一種與香稻香氣含量相關(guān)的基因OsPRO及其編碼蛋白的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了與香稻香氣含量相關(guān)基因OsPRO及其編碼蛋白的應(yīng)用。所述基因OsPRO的cDNA核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；基因OsPRO編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。所述應(yīng)用是指基因OsPRO及其編碼蛋白在改善香稻香氣含量上應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入該基因的香稻的香氣含量明顯增加，并明確了OsPRO基因增加香稻香氣含量的機(jī)制，可以將香稻OsPRO基因插入到植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，制備成重組表達(dá)載體，進(jìn)一步構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明對(duì)生產(chǎn)上培育濃香型的香稻品種，以及通過轉(zhuǎn)基因的方法調(diào)控香稻的香氣含量具有很大的指導(dǎo)應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】—種與香稻香氣含量相關(guān)的基因OsPRO及其編碼蛋白的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體地，涉及一種與香稻香氣含量相關(guān)的基因OsPRO及其編碼蛋白的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]香稻通常稱作香米，是水稻中的珍品，香稻米富含各種微量元素、氨基酸和蛋白質(zhì)。尤其是八種必須氨基酸的含量很豐富，表現(xiàn)出優(yōu)良的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)?，F(xiàn)今市場(chǎng)上銷售價(jià)高、米質(zhì)好的名牌米都摻有香米，香米不僅具有食用意義，而且有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值(游晴如和黃庭旭.稻米香味的研究與育種利用.福建稻麥科技，2003，20 (3):30-33)。盡管香米的銷售價(jià)格比常規(guī)優(yōu)質(zhì)米高2倍多，但世界香米的消費(fèi)量仍在逐年增長(zhǎng)，已引起世界各稻米生產(chǎn)國(guó)科研人員的高度重視。所以近年來，印度、巴基斯坦、日本、韓國(guó)、泰國(guó)、澳大利亞、中國(guó)臺(tái)灣省、南非和孟加拉國(guó)等，正在加強(qiáng)香稻品種的選育進(jìn)程，以便搶占國(guó)際香稻交易市場(chǎng)(謝黎虹等.泰國(guó)的香稻.中國(guó)農(nóng)業(yè)信息，2004，⑶:16-17)。
[0003]近年來隨著人民生活水平的不斷提高，我國(guó)對(duì)香米的需求量逐年增加引起我國(guó)對(duì)香稻研究的重視。特別是加入WTO后大米是我國(guó)糧食中唯一在貿(mào)易自由化過程中受益的產(chǎn)品，從發(fā)展趨勢(shì)看，我國(guó)將是優(yōu)質(zhì)米市場(chǎng)的最主要受益者(楊庚.我國(guó)優(yōu)質(zhì)稻米開發(fā)現(xiàn)狀與發(fā)展.中國(guó)稻米，2001，(5):11_12)，因此抓住機(jī)遇開發(fā)香稻生產(chǎn)，提高種稻效益，對(duì)富國(guó)強(qiáng)民具有重要的現(xiàn)實(shí)意 義。鑒于香稻具有較高的食用價(jià)值和極好的市場(chǎng)走向，十分有必要開展香稻香氣的研究，以提高我國(guó)稻米在國(guó)際稻米市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力，推進(jìn)我國(guó)水稻產(chǎn)業(yè)化，增加農(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入。
[0004]宋文昌等認(rèn)為控制香稻香氣性狀的是單隱性基因(宋文昌等.同源四倍體和二倍體水稻香味的遺傳分析.作物學(xué)報(bào)，1989，15 (3):273~277)。任光俊等分析了 ScentedIemont等香稻品種的遺傳特點(diǎn)，結(jié)果表明，無香味為顯性性狀，并表現(xiàn)胚乳直感現(xiàn)象(任光俊和李青茂.水稻香味的遺傳.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，12(3):392-395)。顧銘洪等認(rèn)為米香味受一對(duì)隱性主基因控制，有一些微效基因參與作用，在某些組合中表現(xiàn)出劑量效應(yīng)(顧銘洪.谷類作物品質(zhì)性狀遺傳研究進(jìn)展.南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，1990,93-99)。同時(shí)，有的研究者指出因香稻品種差異，控制香味的基因型存在差別，香稻品種間存在非等位的香味基因(Berner and Hoff.1n heritance of Scent in American longgra in rice.CropSc1.1986,26(5):876_878)。之所以出現(xiàn)對(duì)香氣遺傳的不同意見，可能在于對(duì)Fl的含義理解不一，香稻品種的不同香氣成份、香氣的感官鑒別不準(zhǔn)確，導(dǎo)致遺傳推斷上的偏差(湯圣祥.水稻育種學(xué).北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996,337-339)。
