一種通城虎的組織培養(yǎng)快繁方法
【專利摘要】一種通城虎的組織培養(yǎng)快繁方法，涉及通城虎（AristolochiafordianaHemsl）通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)獲得株系穩(wěn)定的種苗的育苗方法。本發(fā)明以通城虎帶節(jié)藤莖為外植體，通過(guò)誘導(dǎo)不定芽、叢生芽增殖培養(yǎng)、試管苗生根以及煉苗移栽等階段實(shí)現(xiàn)了通城虎種苗的組織培養(yǎng)快速繁殖。解決了通城虎大規(guī)模種植的種苗供應(yīng)，也為以通城虎藥材為原料的藥品生產(chǎn)提供了原料保證。
【專利說(shuō)明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說(shuō)，涉及一種通城虎的 組織培養(yǎng)快繁方法。 一種通城虎的組織培養(yǎng)快繁方法

【背景技術(shù)】
[0002] 通城虎CIrisio/ocAia /brt/iaflaHemsl)又五虎通城、定心草、天然草、血萎、血 藤暗消、一點(diǎn)血，為馬兜鈴科馬兜鈴屬)藤本藥用植物，是廣西民間著名草 藥，具有良好的鎮(zhèn)痛作用，民間用于痛傷、蛇傷、高熱等疾病的治療。通城虎富含馬兜鈴酸 (aristolochia acid),其根莖馬兜鈴酸含量高達(dá)0. 6%，馬兜鈴酸在國(guó)內(nèi)外的藥理及臨床研 究均證明有可靠的抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，并已進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，如 國(guó)外臨床應(yīng)用的"Tardolyt "及國(guó)內(nèi)的噬力酸片，均為馬兜鈴酸總酸。
[0003] 通城虎主要分布于廣西、云南等地，由于近年來(lái)各地大力推廣桉樹(shù)種植，煉山造林 頻繁以及除草劑使用等原因，野生資源急劇減少，無(wú)法滿足醫(yī)藥的需要。發(fā)展人工種植是解 決通城虎供需矛盾的途徑之一，目前通城虎種苗繁殖主要依靠種子繁殖以及分根、插蔓和 留蔸繁殖，這些繁殖方式速度慢、效率低，無(wú)法滿足通城虎規(guī)?；N植對(duì)優(yōu)質(zhì)種苗的需求， 因此，非常有必要建立一套完整的通城虎組織培養(yǎng)快繁體系。目前，通城虎組織培養(yǎng)技術(shù)尚 未見(jiàn)有報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種通城虎的組織培養(yǎng)快繁方法，通過(guò)誘導(dǎo)不定芽、叢生 芽增殖、試管苗生根、煉苗移栽等階段，使通城虎通過(guò)叢生芽的離體快繁方式獲得大量試管 苗，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0005] 本發(fā)明的一種通城虎的組織培養(yǎng)快繁方法，包括以下的工藝步驟： (1)誘導(dǎo)不定芽：選取通城虎帶節(jié)藤莖為外植體，經(jīng)75%?80%酒精消毒5?15秒種 后，用無(wú)菌水沖洗2?5次后置于0. 1%?0. 3%的升汞溶液中消毒10?30分鐘，然后用無(wú) 菌水沖洗3?6次，經(jīng)無(wú)菌濾紙吸干水分后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在25?28°C條件下全暗 培養(yǎng)，直至誘導(dǎo)形成不定芽。
[0006] (2)叢生芽增殖培養(yǎng)：將不定芽接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種后置于每 天光照12?15小時(shí)，光照強(qiáng)度為1000?15001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)， 20?30天轉(zhuǎn)接一次。
[0007] (3)試管苗生根：將長(zhǎng)至2?4cm的叢生芽分切接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)生 根，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)7?14天，然后置于每天光照12?15小時(shí)，光 照強(qiáng)度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)至生根。
[0008] (4)煉苗移栽：將長(zhǎng)至6?8cm的生根試管苗的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開(kāi)并置于自然光照 下煉苗5?7天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由泥炭土和河沙（1 : 1)混合成的基質(zhì)中并定植于大田中。
