利用單性游孢子進(jìn)行裙帶菜雜交育種的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及裙帶菜雜交育種的方法，具體的說是一種利用單性游孢子進(jìn)行裙帶菜雜交育種的方法。將雌配子體進(jìn)行孤雌生殖誘導(dǎo)產(chǎn)生孢子體，同時(shí)，將雌雄同體的配子體進(jìn)行發(fā)育培養(yǎng)產(chǎn)生自交孢子體。當(dāng)孢子體達(dá)到1mm以上時(shí)，轉(zhuǎn)入充氣培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)至性成熟。將成熟的孢子葉置于海水中進(jìn)行游孢子釋放，待海水顏色變?yōu)辄S褐色后，將游孢子附著在苗簾上，而后將苗簾置于新鮮海水中。孤雌生殖產(chǎn)生的孢子體釋放的游孢子全部為雌性游孢子，而雌雄同體的配子體自交產(chǎn)生的孢子體釋放的游孢子全部為雄性游孢子。本發(fā)明通過雌雄游孢子雜交技術(shù)改良雌雄配子體雜交技術(shù)，對于單克隆雜交育種大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐具有重要意義。
【專利說明】利用單性游孢子進(jìn)行裙帶菜雜交育種的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及裙帶菜雜交育種的方法，具體的說是一種利用單性游孢子進(jìn)行裙帶菜 雜交育種的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 裙帶菜種苗培育有游孢子采苗和配子體采苗兩種途徑，目前大規(guī)模育苗生產(chǎn)中以 前者為主，后者只起輔助作用。配子體克隆雜交育種的優(yōu)點(diǎn)在于能夠產(chǎn)生性狀高度一致的 孢子體后代，而傳統(tǒng)的游孢子育種則會出現(xiàn)孢子體后代性狀的分化。但是配子體采苗的主 要缺點(diǎn)是，配子體克隆接種到苗簾之后，只是靠藻體分泌的粘性物質(zhì)附著在苗繩上，其牢固 度非常差。而且幼孢子體在假根形成之前，依賴雌配子體附著在苗繩上。因此，這種松散的 附著強(qiáng)度造成出苗以后在海上暫養(yǎng)時(shí)脫苗情況非常嚴(yán)重。相比之下，游孢子對基質(zhì)的附著 強(qiáng)度要高得多。此外，采用配子體育苗，在數(shù)量上無法短時(shí)間滿足生產(chǎn)需求，需要耗費(fèi)大量 的時(shí)間、人力和財(cái)力進(jìn)行配子體的培養(yǎng)擴(kuò)增，而游孢子釋放量大，不存在這一弊端。因此，采 用單一性狀的雌性游孢子和雄性游孢子雜交既能得到性狀一致的孢子體后代，又能解決配 子體克隆育苗成本高昂，附苗率低，脫苗嚴(yán)重的問題，將會對裙帶菜大規(guī)模育苗生產(chǎn)產(chǎn)生積 極的推動作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的在于提供一種利用單性游孢子進(jìn)行裙帶菜雜交育種的方法。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0005] -種利用單性游孢子進(jìn)行裙帶菜雜交育種的方法，
[0006] 1)將雌性配子體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)至幼孢子體達(dá)到1mm以上轉(zhuǎn)入充氣培養(yǎng)條件下，完 成孤雌生殖孢子體的生活史，形成孤雌生殖成熟的孢子體；
[0007] 2)將雌雄同體的配子體進(jìn)行發(fā)育培養(yǎng)，產(chǎn)生自交孢子體，待孢子體長至1mm以上 時(shí)，轉(zhuǎn)入充氣培養(yǎng)條件下，完成自交孢子體的生活史，形成成熟的自交孢子體；
[0008] 3)將上述兩種成熟的孢子體的孢子葉置于海水中釋放得到兩種單一性別的游孢 子，待釋放得到游孢子的海水顏色為黃褐色后，將兩種游孢子水混合附著在苗簾上，而后將 苗簾放入新鮮海水中；
[0009] 4)上述附著游孢子的苗簾在光強(qiáng)50-80 μ mol photons m^V1，水溫18 - 22°C，光 周期12h白天：12h黑夜條件下培養(yǎng)13-15d，待萌發(fā)的游孢子全部發(fā)育成配子體并充分生長 后，降低光強(qiáng)至2-10 μ mol photons πΓ2^，延緩配子體的發(fā)育使其度過高水溫的夏季；