[0005]如何在保證香稻產(chǎn)量和品質(zhì)的基礎(chǔ)上，提高我國(guó)香稻米的香氣含量，目前正成為我國(guó)香稻育種和栽培科研人員和生產(chǎn)者所面臨的難題。大多數(shù)學(xué)者一致認(rèn)為2-乙酰_1_批咯啉(2-Acetyl-1-pyrroline,簡(jiǎn)稱2-AP)是香稻香氣的主要成分(G1vanni etal.1dentificat1n of microsatellite markers for fragrance in rice by analysis of therice genome sequence.Molecular Breeding, 2002，9:245-250 ；Sugunya et al.Effectsof drying methods and storage time on the aroma and milling quality of rice (Oryzasativar L.) cv.Khao Dawk Mali 105.Food Chemistry, 2004，87: 407-414)。有人推測(cè)香稻可能含有一種促進(jìn)2-乙酰-1-吡咯啉生物合成的變性酶，且單個(gè)香味基的復(fù)等位基因可以稍微改變這種酶，致使產(chǎn)生不同香味濃的水稻品種，代謝途徑各種附加步驟的改變是由復(fù)合香味因引起的(Pinson和謝國(guó)祿.六個(gè)水稻品種的香味遺傳.國(guó)外作物育種，1995，(I):1-3)。然而，關(guān)于2-AP在香稻體內(nèi)是怎樣形成的研究甚少。前人對(duì)泰國(guó)香米KDML105的研究則發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取液中存在較多的脯氨酸、鳥氨酸和谷氨酸時(shí)，2-AP的含量增加，并隨著脯氨酸的增加，2-AP的含量是對(duì)照的3倍多(Tadashi Y.，Nguyen T.，and Hideo1.Precursors of 2-Acetyl-1-pyrroline, a Potent Flavor Compound of an Aromatic RiceVariety.Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002，50:2001_2004)。不蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2-AP的氮源來自于脯氨酸，所以他認(rèn)為脯氨酸是2-AP合成的主要前體物質(zhì)，其次為谷氨酸和鳥氨酸(Jin et al.Tagging of a gene for aroma in rice by R2-APD andRFLP ( II ).Acta agriculture Zhejiang gensis, 1996,8 (I):19_23)。目前為止，還沒有關(guān)于脯氨酸到2-AP合成過程和機(jī)制的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有水稻脯氨酸氧化酶OsPRO功能研究的不足，提供一種與香稻香氣含量相關(guān)的基因OsPRO在改善香稻香氣含量中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的是提供一種與香稻香氣含量相關(guān)的蛋白OsPRO在改善香稻香氣含量中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明另一目的是提供一種對(duì)香稻香氣含量進(jìn)行改造的方法。 [0009]本發(fā)明再一目的是提供一種制備香氣改善型轉(zhuǎn)基因水稻的方法。
[0010]本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明提供了與香稻香氣含量相關(guān)的基因及與香稻香氣含量相關(guān)蛋白OsPRO在改善香稻香氣含量中的應(yīng)用。
[0011 ] 所述基因OsPRO的cDNA全長(zhǎng)序列如SEQ ID NO:1所示；所述OsPRO蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0012]與香稻香氣含量相關(guān)蛋白OsPRO在制備改善香稻香氣含量藥劑中的應(yīng)用，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0013]另外，本發(fā)明還提供了一種對(duì)香稻香氣含量進(jìn)行改造的方法，是將基因轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化后的水稻細(xì)胞培育成植株；所述基因OsPRO的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
[0014]本發(fā)明還提供了一種制備香氣改善型轉(zhuǎn)基因水稻的方法，包括如下步驟:
S1.構(gòu)建表達(dá)載體
511.利用SEQID NO:3所示引物OsPRO-F和SEQ ID NO:4所示引物OsPRO-R,以水稻cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收、定量、連接到相同雙酶切的植物表達(dá)載體中；
512.連接產(chǎn)物經(jīng)過透析膜透析后(以除去鹽離子)，轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細(xì)胞；
513.用雙酶切檢測(cè)，得到含有OsPRO基因的陽性植物表達(dá)載體；S2.轉(zhuǎn)化愈傷組織
521.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將上述含有基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻成熟胚的愈傷組織；
522.轉(zhuǎn)化后的愈傷組織經(jīng)過預(yù)分化、分化，得到轉(zhuǎn)化植株。
[0015]S3.陽性的轉(zhuǎn)基因植株鑒定