[0009] 上述步驟（1)所述所述的通城虎帶藤莖外植體在進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)之前需進(jìn)行預(yù)處 理，處理的方法是：將從野外采集的通城虎帶藤莖用自來(lái)水沖洗干凈泥沙后置于0. 01%? 0. 05%的高錳酸鉀溶液中浸泡4?8小時(shí)，再用自來(lái)水沖洗3?5次后膠塑料袋密封后置于 3?5°C冰箱中過(guò)夜備用。
[0010] 上述步驟（1)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：以GS為基本培養(yǎng)基，附加2. 0%?3. 5%蔗糖、 0. 35%?0. 5%瓊脂、0. 05%?0. 1%活性炭、0. 05%?0. 5%酸性水解酪蛋白以及0. 5?2. Omg/ L ΚΤ、0· 1 ?2. Omg/L IBA 和 0· 1 ?1. Omg/L 2, 4-D，pH 值為 5. 4 ?5. 8; 上述步驟（2)所述的增殖培養(yǎng)基為：以MS為基本培養(yǎng)基，附加0. 2?3. Omg/L 6-BA、 0· 1 ?1. 5mg/L NAA、1. 0 ?6. Omg/L 核黃素、0· 1 ?0· 5mg/L D-泛酸?丐、1. 0 ?6. Omg/L 抗壞血酸、1. 0?5. Omg/L L-半胱氨酸和2. 5%?3. 5%蔗糖、0. 35%?0. 5%瓊脂、0. 05%? 〇. 1%活性炭，pH值為5. 4?5. 8 ; 上述步驟（3)所述的生根培養(yǎng)基為：以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加0. 1?0. 8mg/L IBA、 0.1?l.Omg/L GGR (注：雙吉爾-GGR，購(gòu)自北京艾比蒂研究開(kāi)發(fā)中心）、0·5?2.5mg/L L-半胱氨酸和2. 0%?2. 5%蔗糖、0. 4%?0. 6%瓊脂、0. 05%?0. 1%活性炭，pH值為5. 4? 5. 8 ； 本發(fā)明具有的特點(diǎn)，本發(fā)明利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行通城虎種苗規(guī)?；a(chǎn)，建立 了通城虎的組織培養(yǎng)快繁方法，而本發(fā)明具有簡(jiǎn)單、易行、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。通過(guò)本發(fā)明育成的 通城虎試管苗移栽成活率達(dá)到93%以上，可以為通城虎規(guī)?；N植提供種苗保障。

【具體實(shí)施方式】
[0011] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0012] 實(shí)施例一 1、外植體預(yù)處理 將從野外采集的通城虎帶藤莖用自來(lái)水沖洗干凈泥沙后置于0. 03%的高錳酸鉀溶液 中浸泡5小時(shí)，再用自來(lái)水沖洗5次后膠塑料袋密封后置于:TC冰箱中過(guò)夜備用。
[0013] 2、培養(yǎng)過(guò)程 (1) 誘導(dǎo)不定芽：通城虎帶節(jié)藤莖經(jīng)75%酒精消毒8秒種后，用無(wú)菌水沖洗3次后置于 〇. 1%的升汞溶液中消毒15分鐘，然后用無(wú)菌水沖洗4次，經(jīng)無(wú)菌濾紙吸干水分后接種到誘 導(dǎo)培養(yǎng)基上，在28°C條件下全暗培養(yǎng)，培養(yǎng)45天后形成不定芽。所采用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為： 65+1.511^/11〇'+0.311^/1184和0.411^/12,4-0+3.5%蔗糖+0.35%瓊脂+0.08%活性炭 +0. 3%酸性水解酪蛋白，pH值為5. 8; (2) 叢生芽增殖培養(yǎng)：將不定芽接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種后置于每天光 照15小時(shí)，光照強(qiáng)度為ΙΟΟΟΙχ，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)，25天轉(zhuǎn)接一次，增殖系數(shù)為 5 ?7。所采用的增殖培養(yǎng)基為：MS+1. 5mg/L 6-BA+0. 5mg/L NAA +1. 0mg/L 核黃素+0· 5mg/ L D-泛酸鈣+1. 0mg/L抗壞血酸+1. 0mg/L L-半胱氨酸+3. 0%蔗糖+0. 35%瓊脂+0. 1%活性 炭，pH值為5.8 ; (3) 試管苗生根：將長(zhǎng)至2?4cm的叢生芽分切接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)生根，接 種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)7天，然后置于每天光照15小時(shí)，光照強(qiáng)度為30001χ，培養(yǎng) 溫度為28°C的條件下培養(yǎng)20天生根，生根率達(dá)95%。所采用的生根培養(yǎng)基為：1/2MS+0. 3mg/ L IBA+O. 6mg/L GGR+1. Omg/L L-半胱氨酸 +2. 0%% 蔗糖 +0· 4% 瓊脂 +0· 1% 活性炭，pH 值為 5. 8 ； (4)煉苗移栽：將長(zhǎng)至6?8cm的生根試管苗的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開(kāi)并置于自然光照下煉 苗5天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由泥炭土和河沙（1 :1)混合成 的基質(zhì)中并定植于大田中，成活率達(dá)92%。