[0010] 5)將附著在苗簾上的雌雄配子體在50-80 μ mol photons m^V1光強(qiáng)下完成發(fā)育 和受精過程；待幼孢子體達(dá)到200-500 μ m左右，轉(zhuǎn)到海上栽培，實(shí)現(xiàn)裙帶菜的培育。
[0011] 所述步驟1)和2)將雌性配子體和雌雄同體配子體分別在PES海水培養(yǎng)基中以溫 度18-20°C，光照強(qiáng)度50 - 80μπι〇1 photons πΓΥ1，光周期12h白天：12h黑夜，分別靜止 培養(yǎng)至幼孢子體達(dá)到1mm，并每3-5天更換一次培養(yǎng)基；
[0012] 分別培養(yǎng)至1mm的幼孢子體在充氣培養(yǎng)條件下，以溫度18-20°c，光照強(qiáng)度50 - 80 μ mol photons m^V1，光周期12h白天：12h黑夜，培養(yǎng)至幼孢子體長度達(dá)到lcm，并每2-3 天更換一次PES海水培養(yǎng)基；
[0013] 培養(yǎng)至1cm的幼孢子體在4-18°C，利用自然海水充入空氣翻滾培養(yǎng)，形成性成熟 的孢子體，并每2-3天更新一次自然海水；其中，自然海水中添加終濃度為2. Smgr1的NaN03 和終濃度為〇· 2511^171的ΚΗ2Ρ04。
[0014] 所述PES培養(yǎng)基為每1L消毒海水中添加20mL制備液；制備液為每1L蒸餾水中加 入NaN0 33. 5g、KH2P040. 5g、鐵金屬液250mL和金屬液250mL ;經(jīng)溶解消毒，冷卻待用；鐵金屬 液為，每1L蒸饋水中加入Fe (NH4)2 (S04)2 · 6H200. 702g和Na2EDTA0. 6g ;金屬液為，每1L蒸 餾水中加入 Na2EDTAlg，Η3Β031· 14g，F(xiàn)eCl3 · 6H2049mg，MnS04 · H20164mg，ZnS04 · 7H2022mg 和 C〇S04 · 7Η204· 8mg。
[0015] 所述步驟3)將成熟的孢子體孢子葉割下消毒除雜藻后，陰干30 - 60min，將孢子 葉放入海水中放散得游孢子，待放散得游孢子的海水顏色變?yōu)辄S褐色后，游孢子放入苗簾， 孢子附著密度控制在120倍放大倍數(shù)下60 - 100個(gè)附著的游孢子，而后將苗簾放入新鮮海 水中。
[0016] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)
[0017] 1.本發(fā)明選育的方法是通過孤雌生殖誘導(dǎo)雌性配子體克隆產(chǎn)生的孢子體成熟后， 釋放的游孢子全部為雌性游孢子，萌發(fā)后形成的雌性配子體與最初的雌性配子體克隆在遺 傳上是完全一致的。
[0018] 2.本發(fā)明選育方法采用雌雄同體的配子體自交產(chǎn)生的孢子體成熟后，釋放的游孢 子全部為雄性游孢子，萌發(fā)后形成的雄性配子體與最初的雄性配子體克隆在遺傳上是完全 一致的。
[0019] 3.孤雌生殖產(chǎn)生的孢子體和雌雄同體的配子體自交產(chǎn)生的孢子體成熟后，釋放的 游孢子及其形成的配子體都可以牢固的附著在苗繩上，其牢固程度可以耐受高壓水槍的沖 洗。
[0020] 4.本發(fā)明選育方法中游孢子附著到苗簾后，通過雙高光技術(shù)控制配子體的生長、 度夏和發(fā)育過程。
[0021] 5.本發(fā)明中孤雌生殖孢子體成熟后釋放的游孢子形成的雌性配子體與雌雄同體 配子體自交孢子體成熟后釋放的游孢子形成的雄性配子體克隆雜交，產(chǎn)生的子一代孢子體 在遺傳上也是高度一致的，類似于配子體克隆單一交配組合后代。
[0022] 6.本發(fā)明孤雌生殖產(chǎn)生的游孢子與親本雌性配子體具有完全一致的遺傳背景，因 此可以取代雌配子體進(jìn)行良種選育和種苗培育。
[0023] 7.本發(fā)明雌雄同體配子體自交孢子體產(chǎn)生的游孢子與親本雄性配子體具有完全 一致的遺傳背景，因此可以取代雄配子體進(jìn)行良種選育和種苗培育。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 具體為，將雌配子體進(jìn)行孤雌生殖誘導(dǎo)產(chǎn)生孢子體，同時(shí)，將雌雄同體的配子體進(jìn) 行發(fā)育培養(yǎng)產(chǎn)生自交孢子體。當(dāng)孢子體達(dá)到1mm以上時(shí)，轉(zhuǎn)入充氣培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)至性成 熟。將成熟的孢子葉置于海水中進(jìn)行游孢子釋放，待海水顏色變?yōu)辄S褐色后，將游孢子附著 在苗簾上，而后將苗簾置于新鮮海水中。孤雌生殖產(chǎn)生的孢子體釋放的游孢子全部為雌性 游孢子，而雌雄同體的配子體自交產(chǎn)生的孢子體釋放的游孢子全部為雄性游孢子。所得雌 性游孢子與雄性游孢子附著在同一苗繩上共同培養(yǎng)，完成發(fā)育和受精過程，相當(dāng)于傳統(tǒng)的 游孢子采苗技術(shù)。待幼孢子體達(dá)到200 μ m左右，轉(zhuǎn)到海上栽培，完成裙帶菜的培育。