利用SEQ ID NO:5所示引物I和SEQ ID NO:6所示引物2，對(duì)S22所述轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR鑒定，得到陽性轉(zhuǎn)基因植株；
S4.純合子的篩選
將S3所述陽性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行培育繁殖，提取Tl代轉(zhuǎn)基因植株葉片基因組DNA，通過Southern Blot檢測(cè)插入基因的拷貝數(shù)，選擇單拷貝的轉(zhuǎn)基因植株分單株收取種子，然后將種子發(fā)芽后利用潮霉素進(jìn)行篩選，存活下來的即為純合子。
[0016]優(yōu)選地，步驟Sll 所述植物表達(dá)載體為 pCAMBIA1380、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、PCAMBIA230 1或pBI121。更優(yōu)選地，所述植物表達(dá)載體為pCAMBIA1380 ;步驟Sll所述雙酶切為歷fldIII和#7?Ι酶切。
[0017]優(yōu)選地，Sll所述連接的反應(yīng)體系總體積為10 μ L，于連接儀中反應(yīng)3h左右，按照下列程序連接:10°C 3 min, 16°C 3 min, 18°C I min ；17 個(gè)循環(huán)，65°C滅活 5 min。
[0018]S21所述轉(zhuǎn)化的方法如下:
(I)將上述含有OsPRO基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，驗(yàn)證正確后，菌液_80°C保存。
[0019](2)從保存在_80°C冰箱中的農(nóng)桿菌菌株EHA105的菌液中挑取少量菌于YM培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)(EHA105所用的抗生素為Kan和Chi)。置于28°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落。
[0020](3)挑選單菌落4~5個(gè)于150μL液體培養(yǎng)基中混勻，在YM培養(yǎng)基平板上涂平板。培養(yǎng)I天后，刮下適量菌，置于含100Mmol/L AS的30mL的NB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)(28°C，180rpm)，測(cè)得0D55(lnm值為0.5~0.6即可用于愈傷組織的侵染。
[0021](4)將準(zhǔn)備好的愈傷組織浸入菌液20min，用無菌濾紙吸干菌液后轉(zhuǎn)移到墊有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，25°C,光下干燥I天，轉(zhuǎn)移到固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(在培養(yǎng)基表面鋪一張無菌濾紙)，25°C，黑暗條件下培養(yǎng)3天之后，將共培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上，每?jī)芍芎Y選一次，篩選兩次。
[0022]所述固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為:MS培養(yǎng)基的大量兀素+ B5培養(yǎng)基的微量兀素+B5培養(yǎng)基的有機(jī)成分+水解酪蛋白500mg/L+肌醇2g/L+麥芽糖/蔗糖30g/L+明膠0.24% (w/w) +2, 4_D 2mg/L + 乙酸丁香麗 100Mmol/L, pH5.5。
[0023]所述篩選培養(yǎng)基配方為:N6培養(yǎng)基的大量兀素+B5培養(yǎng)基的微量兀素+B 5培養(yǎng)基的有機(jī)成分+水解酪蛋白300mg/L+蔗糖30g/L+明膠0.28%(w/w) +脯氨酸500mg/L+2，4-D
2.5mg/L+200mg/L 頭孢唑林鈉 +200mg/L 羧芐西林鈉 +Hyg 50mg/L, pH5.8。
[0024]其中，MS培養(yǎng)基的大量元素為:
1900mg/L 硝酸鉀(KNO3)+1650mg/L 硝酸銨(NH4NO3) +170mg/L 磷酸二氫鉀(KH2PO4) +370mg/L 硫酸鎂(MgSO4.7H20) +440mg/L 氯化鈣(CaCl2.2H20)。
[0025]B5培養(yǎng)基的微量兀素為:0.75 mg/L KI+3.0 mg/L H3BO4+1.0 mg/L MnSO4.4H20+2.0 mg/L ZnSO4.7H20+0.25 mg/LNa2MoO4.2H20+0.025 mg/L CoCl2.6H20+0.025 mg/L CuSO4.5H20。
[0026]B5培養(yǎng)基的有機(jī)成分為:
100 mg/L肌醇+1.0 mg/L煙酸+1.0 mg/L鹽酸批卩多醇+10 mg/L鹽酸硫銨。
[0027]N6培養(yǎng)基的大量元素為:
2830 mg/L 硝酸鉀(KNO3) +463 mg/L 硫酸銨(NH4SO4)+166 mg/L 氯化鈣(CaCl2.2H20)+185 mg/L 硫酸鎂(MgSO4.7H20) + 400 mg/L 磷酸二氫鉀(KH2PO4)。
[0028]S22所述預(yù)分化、分化的方法為:
從篩選培養(yǎng)基上挑選I~2_生長(zhǎng)良好、結(jié)構(gòu)致密的、淡黃色的抗性愈傷組織(除去褐化部分)，在含有I~2層無菌濾紙的培養(yǎng)皿上，25°C，光照條件下，干燥處理I天，然后把它轉(zhuǎn)置分化培養(yǎng)基上分化，此時(shí)，抗性愈傷組織會(huì)大量的增殖，并有綠點(diǎn)產(chǎn)生，待分化出的幼苗長(zhǎng)到3~4cm左右，把它轉(zhuǎn)置生根壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待幼苗長(zhǎng)出大量的根系，苗約8~1cm時(shí)，取出幼苗，洗凈培養(yǎng)基，移栽到室外。
