OsPT6磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種磷轉(zhuǎn)運蛋白基因OsPT6及該基因在磷高效利用轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用，提供利用該基因進行磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法，在培育過程中使用的含該基因的表達載體和構(gòu)建、宿主菌以及轉(zhuǎn)基因大豆OsPT6基因相對表達量的測定方法和試劑盒。本發(fā)明解決現(xiàn)有技術(shù)中磷轉(zhuǎn)運蛋白OsPT6基因在大豆育種中的空白，構(gòu)建含OsPT6基因的植物表達載體，在OsPT6基因引入CaMV35S啟動子和NOS終止子，增加了OsPT6基因在外源基因中的表達調(diào)控，該載體還含有除草劑抗性基因bar基因，既方便檢測又增加轉(zhuǎn)基因植株對除草劑的抗性，以本發(fā)明培育方法生產(chǎn)出的轉(zhuǎn)基因大豆能高效利用磷。
【專利說明】0sPT6磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種磷轉(zhuǎn)運蛋白基因0sPT6及該基因在磷高效利用轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用，具體涉及利用該基因進行磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法，在培育過程中使用的含該基因的表達載體和構(gòu)建、宿主菌以及轉(zhuǎn)基因大豆0sPT6基因相對表達量的測定方法和試劑盒。
技術(shù)背景
[0002]大豆富含蛋白和植物油，其營養(yǎng)價值高深受消費者喜愛，隨著市場需求量逐年增加，它已成為重要的經(jīng)濟作物(Wang XR, Yan XL, Liao H.Geneticimprovement for phosphorus efficiency in soybean:a radical approach.Annals ofBotany, 2010，106:215-222.)。目前，我國是世界上主要的大豆消費國和進口國，其中2012年進口大豆5838萬噸，由于受進口大豆的沖擊我國大豆生產(chǎn)面積和產(chǎn)量逐年下降，2012年大豆總產(chǎn)量為1301萬噸，我國每年消費的大豆約有80%依賴于國外進口(國家統(tǒng)計局:http://data, stats, gov.cn/)。我國南方地區(qū)存在嚴重的土壤養(yǎng)分問題而制約大豆生產(chǎn)(李杰，石元亮，陳智文，我國南方紅壤磷素研究概況.土壤通報，2011.42(3):763-768)。由于磷元素在土壤中易被Fe3+、Al3+離子固定，或者與有機物結(jié)合，使有效磷濃度低于10 μ M 而成為大顯生產(chǎn)的限制因素之一(Raghothama K G and Karthikeyan A S.Phosphateacquisition.Plant and Soil，2005，274:37-49.)。為解決土壤缺磷問題，農(nóng)民習(xí)慣于盲目增施磷肥，但大部分磷肥被土壤固定，利用率低，不能經(jīng)濟有效地解決土壤缺磷問題又造成資源浪費和環(huán)境污染(Shen JBj Yuan LXj Zhang JLj Li HG，Bai ZHj Chen XP，Zhang WFj ZhangFS.Phosphorus Dynamics:From Soil to Plant.Plant physiology, 2011，156:997-1005.)。并且磷礦是不可再生資源，按目前的磷礦開釆速度，磷礦資源將在本世紀末消耗殆盡(Gilbert N.Environment:The disappearing nutrient.Nature, 2009，461:716-718.)。
[0003]從植物本身提高磷素效率，培育磷高效利用植物新種質(zhì)，結(jié)合科學(xué)的養(yǎng)分管理技術(shù)，對于減少磷肥的施用，減輕環(huán)境污染，提高經(jīng)濟效益，促進農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，具有重要的意義。現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，水稻中分別超表達OsPTl、0sPT2及0sPT8，在低磷條件下可增加磷從地下部到地上部的運輸，從而提高植株耐低磷能力(Jia HF, Ren HYj GuMj Zhao JNj Sun SB，Zhang X，Chen JYj Wu P，Xu GH.The phosphate transporter gene OsPhtl ；8is involved in phosphate homeostasis in rice.Plant Physiol.2011，156:1164—1175 ；Sun SB，Gu MjCao Y，Huang XPj Zhang X，Ai PHj Zhao JNj Fan XRjXu GH.A constitutiveexpressed phosphate transporter，OsPht I ； I,modulates phosphate uptake andtranslocation in phosphate-replete rice.Plant Physiology.2012，159:1571-1581 ；Wu PjShou HXjXu GHjLian XM.1mprovement of phosphorus efficiency in rice on thebasis of understanding phosphate signaling and homeostasis.Current Opinion inPlant Biology, 2013，16:1-8.)。煙草(Nicotiana tabacum L )NtPTl 基因在水稻中超表達，在低磷及高磷條件下均能夠顯著增加轉(zhuǎn)基因植株的磷含量(Park MR, Baek SHj ReyesBG, Yun SJ.0verexpression of a high-aff inity phosphate transporter gene fromtobacco (NtPTl) enhances phosphate uptake and accumulation in transgenic riceplants.Plant Soil, 2007，292:259-269.)