[0014] 實(shí)施例二 1、外植體預(yù)處理 將從野外采集的通城虎帶藤莖用自來(lái)水沖洗干凈泥沙后置于0. 01%的高錳酸鉀溶液 中浸泡8小時(shí)，再用自來(lái)水沖洗3次后膠塑料袋密封后置于5°C冰箱中過(guò)夜備用。
[0015] 2、培養(yǎng)過(guò)程 (1) 誘導(dǎo)不定芽：通城虎帶節(jié)藤莖經(jīng)78%酒精消毒5秒種后，用無(wú)菌水沖洗5次后置于 0. 2%的升汞溶液中消毒10分鐘，然后用無(wú)菌水沖洗5次，經(jīng)無(wú)菌濾紙吸干水分后接種到誘 導(dǎo)培養(yǎng)基上，在25°C條件下全暗培養(yǎng)，培養(yǎng)42天后形成不定芽。所采用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為： GS+0. 8mg/L ΚΤ+0. 2mg/L IBA 和 0· 2mg/L 2, 4-D +3. 0% 蔗糖+0· 4% 瓊脂+0· 1% 活性炭+0· 5% 酸性水解酪蛋白，pH值為5. 6; (2) 叢生芽增殖培養(yǎng)：將不定芽接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種后置于每天光 照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為13001x，培養(yǎng)溫度為25°C的條件下培養(yǎng)，28天轉(zhuǎn)接一次，增殖系數(shù)為 4 ?6。所采用的增殖培養(yǎng)基為：MS+0. 8mg/L 6-BA+0. 3mg/L NAA +3. Omg/L 核黃素 +0· 3mg/ L D-泛酸鈣+3. 5mg/L抗壞血酸+4. 5mg/L L-半胱氨酸+3. 5%蔗糖+0. 5%瓊脂+0. 08%活性 炭，pH值為5.6 ; (3) 試管苗生根：將長(zhǎng)至2?4cm的叢生芽分切接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)生根，接 種后先在25°C條件下全暗培養(yǎng)10天，然后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為25001x，培養(yǎng) 溫度為25°C的條件下培養(yǎng)28天生根，生根率達(dá)92%。所采用的生根培養(yǎng)基為：1/2MS+0. 5mg/ L IBA+1. Omg/L GGR+2. 5mg/L L-半胱氨酸 +2. 5%% 蔗糖 +0. 4% 瓊脂 +0. 05% 活性炭，pH 值為 5. 6 ； (4) 煉苗移栽：將長(zhǎng)至6?8cm的生根試管苗的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開(kāi)并置于自然光照下煉 苗7天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由泥炭土和河沙（1 :1)混合成 的基質(zhì)中并定植于大田中，成活率達(dá)95%。
[0016] 實(shí)施例三 1、外植體預(yù)處理 將從野外采集的通城虎帶藤莖用自來(lái)水沖洗干凈泥沙后置于0. 05%的高錳酸鉀溶液 中浸泡4小時(shí)，再用自來(lái)水沖洗5次后膠塑料袋密封后置于5°C冰箱中過(guò)夜備用。
[0017] 2、培養(yǎng)過(guò)程 (1) 誘導(dǎo)不定芽：通城虎帶節(jié)藤莖經(jīng)80%酒精消毒5秒種后，用無(wú)菌水沖洗4次后置 于〇. 1%的升汞溶液中消毒13分鐘，然后用無(wú)菌水沖洗5次，經(jīng)無(wú)菌濾紙吸干水分后接種到 誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在25°C條件下全暗培養(yǎng)，培養(yǎng)47天后形成不定芽。所采用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基 為：GS+2. Omg/L ΚΤ+0. 8mg/L IBA 和 0· 4mg/L 2, 4-D +3. 5% 蔗糖 +0· 4% 瓊脂 +0· 05% 活性炭 +0. 3%酸性水解酪蛋白，pH值為5. 4; (2) 叢生芽增殖培養(yǎng)：將不定芽接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種后置于每天光
【權(quán)利要求】