[0029]所述分化培養(yǎng)基配方為:N6培養(yǎng)基的大量兀素+B5培養(yǎng)基的微量兀素+B5培養(yǎng)基的有機(jī)成分+lmg/L NAA+3mg/L BA+30g/L鹿糖+20g/L山梨醇+200mg/L羧節(jié)西林鈉+200mg/L 頭孢唑林鈉 +Hyg 50mg/L+0.28% 明膠，pH5.8。
[0030]所述生根壯苗培養(yǎng)基配方為:1/2MS+0.5mg/L NAA+0.5mg/L IAA+3mg/L多效唑+15g/L 蔗糖 +0.3% 明膠 +200mg/L 羧芐西林鈉 +200mg/L 頭孢唑林鈉 + Hyg50mg/L, pH5.8。[0031 ]其中，1/2MS 是指:950mg/L 硝酸鉀(KNO3) +825mg/L 硝酸銨(NH4NO3) +85mg/L 磷酸二氫鉀(KH2PO4)+185mg/L 硫酸鎂(MgSO4.7H20) +220mg/L 氯化鈣(CaCl2.2H20) +0.415mg/L 碘化鉀(ΚΙ)+3.lmg/L 硼酸(H3BO3)+11.15mg/L 硫酸錳(MnSO4.4H20) +4.3mg/L 硫酸鋅(ZnSO4.7H20) +0.125mg/L 鑰酸鈉(Na2MoO4.2H20) +0.0125mg/L 硫酸銅(CuSO4.5 H2O) +0.0125mg/L 氯化鈷(CoCl2.6H20)+18.65mg/L 乙二胺四乙酸二鈉(Na2.EDTA) +13.9mg/L 硫酸亞鐵(Fe2SO4.7H20) +50mg/L 肌醇 +lmg/L 甘氨酸 +0.05mg/L 鹽酸硫胺素(VBl)+0.25mg/L 鹽酸吡哆醇(VB6)+0.25mg/L 煙酸(VB5 或 VPP)。
[0032]優(yōu)選地，S3所述PCR 的擴(kuò)增條件為:94 °C 2 min ；94°C 30 sec, 58 °C 30 sec, 72°C Imin, 35 個(gè)循環(huán)；72 °C 5 min。
[0033]另外，攜帶有本發(fā)明的水稻基因OsPRO的植物表達(dá)載體還可以通過Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或是組織中。被轉(zhuǎn)化的宿主植物可以是水稻或其它作物。
[0034]此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可以使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或者轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或是鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)區(qū)域。
[0035]為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入在植物中表達(dá)可以產(chǎn)生顏色變化的酶或是發(fā)光化合物的基因(如GUS基因、熒光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除秀劑基因)等。[0036]本發(fā)明通過大量的研究和探索，成功地制備出過量表達(dá)OsPRO基因的轉(zhuǎn)基因水稻，并通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)基因水稻的PRO活性以及稻谷中香氣(2-AP)的含量均明顯增加。明確了基因與香稻香氣含量的關(guān)系和作用機(jī)制，為香稻育種提供了理論指導(dǎo)，具有非常大的理論和實(shí)踐價(jià)值。
[0037]本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明提供了與香稻香氣含量相關(guān)基因及其編碼蛋白的應(yīng)用。所述基因OsPRO的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；基因編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:
2所示。本發(fā)明明確了基因能夠增加香稻香氣含量，對(duì)生產(chǎn)上培育濃香型的香稻品種，調(diào)控香稻的香氣含量具有很大的指導(dǎo)應(yīng)用價(jià)值。
[0038]本發(fā)明的香稻基因可以插入到植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，制備成重組表達(dá)載體，進(jìn)一步構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為香稻香氣(2-AP)含量增加，OsPRO蛋白及其編碼基因?qū)φ{(diào)控香稻香氣(2-AP)的含量有重要的實(shí)際意義，在實(shí)際應(yīng)用中可以將基因轉(zhuǎn)入不同的香稻品種中以培育更加理想的香稻栽培品種，或調(diào)節(jié)OsPRO基因的表達(dá)獲得相應(yīng)的香稻香氣(2-AP)含量的水稻品種。OsPRO蛋白及其編碼基因在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用和市場(chǎng)前景。
[0039]本發(fā)明也明確了基因編碼的OsPRO蛋白(脯氨酸氧化酶)增加香稻香氣含量的機(jī)制，其中在脯氨酸氧化酶的作用下，脯氨酸轉(zhuǎn)化為吡咯啉-5-羧酸，這是脯氨酸轉(zhuǎn)化為
2-AP的第一步，也是必經(jīng) 的一步，更加豐富了香稻香氣含量的影響機(jī)制，為香稻品種的研究和培育提供更豐富的途徑和靶點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1為水稻OsPRO基因的擴(kuò)增電泳圖；泳道M為分子量標(biāo)記DL2000 plus (購自TAKARA);泳道I~3為目的基因。
[0041]圖2為過表達(dá)基因的轉(zhuǎn)基因水稻的PRO活性的測(cè)定結(jié)果；WT為野生型水稻云粳優(yōu)14 ； Line6為過表達(dá)OsPRO的水稻轉(zhuǎn)基因植株。