。擬南芥(Arabidopsis)中超表達 Phtl ;5 基因可改變植株體內(nèi)磷的再活化作用(Nagarajan, V.K.，A.Jain, M.D.Poling, A.J.Lewis, K.G.Raghothama, and A.P.Smith.Arabidopsis Phtl ；5mobilizes phosphate between sourceand sink organs and influences the interaction between phosphate homeostasis andethylene signaling.Plant Physiology, 2011.156 (3): 1149-1163.)。以上研究證明，植物中超表達磷轉(zhuǎn)運蛋白基因在低磷條件下可增加磷的吸收及提高耐低磷能力。因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將可提高磷利用效率的基因?qū)氪蠖怪?，是培育磷高效大豆新品種的一種有效途徑。
[0004]水稻0sPT6基因是一個在低磷誘導(dǎo)下強烈表達的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因，通過酵母功能互補實驗結(jié)果證明0sPT6介導(dǎo)了酵母細胞膜的磷酸鹽轉(zhuǎn)運，為高親和力磷轉(zhuǎn)運蛋白，具有磷高效吸收能力。在水稻中通過RNAi抑制0sPT6表達，在低磷脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因株系中磷的總含量相比野生型急劇減少，證明這個磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白是水稻從低磷脅迫環(huán)境中獲取磷必不可少的，對磷的吸收和體內(nèi)運輸起著重要作用(Ai PH, Sun SB, Zhao JN, Fan XR, XinWJ, Guo Q, Yu L, Shen QR, Wu P, Miller AJ, Xu GH.Two rice phosphate transporters, OsPhtl ；2and OsPhtl ；6,have different functions and kinetic properties in uptake andtranslocation.The Plant Journal, 2009, 57:798-809.)。利用生物工程手段將此基因?qū)胱魑镏?，可改善作物磷吸收及利用效率，有效降低磷肥的施用量。但到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)有此基因在大豆中表達的報道，利用生物工程提高大豆磷高效利用也鮮有報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中磷轉(zhuǎn)運蛋白基因0sPT6在轉(zhuǎn)基因大豆育種中的空白，實現(xiàn)大豆磷高效轉(zhuǎn)運 、減少磷肥的過度使用，從而降低土壤退化速度。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供下述技術(shù):
[0007]本發(fā)明提供一種植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT6，含有磷轉(zhuǎn)運蛋白0sPT6基因和除草劑抗性基因bar基因，水稻磷轉(zhuǎn)運蛋白0sPT6基因5’端和3’端分別引入CaMV35S啟動子和NOS終止子。
[0008]本發(fā)明還提供一種0sPT6磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法，該方法將水稻磷轉(zhuǎn)運蛋白基因0sPT6構(gòu)建至植物表達載體pCAMBIA3301中，獲得重組植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT6，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法導(dǎo)入大豆。
[0009]本發(fā)明還提供植物表達載體pCAMBIA3301_0sPT6的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0010]I)設(shè)計引物，擴增序列為SEQ ID N0.1所示的0sPT6基因片段；其中，上游引物P6s:如SEQ ID N0.2所示;下游引物P6a:如SEQ ID N0.3所示;通過擴增，0sPT6基因片段引入SacI和XbaI酶切位點；
[0011]2)將0sPT6基因連接到PMD19-T質(zhì)粒載體，構(gòu)建克隆載體pMD19-T_0sPT6，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，提取陽性重組質(zhì)粒；
[0012]3)全序列合成含有CaMV35S啟動子、多克隆位點、NOS終止子的T800片段，序列如SEQ ID N0.4所示，在合成序列CaMV35S啟動子的5’端和NOS終止子的3’端分別引入EcoRI和HindIII酶切位點；
[0013]4)通過酶切連接的方法將T800片段插入到基礎(chǔ)載體PCAMBIA3301的EcoRI和HindIII酶切位點之間，得到中間載體pCAMBIA3301-T800 ；
[0014]5)用SacI和XbaI分別酶切克隆載體pMD19-T_0sPT6和中間載體PCAMBIA3301-T800質(zhì)粒，以連接酶連接回收的0sPT6基因片段和pCAMBIA3301_T800，將0sPT6基因插入到中間載體CaMV35S啟動子和NOS終止子之間，酶切驗證，構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT6。
[0015]上述的0sPT6磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法，具體包括如下步驟:
[0016]l)0sPT6轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體的獲得:以大豆子葉節(jié)為外植體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT6導(dǎo)入大豆基因組中，通過除草劑篩選獲得Ttl代轉(zhuǎn)化體；
