水稻白綠葉基因wgl1及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用圖位克隆技術克隆水稻白綠葉WGL1(WHITE?GREEN?LEAF1)基因，以及利用轉基因互補實驗鑒定該基因的功能；同時還涉及利用該基因研究水稻葉綠素合成和葉綠體發(fā)育，用以解釋水稻葉色變化的分子機制，提高水稻的產量。具體而言，本發(fā)明公開了一種水稻白綠葉基因WGL1編碼的蛋白質，該蛋白質為SEQ?ID?No：3所示的氨基酸序列。本發(fā)明還同時公開了編碼上述蛋白質的水稻白綠葉基因WGL1，該基因為SEQ?ID?No：1、SEQ?ID?No：2所示的核苷酸序列。該水稻白綠葉基因WGL1的用途是：用于構建轉基因水稻，所述轉基因水稻的葉色得以改良。
【專利說明】水稻白綠葉基因 WGL1及其用途

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領域。具體的說，本發(fā)明涉及一種利用圖位克隆技術克 隆水稻白綠葉WGL1 (WHITE GREEN LEAF1)基因，以及利用轉基因互補實驗鑒定該基因的功 能；同時還涉及利用該基因研究水稻葉綠素合成和葉綠體發(fā)育，用以解釋水稻葉色變化的 分子機制，提高水稻的產量。

【背景技術】
[0002] 光合作用為水稻的生長提供了物質來源和能量來源，葉綠體是進行光合作用的重 要場所，同時也是光合色素的載體，廣泛分布在葉片綠色組織細胞中。葉綠素是植物進行光 合作用的主要色素，參與天線復合體上光能的捕獲，電荷的分離以及電子傳遞。葉綠素的合 成從谷氨酸（glutamate)開始到最終形成葉綠素 a (Chi a)和葉綠素 b (Chi b)，共需18種 酶催化完成。在此過程中任何內部、外部條件的變化都會導致葉色變異而表現為缺綠癥狀， 如白化、黃化、條紋、斑馬等葉色異常表型。目前已分離出多個與葉綠素合成相關的基因，主 要有包括編碼葉綠素 a氧化酶OsCAOl和0sCA02和編碼鎂離子螯合酶的0sCHLD、0sCHLH和 OsCHLI，而編碼聯(lián)乙烯還原酶的OsDVR基因以及編碼葉綠素合成酶的YGL1基因也已經確定 與葉綠素合成有關。
[0003] 高等植物葉綠體的發(fā)育需經過一系列復雜的變化過程，需要細胞核基因編碼的蛋 白和葉綠體編碼的蛋白協(xié)調參與完成。在黑暗條件中，葉片中非光合作用的前質體發(fā)育成 黃化質體，黃化質體中含有晶格狀的原片層，經光照黃化質體不斷分化發(fā)育形成葉綠體。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種與水稻葉色變異相關的蛋白質及其基因，以 及由此獲得的轉基因植物細胞，和利用所述基因對水稻葉片顏色進行改造的方法。
[0005] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種水稻白綠葉基因 WGL1編碼的蛋白質，該 蛋白質為SEQ ID No :3所不的氣基酸序列。
[0006] 作為本發(fā)明的水稻白綠葉基因 WGL1編碼的蛋白質的改進：所述氨基酸序列還包 括在SEQ ID No :3所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸或其他物 種的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
[0007] 本發(fā)明還同時提供了編碼上述蛋白質的水稻白綠葉基因 WGL1，該基因具有SEQ ID No :1、SEQ ID No :2所示的核苷酸序列。
[0008] 備注說明：SEQ ID N0 :1為cDNA全長，該序列起始處的"atg"是起始密碼子，末尾 處的"tga"為終止密碼子。
[0009] SEQ ID N0 :2 為 gDNA 全長。
[0010] 作為本發(fā)明的水稻白綠葉基因 WGL1的改進：所述核苷酸序列還包括在SEQ ID No :1和2所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、 等位基因或衍生物。 toon] 本發(fā)明還同時提供了含有上述基因的質粒。
[0012] 本發(fā)明還同時提供了含有上述基因的植物表達載體。
[0013] 本發(fā)明還同時提供了含有上述基因的宿主細胞。
[0014] 作為本發(fā)明的宿主細胞的改進：該細胞為大腸桿菌細胞、農桿菌細胞或植物細胞。
[0015] 本發(fā)明還同時提供了改良水稻葉片顏色的方法：包括用為SEQ ID No :1、SEQ ID No :2所示的核苷酸序列的基因轉化水稻細胞，再將轉化后的水稻細胞培育成植株。
[0016] 本發(fā)明還同時提供了上述水稻白綠葉基因 WGL1的用途：用于構建轉基因水稻，所 述轉基因水稻的葉色得以改良。