[0042]圖3為過表達(dá)基因的轉(zhuǎn)基因水稻香氣(2-AP)含量的測(cè)定結(jié)果；WT為野生型水稻云粳優(yōu)14 ； Line6為過表達(dá)OsPRO的水稻轉(zhuǎn)基因植株。
[0043]圖4為脯氨酸氧化酶影響水稻香氣(2-AP)含量的機(jī)制。
【具體實(shí)施方式】
[0044]以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。
[0045]除非特別說明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購。
[0046]所用弓丨物合成及測(cè)序工作由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。
[0047]實(shí)施例1香稻OsPRO基因的獲得 1、引物設(shè)計(jì)
根據(jù) NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)提供的關(guān)于 OsPRO 同源基因的 cDNA 序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下:OsPRO-F (如SEQ ID NO:3所示，下劃線為限制性內(nèi)切酶歷fldIII識(shí)別位點(diǎn))
5’ -ACTTGGAAGCTTCAGGCACAAGTCCGACCTTC- 3’ ；
OsPRO-R (如SEQ ID NO:4所示，下劃線為限制性內(nèi)切酶#7^/1識(shí)別位點(diǎn))
5’ -AATATCACGCGTTTACCGGAGCAGCTGTCTGT- 3’。
[0048]2、PCR 擴(kuò)增
以粳稻品種云粳優(yōu)14號(hào)2周的幼苗葉片cDNA為模板，使用引物OsPRO-Fl和OsPRO-Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)增OsPRO基因。PCR擴(kuò)增為常規(guī)方法。
[0049]反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化大約1428bp左右的DNA片段(如附圖1所示)。將該片段純化回收后，克隆到PMD18-T載體(購自TAKARA公司)上，獲得pMD18-T-0sATl載體，送北京奧科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序得到OsPRO基因cDNA全長(zhǎng)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。其編碼蛋白OsPRO的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。在基因DNA兩端引入了合適的酶切位點(diǎn)歷fldIII和#7^/1。
[0050]實(shí)施例2遺傳轉(zhuǎn)化鑒定目的基因的功能
本實(shí)施例通過構(gòu)建過表達(dá)OsPRO基因的轉(zhuǎn)基因水稻，研究其PRO活性以及稻谷中香氣(2-AP)的含量變化，來探討OsPRO基因?qū)ο愕鞠銡夂康挠绊懠捌錂C(jī)制。
[0051]1、構(gòu)建表達(dá)載體 將OsPRO基因克隆入植物過表達(dá)載體pCAMBIA1380 (購自澳大利亞CAMBIA公司)多克隆位點(diǎn)的和#7?Ι酶切位點(diǎn)之間，得到含有基因的植物表達(dá)載體。
[0052]( I)表達(dá)載體的構(gòu)建
OsPRO-F和OsPRO-R引物分別引入了歷fli/III和#7^/1兩個(gè)酶切位點(diǎn)，在組成型載體PCAMBIA1380上也有單一的歷/--/ΙΙΙ和#7?Ι酶切位點(diǎn)，因此利用引物OsPRO-F和OsPRO-R，以粳稻品種云粳優(yōu)14號(hào)2周的幼苗葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用試劑盒回收相應(yīng)的OsPRO全長(zhǎng)目的片段，再經(jīng)定量、連接到相同酶酶切的pCAMBIA1380載體中，連接反應(yīng)體系總體積為?ο μ L，于連接儀中反應(yīng)3h左右，按照下列程序連接:10°C 3min，16°C 3 min, 18°CI min ； 17 個(gè)循環(huán)，65°C滅活 5 min。
[0053]取連接產(chǎn)物于透析膜上透析約半小時(shí)，以除去鹽離子，轉(zhuǎn)化DHlOB感受態(tài)細(xì)胞。連接后裝載完的質(zhì)粒選用Λ?/--/ΙΙΙ和#7?Ι雙酶切檢測(cè)后，可以看出切出了相應(yīng)大小的片段約
1.4Kb左右，至此證實(shí)了 OsPRO超表達(dá)重組載體已成功構(gòu)建。
[0054]2、轉(zhuǎn)化愈傷組織
利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將上述含有基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化粳稻品種云粳優(yōu)14號(hào)的成熟胚的愈傷組織,方法參考文章Hiei et al, Efficient transformat1n of rice{Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundariesof the T-DNA.Plant J, 1994，6(2): 271-282。
[0055]具體的轉(zhuǎn)化過程如下:
(I)將上述含有OsPRO基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，驗(yàn)證正確后，菌液_80°C保存。