[0017]2) 0sPT6轉(zhuǎn)基因大豆T2代陽性植株的獲得=Ttl代植株通過自花授粉獲得T1代種子，T1代種子萌發(fā)后通過PCR及GUS染色鑒定出陽性植株，陽性植株自花授粉獲得T2代種子；T2代種子萌發(fā)后通過同樣的方法鑒定出陽性植株，獲得磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆。
[0018]本發(fā)明還提供磷轉(zhuǎn)運蛋白0sPT6基因在磷高效利用轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，優(yōu)選地，在磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆中的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明上述的植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT6，在磷高效利用轉(zhuǎn)基因植物培育中的應(yīng)用，優(yōu) 選地，在磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆培育中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明還提供一種宿主菌，含有上述的植物表達載體pCAMBIA3301_0sPT6。
[0021]本發(fā)明還提供上述的宿主菌在磷高效利用轉(zhuǎn)基因植物培育中的應(yīng)用，優(yōu)選地，在磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆培育中的應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明還提供一種磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆0sPT6基因相對表達量的測定方法，該方法以大豆GmSKIP16作為內(nèi)參基因，通過qRT-PCR測定0sPT6基因在磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆中的表達量；
[0023]其中，檢測0sPT6基因上游引物FPT6 -M SEQ IDN0.15所示，下游引物RPT6 -M SEQID N0.16 所示；
[0024]檢測GmSKIP16基因的上游引物FSKIP16:如SEQ ID N0.13所示；下游引物RSKIP16:如 SEQ ID N0.14 所示。
[0025]本發(fā)明還提供一種磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆0sPT6基因相對表達量測定的試劑盒，該試劑盒包括如下序列:
[0026]0sPT6基因檢測引物，上游引物FPT6 -M SEQ IDN0.15所示，下游引物RPT6 -M SEQID N0.16 所示；
[0027]GmSKIP16基因的檢測引物，上游引物FSKIP16:如SEQ ID N0.13所示；下游引物RSKIP16:如 SEQ ID N0.14 所示。
[0028]本發(fā)明有益效果:
[0029]1.本發(fā)明構(gòu)建的水稻磷轉(zhuǎn)運蛋白基因0sPT6的重組植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT6, 0sPT6基因5’端和3’端分別引入CaMV35S啟動子和NOS終止子，增加了 0sPT6基因在外源基因中的表達調(diào)控，提高了 0sPT6基因的表達水平；該載體可以應(yīng)用于多種磷高效利用轉(zhuǎn)基因植株的培育，尤其是磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆的培育，填補了現(xiàn)有技術(shù)中的空白。
[0030]2.采用本發(fā)明提供的磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法生產(chǎn)出的含有0sPT6基因的轉(zhuǎn)基因大豆，具有磷高效利用的特點，可在低磷環(huán)境下生存，通過試驗鑒定，通過本發(fā)明提供的培育方法生產(chǎn)出的轉(zhuǎn)基因大豆，即使在75天低磷生長環(huán)境下，生長狀況仍然良好，產(chǎn)量也顯著高于野生型植株。
[0031]3.本發(fā)明構(gòu)建的水稻磷轉(zhuǎn)運蛋白基因0sPT6的重組植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT6，含有除草劑抗性基因bar基因，使得攜帶有磷轉(zhuǎn)運蛋白基因0sPT6的植物表達載體在宿主細胞中表達更容易檢測，額外增加的除草劑抗性基因bar基因，賦予了轉(zhuǎn)基因植株抗除草劑特性。
[0032]4.本發(fā)明通過合適的內(nèi)參基因GmSKIP16基因，以此作為基準(zhǔn)，使用熒光定量PCR技術(shù)，分析0sPT6基因相對表達量，通過該方法可以定量測定0sPT6基因表達水平，從而選擇出合適表達的轉(zhuǎn)基因大豆，為轉(zhuǎn)基因育種提供方便。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1植物表達載體pCAMBIA3301_0sPT6的鑒定
[0034]A圖:0sPT6片段瓊脂糖凝膠電泳分析:
[0035]M:DNA Marker 電泳條帶，大小分別為 2Kb、1Kb、0.75Kb、0.5Kb、0.25Kb,0.1Kb ；
[0036]I:0sPT6片段電泳條帶；
[0037]B圖:植物表達載體pCAMBIA3301_0sPT6質(zhì)粒Sac1、XbaI雙酶切瓊脂糖凝膠電泳分析:
[0038]Ml:DNA Marker 電泳條帶，大小分別為 15Kb、10Kb、7.5Kb、5Kb、2.5Kb、1Kb、
0.25Kb ；
[0039]I:pCAMBIA3301-0sPT6 電泳條帶
[0040]2:pCAMBIA3301-T800 經(jīng) Sac1、XbaI 雙酶切電泳條帶
[0041]3:pCAMBIA3301-0sPT6 經(jīng) Sac1、XbaI 雙酶切電泳條帶；
[0042]M2:DNA Marker 電泳條帶，大小分別為 2Kb、1Kb、0.75Kb、0.5Kb、0.25Kb,0.1Kb ；
[0043]C圖:植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT6質(zhì)粒EcoR1、HindIII雙酶切瓊脂糖凝膠電泳分析:
