昆蟲Ⅱ型幾丁質(zhì)酶基因特異性dsRNA的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種昆蟲Ⅱ型幾丁質(zhì)酶基因(Cht10)特異性dsRNA的應(yīng)用，它可沉默Ⅱ型幾丁質(zhì)酶基因使飛蝗死亡，而對其他昆蟲并無影響。對飛蝗的Ⅱ型幾丁質(zhì)酶基因進行克隆、測序后，分析其功能域；然后選擇獨有幾丁質(zhì)結(jié)合域，設(shè)計序列為SEQ?ID?NO：1的該基因片段，用于特異性雙鏈RNA(dsRNA)的合成。該基因dsRNA注入飛蝗的體腔后，此種昆蟲蛻皮時無法順利蛻出進入下一齡期，導(dǎo)致死亡，死亡率達到100％。而其它昆蟲注射該dsRNA并不導(dǎo)致死亡。本發(fā)明為基于RNA干擾的專一害蟲防治提供靶標，可用于特定害蟲飛蝗的防治。
【專利說明】昆蟲II型幾丁質(zhì)酶基因特異性dsRNA的應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及昆蟲II型幾丁質(zhì)酶基因特異性dsRNA的應(yīng) 用。 【背景技術(shù)】
[0002] 對于農(nóng)業(yè)蟲害，我國長期施用有機氯、有機磷等化學(xué)殺蟲劑加以控制，這引起一系 列問題：害蟲出現(xiàn)抗藥性，需加大農(nóng)藥劑量，生產(chǎn)成本上升；農(nóng)藥殘留導(dǎo)致環(huán)境污染嚴重， 危害人類身體健康等。隨著社會的發(fā)展，迫切需要新型的害蟲防治方法。本發(fā)明提供一種 基于RNA干擾的害蟲防治應(yīng)用。
[0003] RNA干擾（RNAi)是一種通常由雙鏈RNA分子引起的特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象， 是21世紀以來十大熱門科技之一，并于2006年獲得諾貝爾獎。這一發(fā)現(xiàn)促進了生物學(xué)上 許多新方法、新技術(shù)的出現(xiàn)，并應(yīng)用于人們的生活當中，例如：人類的疾病治療、基因功能研 究和作物害蟲防治等。2008年，Price和Gatehouse總結(jié)了眾多實驗結(jié)果后，提出了基于 RNAi的害蟲防治策略?；赗NA干擾技術(shù)的害蟲防治具有如下優(yōu)勢：對害蟲獨有基因進行 干擾，抗蟲具有專一性，對高等動物和和人類是安全的；對環(huán)境無毒無害。
[0004] 昆蟲的幾丁質(zhì)酶基因家族包含多個基因，不同的基因負責(zé)不同的生物學(xué)功能。II 型幾丁質(zhì)酶基因即為昆蟲幾丁質(zhì)酶基因 lo(chtio)，它主要負責(zé)蛻皮時外骨骼幾丁質(zhì)的降 解，昆蟲缺失此基因后表現(xiàn)為蛻皮困難而致死。由于高等動物中并沒有同類型的基因，故對 該基因進行RNA干擾是安全的。該基因在不同昆蟲中分化較大，可以設(shè)計特異性的dsRNA 進行專一的害蟲防治，而不影響其他昆蟲。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的提供一種昆蟲II型幾丁質(zhì)酶基因特異性dsRNA在致死害蟲中的應(yīng) 用。
[0006] 本發(fā)明提供的昆蟲II型幾丁質(zhì)酶基因特異性dsRNA的應(yīng)用，其核苷酸序列是SEQ ID N0 :1。該序列是通過對飛蝗II型幾丁質(zhì)酶基因（LmChtlO)氨基酸序列分析后，選擇飛 幢所特有的幾丁質(zhì)結(jié)合域（chitin-binding domain, CBD)，設(shè)計上游引物SEQ ID N0 :2和下 游引物SEQ ID N0 :3,通過PCR擴增獲得SEQ ID N0 :1，其含有T7啟動子，核苷酸序列長度為 332bp。進一步利用試劑盒合成dsRNA(dsCBD)。