[0056](2)從保存在_80°C冰箱中的農(nóng)桿菌菌株EHA105的菌液中挑取少量菌于YM培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)(EHA105所用的抗生素為Kan和Chi)。置于28°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落。[0057](3)挑選單菌落4~5個(gè)于150μL液體培養(yǎng)基中混勻，在YM培養(yǎng)基平板上涂平板。培養(yǎng)I天后，刮下適量菌，置于含100Mmol/L AS的30mL的NB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)(28°C，180rpm)，測(cè)得0D55(lnm值為0.5~0.6即可用于愈傷組織的侵染。
[0058](4)將準(zhǔn)備好的愈傷組織浸入菌液20min，用無菌濾紙吸干菌液后轉(zhuǎn)移到墊有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，25°C,光下干燥I天，轉(zhuǎn)移到固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(在培養(yǎng)基表面鋪一張無菌濾紙)，25°C，黑暗條件下培養(yǎng)3天之后，將共培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上，每?jī)芍芎Y選一次，篩選兩次。
[0059]所述YM培養(yǎng)基和 NB液體培養(yǎng)基配方參照本領(lǐng)域常規(guī)配方。
[0060]所述固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為:MS培養(yǎng)基的大量兀素+ B5培養(yǎng)基的微量兀素+B5培養(yǎng)基的有機(jī)成分+水解酪蛋白500mg/L+肌醇2g/L+麥芽糖/蔗糖30g/L+明膠0.24% (w/w) +2, 4~D 2mg/L + 乙酸丁香麗 100Mmol/L, pH5.5。
[0061]所述篩選培養(yǎng)基配方為:N6培養(yǎng)基的大量兀素+B5培養(yǎng)基的微量兀素+B 5培養(yǎng)基的有機(jī)成分+水解酪蛋白300mg/L+蔗糖30g/L+明膠0.28%(w/w) +脯氨酸500mg/L+2，4-D
2.5mg/L+200mg/L 頭孢唑林鈉 +200mg/L 羧芐西林鈉 +Hyg 50mg/L, pH5.8。
[0062](5)轉(zhuǎn)化后的愈傷組織預(yù)分化、分化
從篩選培養(yǎng)基上挑選I~2_生長(zhǎng)良好、結(jié)構(gòu)致密的、淡黃色的抗性愈傷組織(除去褐化部分)，在含有I~2層無菌濾紙的培養(yǎng)皿上，25°C，光照條件下，干燥處理I天，然后把它轉(zhuǎn)置分化培養(yǎng)基上分化，此時(shí)，抗性愈傷組織會(huì)大量的增殖，并有綠點(diǎn)產(chǎn)生，待分化出的幼苗長(zhǎng)到3~4cm左右，把它轉(zhuǎn)置生根壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待幼苗長(zhǎng)出大量的根系，苗約8~1cm時(shí)，取出幼苗，洗凈培養(yǎng)基，移栽到室外。
[0063]所述分化培養(yǎng)基配方為:N6培養(yǎng)基的大量兀素+B5培養(yǎng)基的微量兀素+B5培養(yǎng)基的有機(jī)成分+lmg/L NAA+3mg/L BA+30g/L鹿糖+20g/L山梨醇+200mg/L羧節(jié)西林鈉+200mg/L 頭孢唑林鈉 +Hyg 50mg/L+0.28% 明膠，pH5.8。
[0064]所述生根壯苗培養(yǎng)基配方為:1/2MS+0.5mg/L NAA+0.5mg/L IAA+3mg/L多效唑+15g/L 蔗糖 +0.3% 明膠 +200mg/L 羧芐西林鈉 +200mg/L 頭孢唑林鈉 + Hyg50mg/L, pH5.8。
[0065]轉(zhuǎn)化后的愈傷組織經(jīng)過預(yù)分化、分化，得到16株轉(zhuǎn)化植株。
[0066]3、陽性的轉(zhuǎn)基因植株鑒定
對(duì)上述16株轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR鑒定，PCR引物序列如下:
引物1:(如SEQ IDNO:5所示)
5，-GACGAAGCTGCCATGGAAAG-3，；
引物2:(如SEQ IDNO:6所示)
5，- AGCTGCCCGGACTCGACGTT-3，；
PCR 擴(kuò)增條件為:94 0C 2 min ；94°C 30 sec, 58 °C 30 sec, 72°C I min, 35 個(gè)循環(huán)；72 °C5 min。
[0067]結(jié)果顯示，16株轉(zhuǎn)化植株全部為陽性。
[0068]4、純合子的篩選
將上述經(jīng)過PCR鑒定為陽性的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行培育繁殖，提取Tl代轉(zhuǎn)基因植株葉片基因組DNA，通過Southern Blot檢測(cè)插入基因的拷貝數(shù)，選擇單拷貝的轉(zhuǎn)基因植株分單株收取種子，然后取100粒以上種子發(fā)芽后利用潮霉素進(jìn)行篩選，若沒有死亡則表明種子已經(jīng)純合。
[0069]5、轉(zhuǎn)基因水稻中PRO活性以及稻谷中香氣(2-AP)的含量變化 (I) PRO活性測(cè)定
選擇已經(jīng)純合的轉(zhuǎn)基因種子和野生型水稻云粳優(yōu)14種子萌發(fā)后，利用木村B營(yíng)養(yǎng)液(調(diào)pH為4.8)培養(yǎng)水稻至4葉期，取樣測(cè)定水稻葉片中PRO活性的含量。
[0070]所述木村B 營(yíng)養(yǎng)液的具體配方為:(NH4)2SO4 (0.365mM)，KH2PO4 (0.182 mM)，KNO3(0.183 mM)，K2SO4 (0.086 mM)，Ca (NO3) 2 (0.366 mM)，MgSO4 (0.548 mM)，EDTA-Fem (0.020mM) ,MnCl2-4H20 (0.091 X 10_3 mM), ZnSO4 7H20 (0.77 X 10_3 mM), CuSO4 5H20 (0.32X10_3mM)，H3BO3 (0.0462 mM)，(NH4)6Mo7O24^H2O (0.145X 10_3 mM)。