[0044]Ml:DNA Marker 電泳條帶，大小分別 15Kb、10Kb、7.5Kb、5Kb、2.5KbUKb,0.25Kb,
[0045]I:pCAMBIA3301-0sPT6 電泳條帶，
[0046]2:pCAMBIA3301-T800 經(jīng) EcoR1、HindIII 雙酶切電泳條帶，
[0047]3:pCAMBIA3301-0sPT6 經(jīng) EcoR1、HindIII 雙酶切電泳條帶，
[0048]M2:DNA Marker，大小分別為 2KbUKb,0.75Kb,0.5Kb,0.25Kb,0.1Kb。
[0049]圖2植物表達載體pCAMBIA3301_0sPT6圖譜
[0050]圖3農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化過程
[0051]A圖:5天苗齡無菌苗；B圖:共培養(yǎng)外植體；C圖:叢生芽分化；D圖:芽伸長；E圖:芽伸長至3-4cm ；F圖:半葉法⑶S染色；G圖:GUS陽性芽根長至l-2cm ；H圖=Ttl轉(zhuǎn)基因植株
[0052]圖4轉(zhuǎn)基因大豆Ttl代植株P(guān)CR及Southern雜交鑒定
[0053]A 圖:PCR 鑒定:[0054]a圖:gus基因的PCR擴增后電泳圖；b圖:bar基因的PCR擴增后電泳圖；c圖:0sPT6基因的PCR擴增后電泳圖；
[0055]M:DNA Marker 電泳條帶:大小分別為 2KbUKb,0.75Kb,0.5Kb,0.25Kb,0.1Kb ；P:質(zhì)粒DNA陽性對照；WT:野生型植株陰性對照；1和2:分別為Ttl代轉(zhuǎn)基因植株12PT6-1和12PT6-2 ；
[0056]B 圖:Southern 雜交分析:
[0057]P:質(zhì)粒DNA陽性對照；WT:野生型植株陰性對照；1和2:分別為Ttl代轉(zhuǎn)基因植株12PT6-1和 12PT6-2。
[0058]圖5轉(zhuǎn)基因大豆⑶S染色鑒定
[0059]A圖:莖橫截面(GUS陽性芽)；B圖=T0代植株葉片；C圖=T0代植株花；D圖=T0代植株花藥；E圖=Ttl代植株豆莢；F圖:萌發(fā)24小時的T1代種子；G圖:萌發(fā)72小時的T2代幼苗；H圖:T2代植株側(cè)根。
[0060]圖6轉(zhuǎn)0sPT6基因大豆葉片Basta抗性鑒定
[0061]A圖:轉(zhuǎn)基因大豆葉片具有Basta抗性；B圖:野生型大豆葉片不具有Basta抗性。
[0062]圖7熒光定量PCR檢測0sPT6在T2代轉(zhuǎn)基因大豆植株中的相對表達量
[0063]WT:野生型植株陰 性對照；I，2，3:分別為T2代轉(zhuǎn)基因大豆株系12PT6-1-1，12PT6-1-14,12PT6-2-8
[0064]圖8低磷水培條件下，轉(zhuǎn)基因大豆生長情況
[0065]A-C圖:表示低磷處理30天后植株生長狀況；D_F圖:表示低磷處理60天后植株生長狀況；G圖:表示低磷處理75天后植株生長狀況。
[0066]OsPTeT2:表示T2轉(zhuǎn)基因植株;WT:表示野生型植株陰性對照。其中，各豎線長度代表比例尺度Bar:A、D、G短線長度代表實際Bar = 15cm ；B, C，E與F長線長度代表實際Bar=Icm
[0067]圖9低磷及正常磷條件下營養(yǎng)液栽培植株不同器官磷積累情況
[0068]A圖:營養(yǎng)液栽培60天后植株根、莖、葉有效磷含量；B圖:營養(yǎng)液栽培60天后植株根、莖、葉總磷含量；
[0069]12PT6-1-1、12PT6-1-14和12PT6-2-8:分別表示0sPT6轉(zhuǎn)基因大豆T2代不同株系；WT:表示野生型植株陰性對照；每個株系共選用8棵植株用于分析，不同字母表示Duncan’s多重比較在P〈0.05水平上差異顯著。
【具體實施方式】
[0070]下述實施例中所用方法若無特殊說明均為本領(lǐng)域慣用的技術(shù)手段，所用的試劑、材料，如無特殊說明均可通過商業(yè)途徑得到。
[0071]一、植物表達載體pCAMBIA3301_0sPT6的構(gòu)建
[0072]本發(fā)明所構(gòu)建植物表達載體以pCAMBIA3301載體為基礎(chǔ)載體，【具體實施方式】如下:1.水稻磷轉(zhuǎn)運蛋白基因0sPT6基因的克隆:
[0073]選用缺磷處理的水稻葉片為材料，參照TaKaRa公司總RNA提取試劑(目錄號:D9108A)說明書方法，提取葉片總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RNase消化cDNA產(chǎn)物以去除RNA殘留。參照水稻磷轉(zhuǎn)運蛋白基因0sPT6(以下簡稱0sPT6)序列信息(NCBI登錄號:AF536966.1)，設(shè)計引物擴增序列如SEQ ID N0.1所示的OsPT6基因片段；
[0074]上游引物P6s:如SEQ ID N0.2所示；
[0075]下游引物P6a:如SEQ ID N0.3所示。
[0076]以上述水稻cDNA為模板，進行PCR反應(yīng)，50 μ L反應(yīng)體系包含:10XPCRBuffer5.0 μ L, 2.5mmo I.L 1 的 dNTP mix4.0yL, 25mmol.L 1 的 MgCl23 μ L, 20 μ mo I.L 1 的P6s、P6a 引物各 1.0 μ L，Taq DNA Polymerase0.2 μ L, cDNA 模板 1.0 μ L，ddH20 補至 50 μ L ;反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性4min,94°C變性lmin, 61.4°C復(fù)性lmin,72°C延伸2min, 30個循環(huán)后，72°C總延伸IOmin ;PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN，目錄號:AP-GX_50)回收純化，連接到PMD19-T載體(TaKaRa，目錄號:D102A)，構(gòu)建克隆載體pMD19-T_0sPT6，轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細胞，進行序列測定；