1. 一種通城虎的組織培養(yǎng)快繁方法，其特征在于包括以下工藝步驟： (1) 誘導(dǎo)不定芽：選取通城虎帶節(jié)藤莖為外植體，經(jīng)75%?80%酒精消毒5?15秒種 后，用無(wú)菌水沖洗2?5次后置于0. 1%?0. 3%的升汞溶液中消毒10?30分鐘，然后用無(wú) 菌水沖洗3?6次，經(jīng)無(wú)菌濾紙吸干水分后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在25?28°C條件下全暗 培養(yǎng)，直至誘導(dǎo)形成不定芽； (2) 叢生芽增殖培養(yǎng)：將不定芽接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種后置于每天光 照12?15小時(shí)，光照強(qiáng)度為1000?15001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)，20? 30天轉(zhuǎn)接一次； (3) 試管苗生根：將長(zhǎng)至2?4cm的叢生芽分切接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)生根，接 種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)7?14天，然后置于每天光照12?15小時(shí)，光照強(qiáng)度 為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)至生根； (4) 煉苗移栽：將長(zhǎng)至6?8cm的生根試管苗的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開(kāi)并置于自然光照下煉 苗5?7天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入由泥炭土和河沙（1 :1)混 合成的基質(zhì)中并定植于大田中。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通城虎的組織培養(yǎng)快繁方法，其特征在于步驟（1)所述 的通城虎帶藤莖外植體在進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)之前需進(jìn)行預(yù)處理，處理的方法是：將從野外采 集的通城虎帶藤莖用自來(lái)水沖洗干凈泥沙后置于〇. 01%?〇. 05%的高猛酸鉀溶液中浸泡 4?8小時(shí)，再用自來(lái)水沖洗3?5次后膠塑料袋密封后置于3?5°C冰箱中過(guò)夜備用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通城虎的組織培養(yǎng)快繁方法，其特征在于步驟（1)所述 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：以GS為基本培養(yǎng)基，附加2. 0%?3. 5%蔗糖、0. 35%?0. 5%瓊脂、0. 05%? 〇· 1%活性炭、〇· 05%?0· 5%酸性水解酪蛋白以及0· 5?2. Omg/L ΚΤ、0· 1?2. Omg/L IBA 和 0· 1 ?1. Omg/L 2, 4-D，pH 值為 5· 4 ?5· 8。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通城虎的組織培養(yǎng)快繁方法，其特征在于步驟（2)所述 的增殖培養(yǎng)基為：以MS為基本培養(yǎng)基，附加0. 2?3. Omg/L 6-ΒΑ、0. 1?1. 5mg/L ΝΑΑ、 L 0 ?6. Omg/L 核黃素、0· 1 ?0· 5mg/L D_泛酸?丐、L 0 ?6. Omg/L抗壞血酸、L 0 ?5. Omg/L L-半胱氨酸和2. 5%?3. 5%蔗糖、0. 35%?0. 5%瓊脂、0. 05%?0. 1%活性炭，pH值為5. 4? 5. 8〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通城虎的組織培養(yǎng)快繁方法，其特征在于步驟（3)所述 的生根培養(yǎng)基為：以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加0. 1?0. 8mg/L ΙΒΑ、0. 1?1. 0mg/L GGR (注：雙吉爾-GGR，購(gòu)自北京艾比蒂研究開(kāi)發(fā)中心）、0· 5?2. 5mg/L L-半胱氨酸和2· 0%? 2. 5%蔗糖、0· 4%?0· 6%瓊脂、0· 05%?0· 1%活性炭，pH值為5. 4?5. 8。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104082138SQ201410297283
【公開(kāi)日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月28日
【發(fā)明者】梁鈞淞, 甘耀坤, 莫昭展, 梁曉菊, 梁林英, 潘潔明, 嚴(yán)翠瓊, 張燕飛, 吳鳳娟 申請(qǐng)人:玉林師范學(xué)院