[0071]葉片PRO活性測(cè)定方法如下:
S1.準(zhǔn)確稱取水稻葉片材料0.2 g加入適量的液氮研磨成碎末，分次加入總量為3 mL的提取液(ρΗ7.4 0.1 mo I 廠1磷酸鉀緩沖液，0.5% (v/v) triton X-100),繼續(xù)研磨成勻衆(zhòng)，4°C, 3000 r HiirT1離心10 min，上清液既為脯氨酸氧化酶液。
[0072]S2.于離心管中，依次加入0.3 mL反應(yīng)體系(ρΗ8.0 0.1 mo I l-1磷酸鉀緩沖液，
0.5% (v/v) triton X-100 ； 15 mmol L 1 腦氛酸)，0.15 mmol L 1 細(xì)胞色素 C 20 μ L, 0.20 mL酶提取液；在37°C水浴中反應(yīng)30 min。
[0073]S3.加入0.5 mL 10%三氯乙酸中止反應(yīng)，再加入0.4 mL 0.5% α-氨基苯甲醛(溶解在95%的乙醇中)進(jìn)行顯色,反應(yīng)30 min后,9000 r mirT1離心10 min,在440 nm下比色。
[0074](2)香氣(2-AP)含量的測(cè)定
待轉(zhuǎn)基因稻米收獲干燥后貯藏3個(gè)月，測(cè)稻谷中的香氣(2-AP)含量。稻谷中香氣(2-AP)含量的測(cè)定方法如下:
S1.利用同時(shí)蒸餾萃取儀進(jìn)行蒸餾萃取，在同時(shí)蒸餾萃取儀一端燒瓶放入50 g糙米和145 mL蒸餾水，100°C加熱蒸餾，另一端燒瓶放入50 mL乙醚，40°C加熱蒸餾，循環(huán)蒸餾90min。
[0075]S2.由漏液處取出乙醚萃取液，用無水硫酸鈉去水過濾，減壓蒸餾至2 mL，過0.2Mm濾膜。
[0076]S3.取I mL于1.5 mL樣品瓶中，加入0.2 ppm的2，4，6-三甲基嘧啶作為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)
行氣質(zhì)測(cè)定。
[0077]氣質(zhì)測(cè)定的條件為:
GC-MS:Shimadzu 2010 plus ；
色譜柱:RESTEK Rx1-5ms長(zhǎng)度為30 m,內(nèi)徑0.32 mm,膜厚0.25 μ m,進(jìn)樣口溫度220°C，載氣為He氣2 mL.mirT1,離子源:EI,70 eV，350 V ;掃描質(zhì)量:30~160。
[0078]升溫程序:40°C保持I min,以2V /min升溫到65°C保持I min,以10°C /min升溫到 220°C保持 10 min。
[0079]6、結(jié)果顯示，過表達(dá)基因的轉(zhuǎn)基因植株為陽性植株。轉(zhuǎn)基因植株的PRO活性較野生型提高了 3倍多(如附圖2所示)。稻米收獲干燥貯藏3個(gè)月后，測(cè)得轉(zhuǎn)基因稻谷中香氣(2-AP)的含量是野生型的2倍之多(如附圖3所示)。
[0080]通過以上實(shí)驗(yàn)，我們確定了基因的表達(dá)能夠增加香稻香氣的含量，同時(shí)也明確了《5/--基因影響香稻香氣含量的機(jī)制是《5/--基因通過參與脯氨酸到2-AP的合成過程，影響水稻中香氣(2-AP)的含量。
[0081 ] 實(shí)施例3 OsPRO基因影響香稻香氣物質(zhì)2-AP的合成機(jī)制
1、發(fā)明人經(jīng)過大量的研究，探索出了基因影響香稻香氣含量的具體機(jī)制，如附圖4所示，其中，基因編碼的OsPRO蛋白(脯氨酸氧化酶)發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，在脯氨酸氧化酶的作用下，脯氨酸轉(zhuǎn)化為吡咯啉-5-羧酸，這是脯氨酸轉(zhuǎn)化為2-AP的第一步，也是必經(jīng)的一步。
[0082]2、發(fā)明人通過將OsPRO基因RNAi沉默，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水稻
(1)載體構(gòu)建
根據(jù)SEQ IDNO: I的序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下:
OsPRO-RNA1-F (如SEQ ID NO:7所示，下劃線為限制性內(nèi)切酶及識(shí)別位點(diǎn))
5，-ATAGTAGGATCCGACGAAGCTGCCATGGAAAG-3’ ；
OsPRO-RNA1-R (如SEQ ID NO:8所示，下劃線為限制性內(nèi)切酶歷fli/III識(shí)別位點(diǎn))
5’ -ATATACAAGCTT AGCTGCCCGGACTCGACGTT-3’ 以水稻cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0083]分兩步完成組成型RNA干涉載體和目的片段的裝載過程:
RNA干涉載體pRNAi由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光研究員饋贈(zèng)，RNA干涉載體pRNAi的構(gòu)建參照(胡旭霞，劉耀光.植物RNA干涉載體的構(gòu)建及其在水稻基因表達(dá)沉默中的應(yīng)用.分子植物育種，2006.5 (4): 621-626)。
[0084]S1.用沒aMlI和歷ii/III兩種限制性內(nèi)切酶分別雙酶切上述的特異PCR產(chǎn)物和RNA干涉載體pRNAi，再經(jīng)回收、定量、連接。反應(yīng)體系總體積為10 μ L，于連接儀中反應(yīng)3h左右，按照下列程序連接:10°C 3 min, 16°C 3 min, 18°C I min ；17個(gè)循環(huán)，65°C滅活5 min。取連接產(chǎn)物于透析膜上透析約半小時(shí)，以除去鹽離子，然后電激轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞。