[0077]2.中間載體 pCAMBIA3301-T800 的改造: [0078]全序列合成含有CaMV35S啟動子、多克隆位點、NOS終止子的T800片段，其序列如SEQ ID N0.4所示，在兩端分別引入EcoRI和HindIII酶切位點(北京鼎國昌盛生物科技有限公司);取質(zhì)粒載體pCAMBIA3301 (CAMBIA, Australia)和T800片段各15 μ L，分別用 EcoRI (Promega)和 HindIII (Promega)雙酶切，50 μ L 酶切體系:10XBuffer Ε5 μ L,BSA0.5 μ L，質(zhì)粒 pCAMBIA3301 或 T80015 μ L, EcoRIl.25 μ L, HindIIIl.25 μ L, ddH2027 μ L ；37°C酶切反應(yīng)3h，酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收質(zhì)粒PCAMBIA3301大片段，大小為11256bp和T800小片段，大小為849bp，按照1:4的比例用T4DNA連接酶(TaKaRa，目錄號:D2011A)連接，25 μ L連接反應(yīng)體系含有:10XT4ligaseBuffer2.5 μ L, pCAMBIA3301 大片段 2 μ L，T800 小片段 8 μ L，T4DNA 連接酶 I μ L，ddH2011.5 μ L ; 16°C過夜反應(yīng)，取10 μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細胞，涂板37°C過夜培養(yǎng)；挑取單克隆擴大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，PCAMBIA3301-T800中間載體改造完成；
[0079]3.植物表達載體pCAMBIA3301_0sPT6的構(gòu)建
[0080]取改造好的中間載體pCAMBIA3301-T800和第I步所得到的克隆載體pMD19-T_0sPT6 的質(zhì)粒分別用 SacI(Promega)和 XbaI(Promega)雙酶切。
[0081]50 μ L pCAMBIA3301-T800 雙酶切體系含有:10 XBuffer E5 μ L, BSA0.5 μ L，質(zhì)粒PCAMBIA3301-T800 或 pMD19-T_0sPT615 μ L, Sacll.25 μ L, XbaIl.25 μ L, ddH2027 μ L ；37°C反應(yīng)3h ；
[0082]50 μ L pMD19-T-0sPT6 雙酶切體系含有:10 X Buffer E5 μ L, BSA0.5 μ L，質(zhì)粒pMD19-T-0sPT615 μ L, Sacll.25 μ L, XbaI1.25 μ L, ddH2027 μ L ;37。。反應(yīng) 3h ；
[0083]分別對上述雙酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收質(zhì)粒PCAMBIA3301-T800大片段和0sPT6小片段；回收的質(zhì)粒pCAMBIA3301_T800大片段和0sPT6小片段，按照1:4的比例，用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接，25 μ L的連接反應(yīng)體系含有:10XT4Iigase Buffer2.5 μ L, pCAMBIA3301-T800 大片段 2μ L，0sPT6 小片段 8 μ L，T4DNA連接酶I μ L，ddH2011.5yL;16°C過夜連接反應(yīng)，取IOyL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細胞。37°C過夜培養(yǎng)，挑取單克隆擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進行PCR瓊脂糖凝膠電泳分析(見圖1A)及酶切驗證(見圖1B和1C)。植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT6 (見圖
2)構(gòu)建成功。二、植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT6轉(zhuǎn)染農(nóng)桿菌EHA105
[0084]1.取2 μ g(10 μ L)純化的植物表達載體pCAMBIA3301_0sPT6的質(zhì)粒，加入200 μ L農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)中，混勻；
[0085]2.冰浴5min，轉(zhuǎn)入液氮冷凍Imin ；
[0086]3.加入 800 μ L YEB 液體培養(yǎng)基，250rpm, 28°C，4_5h ；
[0087]4.用移液器將菌液移至YEB固體選擇培養(yǎng)基(含50mg -11卡那霉素)均勻涂布；
[0088]5.28°C培養(yǎng)l-2d，挑取單菌落，提質(zhì)粒，PCR檢測獲得轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌工程菌。
[0089]三、農(nóng)桿菌介導(dǎo)0sPT6基因表達載體轉(zhuǎn)化大丑
[0090]1.大豆子葉節(jié)外植體的制備及侵染
[0091]取成熟飽滿的大豆‘ΝΥ-1001種子，表面消毒后接種于萌發(fā)培養(yǎng)基[B5+3% (w/v)鹿糖+0.8% (w/v)瓊脂，pH5.8]，25°C條件下,光照(16h光照/8h黑暗,強度90 μ mol
培養(yǎng)5天獲得無菌苗(如圖3-A所示)。保留子葉下方2-3mm的下胚軸，垂直沿下軸胚將子葉分開，水平劃5-7次腋芽原基區(qū)，得到子葉節(jié)外植體。
[0092]將含植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT6的農(nóng)桿菌EHA105劃線于平板，28°C培養(yǎng)24h，挑取單克隆液體培養(yǎng)24h，然后取2mL菌液加入200mL YEP液體培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)至OD650為0.6-0.8，菌液離心后，用液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基[1/10B5培養(yǎng)基+1.67mg ^1^6-芐基氨基嘌呤 +0.25mg.L-1 赤霉素 +200 μ mo I.L-1 乙酰丁香酮 +3% (w/v)鹿糖 +0.7% (w/v)瓊月旨，pH5.4]重懸， 調(diào)節(jié)OD65tl值為I，得到重懸菌液。
[0093]外植體放入到50mL重懸菌液中，侵染30min。侵染結(jié)束后，吸干多余菌液，將外植體近軸面向下放置于鋪有一層濾紙的共培養(yǎng)基上(添加3mmol.L4L-半胱氨酸,lmmol *L_1硫代硫酸鈉和二硫蘇糖醇)，25°C暗培養(yǎng)4天(如圖3-B所示)。