[0025] 實(shí)施例1
[0026] 將雌性配子體和雌雄同體的配子體分別在PES海水培養(yǎng)基中以溫度18°C，光照強(qiáng) 度60 μ mol photons m^V1，光周期12h白天：12h黑夜；并每3天更換一次培養(yǎng)基的條件下 靜止培養(yǎng)20天后，孢子體達(dá)到1mm以上，轉(zhuǎn)到2L燒杯中充入空氣，以溫度18°C，光照強(qiáng)度 60μηιο1 photons m^V1，光周期12h白天：12h黑夜；并每3天更換一次PES海水培養(yǎng)基的條 件下培養(yǎng)至幼孢子體長度達(dá)到lcm ;將長度達(dá)到lcm的幼孢子體分別轉(zhuǎn)到80升PP水箱利用 自然海水充入空氣翻滾培養(yǎng)（翻滾培養(yǎng)方式請參考Pang，S. J.，Liu，F(xiàn).，Shan，T. F.，Gao, S. Q. and Zhang, Z. H. 2009. Cultivation of the brown alga Sargassum horneri: sexual reproduction and seedling production in tank culture under reduced solar irradiance in ambient temperature. J.Appl.Phycol. 21:413-22·)，培養(yǎng)幼抱子體的自然 海水中再添加 2. Smgr1的NaN03和0. 2511^171的KH2P04，并每2天更新一次添加添加 2. Smgr1 的NaN03和0. 2511^171的ΚΗ2Ρ04的自然海水，水溫的季節(jié)變化范圍為4-18°C，進(jìn)而形成孤雌 生殖成熟的孢子體和雌雄同體自交成熟的孢子體。
[0027] 所述PES培養(yǎng)基為每1L消毒海水中添加20mL制備液；制備液為每1L蒸餾水中加 入NaN0 33. 5g、KH2P040. 5g、鐵金屬液250mL和金屬液250mL ;經(jīng)溶解消毒，冷卻待用；鐵金屬 液為，每1L蒸饋水中加入Fe (NH4)2 (S04)2 · 6H200. 702g和Na2EDTA0. 6g ;金屬液為，每1L蒸 餾水中加入 Na2EDTAlg，Η3Β031· 14g，F(xiàn)eCl3 · 6H2049mg，MnS04 · H20164mg，ZnS04 · 7H2022mg 和 C〇S04 · 7Η204· 8mg。
[0028] 待上述孢子體成熟，將孢子葉割下，用消毒紗布反復(fù)擦拭孢子葉表面，除去表面附 著的雜藻，陰干30 - 60min，將孢子葉放入海水中放散游孢子，待釋放得到游孢子的海水顏 色變?yōu)辄S褐色后，放入16m長的苗繩，孢子附著密度控制在120倍放大倍數(shù)下60 - 100個(gè)附 著的游孢子即可，之后將苗繩放入新鮮海水中。在光強(qiáng)50 μ mol photons πΓ2^，水溫18 - 22°C，光周期12h白天：12h黑夜條件下培養(yǎng)15d，萌發(fā)的游孢子全部發(fā)育成配子體并充分生 長，之后降低光強(qiáng)至10 μ mol photons m^V1以下，延緩配子體的發(fā)育，使其度過高水溫的夏 季。
[0029] 孢子體成熟后，釋放的游孢子及其發(fā)育形成的配子體都可以牢固的附著在苗繩 上，其牢固程度可以耐受高壓水槍的沖洗。
[0030] 游孢子附著到苗簾后，通過雙高光技術(shù)控制配子體的生長、度夏和發(fā)育過程。具 體為，第一高光期光強(qiáng)控制在50μπι 〇1 photons nr2。1，使配子體充分生長，之后降低光強(qiáng)至 10 μ mol photons m^V1以下，延緩配子體的生長，度過夏季高水溫。第二高光期光強(qiáng)提高 至50 μ mol photons nT2s4以上，使雌雄配子體同時(shí)發(fā)育，完成受精。
[0031] 受精形成的幼孢子體達(dá)到200 μ m左右，轉(zhuǎn)到裙帶菜主栽培區(qū)--大連旅順黃金山 海區(qū)，海上暫養(yǎng)10天，然后夾苗，完成海上養(yǎng)成。