[0007] SEQ ID NO : 1合成的dsRNA(dsCBD)在致死害蟲中的應(yīng)用：注射上述dsRNA到昆蟲 體腔，結(jié)果表明：SEQ ID N0 :1合成的dsRNA可以特異性地沉默飛蝗II型幾丁質(zhì)酶基因的 mRNA表達，并導(dǎo)致飛蝗蛻皮困難而死亡。儲糧害蟲赤擬谷盜注射該dsRNA后，此昆蟲的II型 幾丁質(zhì)酶基因（TcChtlO)并沒有受到干擾，幼蟲也沒有出現(xiàn)蛻皮困難的情況，并可以發(fā)育 至成蟲。由此可見，該dsRNA只針對性的干擾飛蝗II型幾丁質(zhì)酶基因，而對其他昆蟲同源基 因并沒有影響。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0008] 圖1 :飛蝗II型幾丁質(zhì)酶基因功能域分布示意圖。黃色部分為幾丁質(zhì)酶催化域，綠 色部分為幾丁質(zhì)結(jié)合域。第一個幾丁質(zhì)結(jié)合域為飛蝗所特有，為紅圈標識。
[0009] 圖2 :飛蝗注射SEQ ID N0 :1合成的dsRNA，24h后飛蝗II型幾丁質(zhì)酶基因的mRNA 表達，β-actin做為內(nèi)參基因。**Ρ〈0·01。
[0010] 圖3 :五齡飛蝗注射SEQ ID NO :1合成的dsRNA后出現(xiàn)蛻皮困難而死亡的表型。左 側(cè)為注射dsGFP的對照，右側(cè)為注射SEQ ID N0 :1合成的dsRNA。
[0011] 圖4 :赤擬谷盜幼蟲注射SEQ ID NO : 1合成的dsRNA，24h后赤擬谷盜II型幾丁質(zhì)酶 基因的mRNA表達，β-actin做為內(nèi)參基因。
[0012] 圖5 :赤擬谷盜幼蟲注射SEQ ID N0 :1合成的dsRNA后發(fā)育正常。左側(cè)為注射dsGFP 的對照，右側(cè)為注射SEQ ID NO :1合成的dsRNA。 【具體實施方式】
[0013] 實施例1 :飛蝗II型幾丁質(zhì)酶基因特異性dsRNA的獲得
[0014] 1、飛蝗II型幾丁質(zhì)酶基因氨基酸序列分析
[0015] 基于飛蝗的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，采用生物信息學(xué)方法對飛蝗II型幾丁質(zhì)酶基因進行搜 索，經(jīng)過序列分析及比對后，獲得飛蝗II型幾丁質(zhì)酶基因（LmChtlO)序列，該序列編碼2964 個氨基酸。在SMART網(wǎng)站上對其進行功能域分析（http://smart, embl-heidelberg. de/)， 得到其獨有的幾丁質(zhì)結(jié)合域1 (圖1)。
[0016] 2、飛蝗II型幾丁質(zhì)酶基因特異性dsRNA合成
[0017] 1)飛蝗II型幾丁質(zhì)酶基因特異性dsRNA引物的設(shè)計
[0018] 基于飛蝗II型幾丁質(zhì)酶基因獨有的幾丁質(zhì)結(jié)合域1的序列，采用primer premier5. 0軟件設(shè)計。設(shè)計dsRNA引物，其序列分別為SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3。所有 引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。
[0019] 2)飛蝗II型幾丁質(zhì)酶基因特異性dsRNA的合成
[0020] 上述 dsRNA 引物合成序列為 SEQ ID N0 :1 的 PCR 產(chǎn)物，經(jīng)Wizard? SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)試劑盒純化后按照 T7RiboMAX?Express RNAi System (Promega) 試劑盒說明體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA(dsCBD)。dsRNA濃度采用酶標儀SpectraMaxl90測定，并 濃縮至終濃度為3 μ g/μ 1。
[0021] 實施例2 :飛蝗II型幾丁質(zhì)酶基因特異性dsRNA致死五齡飛蝗
[0022] 1、飛蝗II型幾丁質(zhì)酶基因特異性dsRNA注射
[0023] 將2 μ 1 (6 μ g) SEQ ID NO : 1的dsRNA (dsCBD)用25 μ 1規(guī)格微量注射器注射到五齡 飛蝗第2日齡若蟲二、三腹節(jié)之間，共注射30只，雌雄各半。注射相同體積濃度的dsGFP至 對照組體內(nèi)。將注射后飛蝗置于30°C恒溫生化培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。
