一種高通量鑒定煙草青枯病抗性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高通量鑒定煙草青枯病抗性的方法，包括以下步驟：將粒度為2-4mm的石英砂于121℃高溫下滅菌30分鐘，冷卻后將其播入無菌12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔10g石英砂，每孔加入4ml無菌水；將待測烤煙種子播種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的石英砂上，播種后將12孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于25℃、RH>80%、16h光照和8h黑暗交替條件下培養(yǎng)；待煙種發(fā)芽后，無菌條件下向培養(yǎng)煙苗的12孔微孔板內(nèi)添加霍格蘭營養(yǎng)液，每孔2ml，繼續(xù)置于25℃、RH>80%、16h光照和8h黑暗交替條件下培養(yǎng)，待煙苗5-6葉期時用于抗病性鑒定；接種液制備及接種；病情調(diào)查與分級。本發(fā)明能高通量、高效率鑒定煙草青枯病抗性，且一次可以鑒定的烤煙品種多。
【專利說明】一種高通量鑒定煙草青枯病抗性的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于作物抗病性鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種煙草青枯病抗性的鑒定方 法。
[0002]

【背景技術(shù)】
[0003] 由爺科雷爾氏菌 so/aflacear腫（Smith) Yabuuchi et al)引起的煙 草青枯病是一種世界性土傳細(xì)菌性病害，極具破壞性，并成為制約煙草生產(chǎn)的主要病害。煙 草青枯病在主要產(chǎn)煙省區(qū)均普遍發(fā)生。該病害是典型的維管束病害，煙草根、莖、葉各部位 均可被侵染，但主要危害植物的根和莖，其主要癥狀之一是葉片單邊萎蔫和過早變黃。目 前，培育和應(yīng)用抗病品種是防治青枯病最有效的途徑。但在抗病育種相關(guān)研究中，需要快 速、準(zhǔn)確地評價大量材料的抗性表現(xiàn)。常用的鑒定方法有：1)漂浮/盆栽煙苗人工接種鑒定 法。該方法培養(yǎng)溫度不穩(wěn)定，容易受環(huán)境溫度變化的影響；病原菌濃度易受育苗池中水的體 積及煙盆澆水等因素的影響；近而影響煙苗的發(fā)病率和病情指數(shù)，影響煙苗抗性水平的鑒 定，鑒定結(jié)果不穩(wěn)定，重復(fù)性不高。該方法所需空間大，需要搭建溫室大棚、育苗池，需要購 買加熱裝置，管理成本高，需要人力成本高。該方法通量小，一次可以鑒定的品種較少。此 夕卜，該方法在鑒定期容易受其它病害的影響，如：煙草黑脛病、猝倒病、灰霉病、病毒病、白粉 病等，這些病害會影響煙苗的抗性鑒定結(jié)果。2)大田病圃人工接種方法。該方法可以較好 地反應(yīng)品種的抗性；但該方法鑒定周期長、每年只能鑒定一次、所需病圃面積大、用于鑒定 的煙草材料有限、青枯菌菌懸液需求量大、發(fā)病不均勻，且存在供試材料的抗性表現(xiàn)在年份 間和地點(diǎn)間存在差異等問題。盆栽、漂浮煙苗和大田抗性鑒定環(huán)境溫度難以控制。盆栽和 大田抗性鑒定中病原菌數(shù)量難以控制。為了更好地篩選青枯病抗源、培育抗病品種、挖掘抗 病基因，及研究病原宿主互作機(jī)制等，亟需建立一套簡便、快速和高效的煙草青枯病抗性鑒 定方法。
[0004]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服上述缺點(diǎn)而提供一種能高通量、高效率鑒定煙草青枯病抗 性，且一次可以鑒定的烤煙品種多的高通量鑒定煙草青枯病抗性的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的及解決其主要技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的： 本發(fā)明公開了的一種高通量鑒定煙草青枯病抗性的方法，包括以下步驟： (1)培育無菌煙苗 將粒度為2-4_的石英砂于121°C高溫下滅菌30分鐘，冷卻后將其播入無菌12孔細(xì)胞 培養(yǎng)板中，每孔l〇g石英砂，每孔加入4ml無菌水；將待測烤煙種子播種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板 的石英砂上，播種后將12孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于25°C、RH>80%、16h光照和8h黑暗交替條件下 培養(yǎng)； (2) 煙苗的日常管理 待煙種發(fā)芽后，無菌條件下向培養(yǎng)煙苗的12孔微孔板內(nèi)添加霍格蘭（Hoglangd)營養(yǎng) 液，每孔2ml，繼續(xù)置于25°C、RH>80%、16h光照和8h黑暗交替條件下培養(yǎng)，待煙苗5-6葉期 時用于抗病性鑒定； (3) 接種液制備及接種 將煙草青枯菌so菌株使用前在勞爾氏菌選擇性培養(yǎng)基 (SMSA)上活化48h，挑典型單菌落至勞爾氏菌選擇性培養(yǎng)基（SMSA)平板上，30°C培養(yǎng)48h。 將菌苔刮下，接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（NB)培養(yǎng)液，30°C震蕩培養(yǎng)36至48h ;培養(yǎng)液 于4000 X g離心20min收集菌體，用無菌水配成菌懸液，調(diào)整菌的濃度為1 X 108cfu/mL，按 照0. 5 ml/孔將菌懸液添加至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的微孔中； (4) 病情調(diào)查與分級 接菌后20d調(diào)查發(fā)病情況，以后每隔3d調(diào)查一次發(fā)病情況；記錄發(fā)病率及病情指數(shù)，以 感病對照發(fā)病率達(dá)到80%左右的病情指數(shù)作為品種抗性評價標(biāo)準(zhǔn)。
