如, 刁亞南 申請(qǐng)人:浙江師范大學(xué)