[0024] 2、飛蝗II型幾丁質(zhì)酶基因沉默檢測
[0025] 對于五齡dsRNA注射后24h檢測其沉默效率，整蟲蟲體作為RNA提取對象，每組設(shè) 置3個生物學(xué)重復(fù)。提取各樣品的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，Real-time PCR檢測目 的基因（LmChtlO)和管家基因（β-actin)的相對表達量，以計算目的基因的沉默效率（圖 2)。
[0026] 3、注入dsRNA后五齡飛蝗表型的觀察
[0027] 五齡若蟲注射dsRNA后，對照組蟲體6天后開始蛻皮并在注射后第7天全部成功 發(fā)育至成蟲,蛻皮時間約為15min，蛻皮發(fā)育為成蟲后蟲體狀態(tài)良好。注射飛蝗II型幾丁質(zhì) 酶基因特異性dsRNA (dsCBD)的處理組若蟲共30頭，與對照組相比未出現(xiàn)蛻皮延遲的現(xiàn)象， 但蛻皮一直持續(xù)直至死亡。30頭若蟲均未能夠蛻至成蟲，死亡率達到100%。30頭死亡若 蟲出現(xiàn)表型（圖3)為：蝗蝻蛻皮時翅芽張開、背部弓起，舊表皮未開裂，腹部底端出現(xiàn)紅腫 腐爛，昆蟲死亡。
[0028] 實施例3 :飛蝗II型幾丁質(zhì)酶基因特異性dsRNA對赤擬谷盜幼蟲發(fā)育無影響。
[0029] 1、飛蝗II型幾丁質(zhì)酶基因特異性dsRNA注射赤擬谷盜
[0030] 將400ng SEQ ID NO : 1的dsRNA (dsCBD)用顯微注射儀注射到赤擬谷盜幼蟲體內(nèi)， 共注射28頭，雌雄各半。注射相同質(zhì)量的dsGFP至對照組體內(nèi)。將注射后赤擬谷盜幼蟲置 于30 °C恒溫生化培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。
[0031] 2、赤擬谷盜II型幾丁質(zhì)酶基因沉默檢測
[0032] 對于赤擬谷盜幼蟲dsRNA注射后24h檢測其沉默效率，整蟲蟲體作為RNA提取對 象，每組設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。提取各樣品的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，半定量PCR檢 測目的基因（TcChtlO)和管家基因（β-actin)的表達水平，以觀察其是否沉默（圖4)。
[0033] 3、注入dsRNA后赤擬谷盜幼蟲的觀察
[0034] 注射不同dsRNA后，兩組赤擬谷盜幼蟲在體長、重量及活躍度都無明顯差異，也均 可順利化蛹和羽化為成蟲，沒有出現(xiàn)蛻皮困難導(dǎo)致死亡的現(xiàn)象。
[0001]
【權(quán)利要求】
1. 一種昆蟲II型幾丁質(zhì)酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO : 1。
2. 如權(quán)利要求1所述的昆蟲II型幾丁質(zhì)酶基因的dsRNA的合成方法，用上游引物 SEQ ID NO :2,下游引物 SEQ ID NO :3,合成 PCR 產(chǎn)物，經(jīng)Wizard? SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)試劑盒純化后按照 T7RiboMAX?Express RNAi System (Promega)試劑盒說 明體外轉(zhuǎn)錄合成的dsRNA。
3. 如權(quán)利要求2所述方法合成的昆蟲II型幾丁質(zhì)酶基因的dsRNA。
4. 如權(quán)利要求3所述的dsRNA在致死飛蝗中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01N61/00GK104046641SQ201410292658
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月25日
【發(fā)明者】李大琪, 張建琴, 馬恩波, 張建珍, 孫毅 申請人:山西大學(xué)