[0085]S2.將SI驗(yàn)證連接成功的質(zhì)粒用#Λ/Ι和AiI雙酶切之后，回收，用作載體；而插入子則來源于用引物RNA1-#A/I和RNA1-AiI對(duì)SI連接成功的質(zhì)粒作PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；按1:3摩爾比混合載體和插入子，然后連接、轉(zhuǎn)化DHlOB感受態(tài)細(xì)胞。
[0086]所述引物RNA1-1Z/?Ι和RNA1-AiI是RNA干涉載體pRNAi的漢.ΗΙ和歷/--/ΙΙΙ兩側(cè)的通用引物，序列如下:
MM-MluI (如SEQ ID NO:9所示，下劃線為限制性內(nèi)切酶#7^/1識(shí)別位點(diǎn))
5’ - GAGAACGCGTGGTACCCTTGACCATGGTAG -3’
RNA1-AiI (如SEQ ID NO:10所示，下劃線為限制性內(nèi)切酶AiI識(shí)別位點(diǎn))5，- AACTACTGCAGGGCCCTCAGATCTACCATGGTC -3’
(2)載體表達(dá)
參照實(shí)施例例2中的2和3步驟。
[0087](3) PRO活性、2-ΑΡ含量測(cè)定方法同實(shí)施例2。
[0088]吡咯啉-5-羧酸含量的測(cè)定方法如下:
參照Wu等(2009))的方法測(cè)定吡咯啉-5-羧酸的含量，具體如下:
S1.準(zhǔn)確稱取水稻葉片材料0.5 g加入適量的液氮研磨成碎末，分次加入總量為4 mL的提取液(PH 8.0 50mM Tris-HCl),繼續(xù)研磨成勻衆(zhòng),4°C, 3000 r/min離心10 min,上清液既為脯氨酸氧化酶液。[0089]S2.于離心管中，依次加入0.20 mL酶提取液，500 μ L 10%質(zhì)量比的三氯乙酸(TCA), 125 μ L 40 mM 2_氨基苯甲醒,室溫下保持30min, 8000rpm離心1min,于440nm測(cè)定，摩爾消光系數(shù)為2.58 ml-1 -1n-1.,
[0090]測(cè)定結(jié)果如表1所示。
[0091]表1
【權(quán)利要求】
1.與香稻香氣含量相關(guān)基因在改善香稻香氣含量中的應(yīng)用；所述基因OsPRO的cDNA全長(zhǎng)序列如SEQ ID NO:I所示。
2.與香稻香氣含量相關(guān)蛋白OsPRO在改善香稻香氣含量中的應(yīng)用；所述OsPRO蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.與香稻香氣含量相關(guān)蛋白OsPRO在制備改善香稻香氣含量藥劑中的應(yīng)用。
4.一種對(duì)香稻香氣含量進(jìn)行改造的方法，其特征在于，將基因轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化后的水稻細(xì)胞培育成植株；所述基因OsPRO的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.一種制備香氣改善型轉(zhuǎn)基因水稻的方法，其特征在于，包括如下步驟: 51.構(gòu)建表達(dá)載體 511.利用SEQID NO:3所示引物OsPRO-F和SEQ ID NO:4所示引物OsPRO-R,以水稻cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收、定量、連接到相同雙酶切的植物表達(dá)載體中； 512.連接產(chǎn)物經(jīng)過透析膜透析后，轉(zhuǎn)化DHlOB感受態(tài)細(xì)胞； 513.雙酶切檢測(cè)，得到含有OsPRO基因的陽性植物表達(dá)載體； 52.轉(zhuǎn)化愈傷組織 521.利用農(nóng)桿菌介 導(dǎo)的方法，將上述含有基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻成熟胚的愈傷組織； 522.轉(zhuǎn)化后的愈傷組織經(jīng)過預(yù)分化、分化，得到轉(zhuǎn)化植株； 53.陽性的轉(zhuǎn)基因植株鑒定 利用SEQ ID NO:5所示引物I和SEQ ID NO:6所示引物2，對(duì)S22所述轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR鑒定，得到陽性轉(zhuǎn)基因植株； 54.純合子的篩選 將S3所述陽性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行培育繁殖，提取Tl代轉(zhuǎn)基因植株葉片基因組DNA，通過Southern Blot檢測(cè)插入基因的拷貝數(shù)，選擇單拷貝的轉(zhuǎn)基因植株分單株收取種子，然后將種子發(fā)芽后利用潮霉素進(jìn)行篩選，存活下來的即為純合子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述制備香氣改善型轉(zhuǎn)基因水稻的方法，其特征在于，步驟Sll所述植物表達(dá)載體為 pCAMBIA1380、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301 或 pBI121。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述制備香氣改善型轉(zhuǎn)基因水稻的方法，其特征在于，所述植物表達(dá)載體為PCAMBIA1380 ;步驟Sll所述雙酶切為歷/?dIII和#7?Ι酶切。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104031927SQ201410251807
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月9日
【發(fā)明者】田華, 唐湘如, 潘圣剛, 段美洋, 肖立中, 鐘克友 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)