[0094]2.轉(zhuǎn)基因大豆植株的再生
[0095]共培養(yǎng)結(jié)束后的外植體，用液體芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基[B5培養(yǎng)基+1.67mg.L_16-芐基氨基嘌呤+500mg.L-1羧芐青霉素+3% (w/v)蔗糖+3mmol.T1MES, ρΗ5.6]搖動洗滌4-5次除去表面多余菌體，將外植體近軸面向上接種于固體芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(液體芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基+0.8% (w/v)瓊脂)。25°C光照(16h光照/8h黑暗,90 μ mol mH培養(yǎng)10天。10天后,外植體接種于芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基(芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基+4mg -L-1雙丙氨磷)，篩選培養(yǎng)4周，每2周繼代一次。
[0096]篩選培養(yǎng)4周后，將有叢生芽分化的外植體(如圖3-C所示)，轉(zhuǎn)移到芽伸長培養(yǎng)基[MS培養(yǎng)基+Img.L-1玉米素+0.5mg.L-1赤霉素+0.1mg.L-1 口引哚乙酸+IOOmg.L-1焦谷氨酸+50mg.L^1L-天冬酰胺+300mg.L-1羧節(jié)青霉素+2mg.L-1雙丙氨磷+3% (w/v)鹿糖+3mmol.L^MES+0.8% (w/v)瓊脂，pH5.6]，芽伸長(如圖3-D所示)培養(yǎng)，每隔兩周繼代I次，芽伸長6-8周。
[0097]待芽伸長至3_4cm時(如圖3_E所示)，進行半葉法⑶S染色鑒定(如圖3-F所示)，伸長的GUS陽性芽用手術(shù)刀從基部切下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基[1/2B5培養(yǎng)基+0.5mg.L^IBA+3% (w/v)蔗糖 +0.8% (w/v)瓊脂，ρΗ5.6]，GUS 陽性芽根長至 l_2cm 長時(如圖3-G所示)，打開培養(yǎng)瓶瓶蓋馴化2-3d，然后用鑷子小心將幼苗取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽如含有蛭石:草炭=I:1的塑料盆中，25°C在光照培養(yǎng)箱中馴化，I周后，移入溫室，常規(guī)管理，直至成熟收獲，獲得Ttl轉(zhuǎn)基因植株(如圖3-H所示)。通過除草劑(Basta)篩選獲得Ttl代轉(zhuǎn)化體；
[0098]3.轉(zhuǎn)0sPT6基因大豆1~2代陽性植株的獲得[0099]T0代植株通過自花授粉獲得T1代種子，T1代種子萌發(fā)后通過PCR及GUS染色鑒定出陽性植株，陽性植株自花授粉獲得T2代種子；τ2代種子萌發(fā)后通過同樣的方法鑒定出陽性植株。
[0100]四、轉(zhuǎn)基因大豆的鑒定
[0101]1.轉(zhuǎn)基因大豆植株P(guān)CR鑒定
[0102]取Ttl代轉(zhuǎn)基因大豆幼嫩葉片，SDS法提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，分別設(shè)計gUS、bar和0sPT6基因的引物進行PCR，瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖4-A所示)。通過對轉(zhuǎn)化植株中外源基因的PCR檢測，初步證實植株的轉(zhuǎn)基因特性。
[0103]上游引物GUSl:如SEQ ID N0.5所示；
[0104]下游引物GUS2:如SEQ ID N0.6所示；
[0105]gus 基因的 PCR擴增程序:94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 45sec，55°C復(fù)性 lmin，72°C延伸lmin, 30個循環(huán)后，72°C總延伸IOmin ；
[0106]上游引物bar 1:如SEQ ID N0.7所示；
[0107]下游引物bar2:如SEQ ID N0.8所示；
[0108]bar 基因的 PCR 擴增程序:94°C預(yù)變性 5min，95°C變性 lmin，55°C復(fù)性 lmin，72°C延伸lmin, 30個循環(huán)后，72°C總延伸IOmin ；
[0109]上游引物PT61:如SEQ ID N0.9所示；
[0110]下游引物PT62:如 SEQ IDN0.10 所示。
[0111]0sPT6 基因的 PCR 擴增程序:95°C預(yù)變性 5min，95°C變性 lmin，63°C 復(fù)性 30sec，72°C延伸lmin，30個循環(huán)后，72°C總延伸lOmin。
[0112]2.轉(zhuǎn)基因大豆植株Southern blot鑒定
[0113]采用SDS法，大量提取Ttl代轉(zhuǎn)基因大豆葉片基因組DNA JOyg基因組DNA被EcoRI酶切消化后用于Southern blot分析；421_bp 0sPT6探針的標(biāo)記及雜交方法依據(jù)RoachDIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I 說明書進行(Roach,產(chǎn)品號:11745832910)。如圖4_B所示，0sPT6基因以單拷貝的形式成功整合到大豆基因組中。
[0114]421-bp 0sPT6 片段 PCR 獲得:
[0115]上游引物F:如SEQ IDN0.11所示；
[0116]下游引物R:如SEQ ID N0.12所示；
[0117]PCR 反應(yīng)程序:95°C 5min ；68°C 2min ；72°C 30s ;30 個循環(huán)；72°C IOmin0 3.轉(zhuǎn)基因大豆各器官的⑶S染色鑒定
[0118]取Ttl代轉(zhuǎn)基因大豆和野生型大豆的器官樣品及1\、T2代萌發(fā)的種子，分別置于GUS 染色液[50mmol.L—1 憐酸鈉緩沖液(pH7.0), I % (v/v) Triton X100,20 % (v/v)甲醇，50mmol.L4六氰合亞鐵酸鉀,50mmol.L4六氰合鐵酸鉀，ImM X-gluc (G0LDB10,貨號:G1281C)]中，37°C染色12h。70%乙醇脫色后，拍照觀察(如圖5所示)。與對照組相比，轉(zhuǎn)化植株的各器官都有g(shù)us基因表達，外源基因可遺傳給后代。