[0032] 實(shí)施例2
[0033] 若實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)培育，可將孤雌生殖產(chǎn)生的孢子體和雌雄同體自交產(chǎn)生的孢子
【權(quán)利要求】
1. 一種利用單性游孢子進(jìn)行裙帶菜雜交育種的方法，其特征在于： 1) 將雌性配子體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)至幼孢子體達(dá)到1_以上轉(zhuǎn)入充氣培養(yǎng)條件下，完成孤 雌生殖孢子體的生活史，形成孤雌生殖成熟的孢子體； 2) 將雌雄同體的配子體進(jìn)行發(fā)育培養(yǎng)，產(chǎn)生自交孢子體，待孢子體長至1_以上時(shí)，轉(zhuǎn) 入充氣培養(yǎng)條件下，完成自交孢子體的生活史，形成成熟的自交孢子體； 3) 將上述兩種成熟的孢子體的孢子葉置于海水中釋放得到兩種單一性別的游孢子，待 釋放得到游孢子的海水顏色為黃褐色后，將兩種游孢子水混合附著在苗簾上，而后將苗簾 放入新鮮海水中； 4) 上述附著游孢子的苗簾在光強(qiáng)50-80 μ mol photons m^V1，水溫18 - 22°C，光周期 12h白天：12h黑夜條件下培養(yǎng)13-15d，待萌發(fā)的游孢子全部發(fā)育成配子體并充分生長后， 降低光強(qiáng)至2-10 μ mol photons πΓ2^，延緩配子體的發(fā)育使其度過高水溫的夏季； 5) 將附著在苗簾上的雌雄配子體在50-80 μ mol photons nT2s4光強(qiáng)下完成發(fā)育和受 精過程；待幼孢子體達(dá)到200-500 μ m左右，轉(zhuǎn)到海上栽培，實(shí)現(xiàn)裙帶菜的培育。
2. 按權(quán)利要求1所述的利用單性游孢子進(jìn)行裙帶菜雜交育種的方法，其特征在于： 所述步驟1)和2)將雌性配子體和雌雄同體配子體分別在PES海水培養(yǎng)基中以溫度 18_20°C，光照強(qiáng)度50 - 80μηιο1 photons ηι?光周期12h白天：12h黑夜，分別靜止培 養(yǎng)至幼孢子體達(dá)到1mm，并每3-5天更換一次培養(yǎng)基； 分別培養(yǎng)至1mm的幼孢子體在充氣培養(yǎng)條件下，以溫度18-20°C，光照強(qiáng)度50 - 80 μ mol photons m^V1，光周期12h白天：12h黑夜，培養(yǎng)至幼孢子體長度達(dá)到lcm，并每2-3 天更換一次PES海水培養(yǎng)基； 培養(yǎng)至lcm的幼孢子體在4-18°C，利用自然海水充入空氣翻滾培養(yǎng)，形成性成熟的孢 子體，并每2-3天更新一次自然海水；其中，自然海水中添加終濃度為2. Smgr1的NaN03和 終濃度為 〇· 2511^171 的 ΚΗ2Ρ04。
3. 按權(quán)利要求1所述的利用單性游孢子進(jìn)行裙帶菜雜交育種的方法，其特征在于： 所述PES培養(yǎng)基為每1L消毒海水中添加20mL制備液；制備液為每1L蒸餾水中加入 NaN033. 5g、KH2P040. 5g、鐵金屬液250mL和金屬液250mL ;經(jīng)溶解消毒，冷卻待用；鐵金屬液 為，每1L蒸饋水中加入Fe (NH4)2(S04)2 · 6H200. 702g和Na2EDTA0. 6g ;金屬液為，每1L蒸饋 水中加入 Na2EDTAlg，Η3Β031· 14g，F(xiàn)eCl3 · 6H2049mg，MnS04 · H20164mg，ZnS04 · 7H2022mg 和 C〇S04 · 7Η204· 8mg。
4. 按權(quán)利要求1所述的利用單性游孢子進(jìn)行裙帶菜雜交育種的方法，其特征在于：所 述步驟3)將成熟的孢子體孢子葉割下消毒除雜藻后，陰干30 - 60min，將孢子葉放入海水 中放散得游孢子，待放散得游孢子的海水顏色變?yōu)辄S褐色后，游孢子放入苗簾，孢子附著密 度控制在120倍放大倍數(shù)下60 - 100個(gè)附著的游孢子，而后將苗簾放入新鮮海水中。
【文檔編號】A01G33/00GK104094832SQ201410305405
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】逄少軍, 李靜, 單體鋒 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所