[0007] 上述的一種高通量鑒定煙草青枯病抗性的方法，其中：牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基 (NA) :牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，瓊脂 16g，水 1000ml，pH 6. 8 ?L 2。
[0008] 上述的一種高通量鑒定煙草青枯病抗性的方法，其中：牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基 (NB) :牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，水 1000ml，pH 6. 8 ?7. 2。
[0009] 上述的一種高通量鑒定煙草青枯病抗性的方法，其中：SMSA培養(yǎng)基：蛋白胨10g， 甘油5mL，水解酪蛋白氨基酸lg，調(diào)pH至7. 0,加水配至1L，加瓊脂粉16g ;使用時待溶化好 的培養(yǎng)基冷卻至50°C左右時每250ml培養(yǎng)基加入1%多粘菌素 B 2. 5ml、1%結(jié)晶紫125 μ L、 1%TTC 1. 25ml、l% 桿菌肽 625μ L、0. 1% 青霉素 125μ L、l% 氯霉素 125μ L。
[0010] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)點(diǎn)和有益效果。由以上技術(shù)方案可知：1)本 發(fā)明在12孔微孔板中培育煙苗，所需儀器為恒溫光照培養(yǎng)箱，占地小、需要空間??；因而經(jīng) 濟(jì)、方便，可實現(xiàn)高通量鑒定，一次可以鑒定的烤煙品種多。2)煙草生長和青枯病發(fā)病溫度 可以恒溫控制，發(fā)病率和病情指數(shù)結(jié)果穩(wěn)定，能真實反應(yīng)烤煙品種的抗性水平。3)能夠準(zhǔn)確 控制每品種接菌量，使得發(fā)病條件完全一致。4)在整個鑒定過程中，孔內(nèi)青枯菌濃度和培養(yǎng) 溫度穩(wěn)定，不受培養(yǎng)液體積的變化而變化，近而發(fā)病率和病情指數(shù)穩(wěn)定，保證了重復(fù)間發(fā)病 的均勻性。5)病原菌從根部侵入，接近病害田間自然侵染過程，保證了抗性鑒定結(jié)果的可 靠性。6)微孔板石英砂培育煙苗，具備無菌培養(yǎng)環(huán)境，避免其它微生物對煙苗生長的影響。 7)有利于年度間和不同實驗室間結(jié)果重現(xiàn)和比較。該方法在抗病資源和育種材料的抗性鑒 定、抗性遺傳規(guī)律分析、抗病基因挖掘及分子病理學(xué)研究中應(yīng)用潛力較大。
[0011] 【具體實施方式】 [0012] 實施例1-8 一種高通量鑒定煙草青枯病抗性的方法，包括以下步驟： (1)培育無菌煙苗 將粒度為2-4_的石英砂于121°C高溫下滅菌30分鐘，冷卻后將其播入無菌12孔細(xì)胞 培養(yǎng)板中，每孔l〇g石英砂，每孔加入4ml無菌水。將待測烤煙種子（8個品種均由貴州省
【權(quán)利要求】
1. 一種高通量鑒定煙草青枯病抗性的方法，包括以下步驟： (1) 培育無菌煙苗 將粒度為2-4_的石英砂于121°C高溫下滅菌30分鐘，冷卻后將其播入無菌12孔細(xì)胞 培養(yǎng)板中，每孔l〇g石英砂，每孔加入4ml無菌水；將待測烤煙種子播種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板 的石英砂上，播種后將12孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于25°C、RH>80%、16h光照和8h黑暗交替條件下 培養(yǎng)； (2) 煙苗的日常管理 待煙種發(fā)芽后，無菌條件下向培養(yǎng)煙苗的12孔微孔板內(nèi)添加霍格蘭營養(yǎng)液，每孔2ml， 繼續(xù)置于25°C、RH>80%、16h光照和8h黑暗交替條件下培養(yǎng)，待煙苗5-6葉期時用于抗病性 鑒定； (3) 接種液制備及接種 將煙草青枯菌菌株使用前在勞爾氏菌選擇性培養(yǎng)基上活化48h，挑典型單菌落至勞爾 氏菌選擇性培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)48h，將菌苔刮下，接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基培 養(yǎng)液，30°C震蕩培養(yǎng)36至48h ;培養(yǎng)液于4000Xg離心20min收集菌體，用無菌水配成菌懸 液，調(diào)整菌的濃度為1X 108cfu/mL，按照0. 5 ml/孔將菌懸液添加至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的微 孔中； (4) 病情調(diào)查與分級 接菌后20d調(diào)查發(fā)病情況，以后每隔3d調(diào)查一次發(fā)病情況；記錄發(fā)病率及病情指數(shù)，以 感病對照發(fā)病率達(dá)到80%左右的病情指數(shù)作為品種抗性評價標(biāo)準(zhǔn)。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種高通量鑒定煙草青枯病抗性的方法，其中：牛肉膏蛋白胨 固體培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，瓊脂16g，水1000ml，pH 6. 8?7. 2。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的一種高通量鑒定煙草青枯病抗性的方法，其中：牛肉膏蛋 白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，水1000ml，pH 6. 8?7. 2。
【文檔編號】A01G7/00GK104082055SQ201410269005
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月17日
【發(fā)明者】汪漢成, 任學(xué)良, 王軼, 蔡劉體, 王茂勝, 陸寧, 王仁剛 申請人:貴州省煙草科學(xué)研究院