[0119]以上培養(yǎng)基或染色液中成分的濃度、質(zhì)量體積百分比均相對于對應(yīng)培養(yǎng)基或染色液體積而言。
[0120]4.轉(zhuǎn)基因大豆Basta涂抹鑒定
[0121 ] 選取健康生長的Ttl代轉(zhuǎn)基因大豆和野生型大豆葉片，用棉棒蘸取0.05 % Basta涂抹于半張葉片，五天之后觀察葉片表現(xiàn)，拍照記錄(如圖6所示)。圖6所示，非轉(zhuǎn)基因植株涂抹Basta的半張葉片表現(xiàn)出失綠，而轉(zhuǎn)基因植株的葉片正常，表明轉(zhuǎn)基因植株具有除草劑抗性，進一步證明植株的轉(zhuǎn)基因特性。
[0122]5.轉(zhuǎn)基因大豆T2代植株中0sPT6基因相對表達量的測定
[0123]熒光定量PCR反應(yīng)，GmSKIP16作為內(nèi)參基因。分別設(shè)計GmSKIP16和0sPT6基因的qRT-PCR引物:
[0124]GmSKIP16 的 qRT-PCR 引物:
[0125]上游引物FSKIP16:如 SEQ ID N0.13 所示，
[0126]下游引物RSKIP16:如 SEQ ID N0.14 所示；
[0127]0sPT6 基因的 qRT-PCR 引物: [0128]上游引物FPT6:如 SEQ ID N0.15 所示，
[0129]下游引物RPT6:如 SEQ ID N0.16 所示。
[0130]為檢測大豆T2代植株中0sPT6基因的表達情況，取T2代轉(zhuǎn)基因植株及野生型植株的葉片，提取總RNA (參照TaKaRa Trizol Reagent說明書),按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,貨號:DRR047A)的方法將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行qRT-PCR反應(yīng)，測定Ct值。反應(yīng)體系參照 TaKaRa SYBRs Premix Ex Taq?II (TaKaRa，貨號:RR820A)說明書 25 μ L 反應(yīng)體系包括:SYBR" Premix Ex Taq?II12.5 μ L,上游引物和下游引物(GmSKIP16 或 0sPT6 基因)各 1.Ομ L(20ymol.L-1)，cDNA 模板 2yL，ddH208.5 μ L0 反應(yīng)程序:95 °C 預(yù)變性 30sec后，95°C變性5sec，60°C退火20sec，40個循環(huán)。0sPT6基因的相對表達量= #Τ?Λ CT =CT，ospTC_CT，GmSKIP16，其中 CT，QsPT6 為 0sPT6 基因的值，CT，GmSKIP16 為內(nèi)參基因 GmSKIP16 基因的Ct值。
[0131]轉(zhuǎn)基因大豆中0sPT6基因相對表達量(如圖7所示)，圖中1、2和3分別代表丁2代轉(zhuǎn)基因株系株系12PT6-1-1、12PT6-1-14和12PT6-2-8，表明0sPT6基因在T2代轉(zhuǎn)基因植株葉片中均有高的表達水平。
[0132]6.轉(zhuǎn)基因大豆耐低磷鑒定
[0133]以上述3個超表達轉(zhuǎn)0sPT6基因大豆1~2代株系(株系12PT6-1-1、12PT6-1-14和12PT6-2-8)用于耐低磷試驗。分別取12天苗齡的上述3個超表達轉(zhuǎn)0sPT6基因大豆T2代幼苗各I株和一株野生型大豆幼苗，作為對照WT，用海綿固定于有孔的泡沫板上，放置于裝有改良的Hoagland營養(yǎng)液的塑料桶上。設(shè)置兩個磷濃度IOyM和ΙΟΟΟμΜ，低磷營養(yǎng)液中用NH4Cl替代部分NH4H2PO4使溶液中最終磷濃度為10 μ M ;其他離子濃度不變；EC =
2.61dS.m_1o對營養(yǎng)液進行通氣供氧,每三天更換一次營養(yǎng)液(調(diào)節(jié)pH值至6.5)。每個處理重復(fù)8次。溫室環(huán)境采用人工控制，晝夜溫度:28°C /20°C，光周期:(12h光照/12h黑暗，HPS 燈，PPFD:600 μ mo 1.π 2.s—1)，相對濕度:70 - 80%, CO2 濃度:400 μ M。
[0134]低磷處理期間觀察各植株生長表現(xiàn)(如圖8所示)。營養(yǎng)液栽培植株低磷處理30天后，野生型對照葉片失綠(如圖8A，8C所示)；低磷處理60天后，野生型對照植株葉片出現(xiàn)枯斑(如圖8D，8F所示);而轉(zhuǎn)基因植株葉片正常(如圖SB，SE所示)。低磷處理75天后，野生型對照植株葉片已全部脫落(如圖SG所示)，而轉(zhuǎn)基因植株葉片大部分仍在植株上(如圖8G所示)，表明0sPT6轉(zhuǎn)基因植株在低磷條件下生長狀態(tài)顯著優(yōu)于野生型對照。
[0135]水培50天后測量植株的株聞和根長,水培90天后測量植株根部生物量(如表1所示)。由表1可知，在低磷脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的株高、根長及根重均顯著高于野生型對照。在正常磷供應(yīng)條件下，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植物生長指標(biāo)無顯著差異。
[0136]植株生殖生長后期，對有效莢數(shù)進行測定；種子收獲后測定單株種子數(shù)及種子重量(如表2所示)。由表2可知，低磷條件下，轉(zhuǎn)基因植株單株莢數(shù)，種子粒數(shù)及種子重量均顯著高于野生型對照，表明0sPT6轉(zhuǎn)基因植株在低磷條件下可顯著增加植株的產(chǎn)量。在正常磷供應(yīng)條件下，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植物生長指標(biāo)無顯著差異。
[0137]水培處理60天后，取轉(zhuǎn)基因及野生型植株葉片，莖和根部樣品測定有效磷和總磷含量。
[0138]有效磷含量測定:取0.2克鮮樣用液氮研磨成粉末，在4°C放置(冰上或者冰箱)至樣品凍融，加入ImLlO% (w/v)的高氯酸(PCA)研磨勻衆(zhòng)；勻衆(zhòng)液用5% (w/v)的高氯酸(PCA)稀釋10倍，于冰上放置30分鐘；4°C，1000g離心10分鐘，上清液以鑰藍法測定有效磷含量的，計算有效磷含量。
[0139]總磷含量測定:植株樣品105°C，殺青30min，70°C烘箱中烘烤兩天，磨碎，混勻，進行樣品總磷濃度測定。稱取約0.1g植株干樣，用濃H2SO4-H2O2混合消煮。冷卻定容后，用鑰銻抗比色法測定，并計算總磷含量。
[0140]由圖9可觀察到，低磷和正常磷條件下，轉(zhuǎn)基因植株有效磷和總磷含量均顯著高于野生型植株。
[0141]表1水培條件下植株營養(yǎng)生長指標(biāo)
[0142]
【權(quán)利要求】
1.一種植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT6，其特征在于含有磷轉(zhuǎn)運蛋白OsPT6基因和除草劑抗性基因bar基因，水稻磷轉(zhuǎn)運蛋白OsPT6基因5’端和3’端分別引入CaMV35S啟動子和NOS終止子。
2.—種0sPT6磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法，其特征在于將水稻磷轉(zhuǎn)運蛋白基因0sPT6構(gòu)建至植物表達載體pCAMBIA3301中，獲得重組植物表達載體pCAMBIA3301_0sPT6，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法導(dǎo)入大豆。
3.植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT6的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)設(shè)計引物，擴增序列為SEQID N0.1所示的0sPT6基因片段；其中，上游引物P6s:如SEQ ID N0.2所示；下游引物P6a:如SEQ ID N0.3所示;通過擴增，0sPT6基因片段引入SacI和XbaI酶切位點； 2)將0sPT6基因連接到pMD19-T質(zhì)粒載體，構(gòu)建克隆載體pMD19-T_0sPT6，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，提取陽性重組質(zhì)粒； 3)全序列合成含有CaMV35S啟動子、多克隆位點、NOS終止子的T800片段，序列如SEQID N0.4所示，在合成序列CaMV35S啟動子的5’端和NOS終止子的3’端分別引入EcoRI和HindIII酶切位點； 4)通過酶切連接的方法將T800片段插入到基礎(chǔ)載體pCAMBIA3301的EcoRI和HindIII酶切位點之間，得到中間載體PCAMBIA3301-T800 ； 5)用SacI和XbaI分別酶切克隆載體pMD19_T_0sPT6和中間載體pCAMBIA3301_T800質(zhì)粒，以連接酶連接回收的0sPT6基因片段和pCAMBIA3301-T800，將0sPT6基因插入到中間載體CaMV35S啟動子和NOS終止子之間，酶切驗證，構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA3301_0sPT6。
4.權(quán)利要求2所述的0sPT6磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法，具體包括如下步驟: 1)0sPT6轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體的獲得:以大豆子葉節(jié)為外植體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT6導(dǎo)入大豆基因組中，通過除草劑篩選獲得Ttl代轉(zhuǎn)化體； 2)0sPT6轉(zhuǎn)基因大豆T2代陽性植株的獲得=Ttl代植株通過自花授粉獲得T1代種子，T1代種子萌發(fā)后通過PCR及⑶S染色鑒定出陽性植株，陽性植株自花授粉獲得T2代種子；T2代種子萌發(fā)后通過同樣的方法鑒定出陽性植株，獲得磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆。
5.磷轉(zhuǎn)運蛋白0sPT6基因在磷高效利用轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，優(yōu)選地，在磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT6，在磷高效利用轉(zhuǎn)基因植物培育中的應(yīng)用，優(yōu)選地，在磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆培育中的應(yīng)用。
7.一種宿主菌，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的植物表達載體pCAMBIA3301-0sPT6。
8.權(quán)利要求7所述的宿主菌在磷高效利用轉(zhuǎn)基因植物培育中的應(yīng)用，優(yōu)選地，在磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆培育中的應(yīng)用。
9.一種磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆0sPT6基因相對表達量的測定方法，其特征在于:以大豆GmSKIP 16作為內(nèi)參基因，通過qRT-PCR測定0sPT6基因在磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆中的表達量; 其中，檢測0sPT6基因上游引物FPT6:如SEQ ID N0.15所示，下游引物RPT6:如SEQ IDN0.16所示；
檢測GmSKIP16基因的上游引物FSKIP16:如SEQ IDN0.13所示;下游引物RSKIP16:如SEQ ID N0.14 所示。
10.一種磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆OsPT6基因相對表達量測定的試劑盒，其特征在于:該試劑盒包括如下序列: OsPT6基因檢測引物，上游引物FPT6:如SEQ ID N0.15所示，下游引物RPT6:如SEQ IDN0.16所示； GmSKIP16基因的檢測引物，上游引物FSKIP16:如SEQ ID N0.13所示；下游引物RSKIP16:如 SEQ ID N0.14 所示。
【文檔編號】A01H5/00GK104017824SQ201410277159
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月19日
【發(fā)明者】朱月林, 蓋鈞鎰, 閆聞, 楊立飛 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)