[0017] 進一步作如下具體說明：
[0018] 本發(fā)明的目的是提供一種從水稻白綠葉突變體wgll中克隆的新基因 WGL1，具有 如 SEQ ID No :1 和 SEQ ID No :2 所示的 DNA 序列，也包括與 SEQ ID No :1 和 SEQ ID No :2 所示的DNA序列至少有70%同源性的基因序列。本發(fā)明中的SEQ ID No :3所示的蛋白質 屬于NADPH-原葉綠素酸酯氧化還原酶蛋白，其中進行一個或幾個替換，插入或缺失所獲得 的功能類似物。另外，也包括在SEQ ID No :1和SEQ ID No :2中添加、取代、插入或缺失一 個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能達到本發(fā) 明的目的。
[0019] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種用WGL1基因進行高效的植物轉化的方法，具體 地說，本發(fā)明提供了具有SEQ ID No :1和SEQ ID No :2所示的序列的基因或基因部分片段 的載體，其中，如圖4所示的pCAMBIA1300-WGLl，該載體可以表達有上述核苷酸序列編碼的 多肽或其同源類似物。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種利用植物表達載體轉化植物細胞影響水稻葉色變化的方法。 具體地是利用植物表達載體轉化植物細胞以影響水稻葉色的方法。
[0021] 實現本發(fā)明的具體技術步驟如下：
[0022] -、水稻葉色白綠葉突變體wgll分離和遺傳分析：
[0023] 本發(fā)明的水稻葉色白綠葉變體wgll來自日本晴EMS(Ethyl Methyl Sulfonate) 誘變產生的突變。wgll通過與野生型水稻的正交實驗，證明該突變體受隱性單基因控制，如 圖1所示。
[0024] 二、圖位克隆控制水稻白化性狀的WGL1基因：
[0025] 1)、WGL1基因的初步定位：
[0026] 為了分離WGL1基因，本發(fā)明首先組建了 一個定位群體，由wgll與秈稻品種 TNI (Indica)雜交組配成F2定位群體，再通過圖位克隆的方法，利用STS、SSR等分子標記對 WGL1位點進行初步定位，將其初步定位在第10號染色體長臂上，并介于ks9-37與ks9-39 兩標記之間，見圖2。
[0027] 2)、WGL1基因的精細定位與預測：
[0028] 通過對ks9-37與ks9-39兩個標記之間的BAC序列分析，發(fā)展新的SSR、STS標記 將WGL1精確定位于BAC AC068923上ks9-38與ks9-17標記之間54-kb范圍之內（圖3)， 通過分析此區(qū)段開放閱讀框（0RF)推測候選基因。
[0029] 3)、WGL1基因的鑒定和功能分析：
[0030] 通過轉基因技術，結果表明本發(fā)明獲得了使突變體恢復正常表型的轉基因水稻 (圖5)，證明本發(fā)明正確克隆了 WGL1基因，氨基酸序列分析表明WGL1編碼NADPH-原葉綠 素酸酯氧化還原酶蛋白（POR)。
[0031] 水稻葉片白綠的主要原因是由于NADPH-原葉綠素酸酯氧化還原酶突變后葉綠素 合成受阻，葉綠體發(fā)育缺陷，闡明葉綠素合成與光合作用的分子機制，對解決水稻葉色變異 問題，提高光合效率，創(chuàng)制高光效育種具有重要意義。WGL1基因的克隆和應用，能夠用于改 善葉片顏色，延緩葉片衰老。因而，本發(fā)明對進一步闡明水稻葉色變異的機制以及葉綠素合 成過程，最終提高水稻產量具有一定理論意義。
[0032] 綜上所述，本發(fā)明利用水稻白綠葉突變體，通過圖位克隆技術首次在水稻中克隆 到了 WGL1基因，該基因編碼NADPH-原葉綠素酸酯氧化還原酶蛋白（P0R)，在水稻中參與葉 綠素的合成，其它物種的同源基因主要通過影響葉綠素的合成和葉綠體的發(fā)育而引起葉色 變異。通過對WGL1基因的功能解讀，進一步闡明了葉綠素合成和葉綠體發(fā)育的機制，同時 為研究葉色變異的分子機制打下基礎。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 下面結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0034] 圖1是水稻白綠葉突變體wgll與野生型材料的表型（從左到右依次為：日本晴、 日本晴背景的wgll);
[0035] 圖A為：突變體和野生型苗期的表型，突變體老葉葉尖變白；
[0036] 圖B為：突變體和野生型分蘗期的表型，突變體老葉葉尖變白，而且白色部分有少 量褐色壞死斑點；
[0037] 圖C為：突變體分蘗期同一葉片葉尖白色（I)和葉片下部淡綠色（II)的表型，葉 尖變白并伴隨褐色病斑，葉下部淡綠；
[0038] 圖D為：突變體和野生型成熟期的表型，突變體葉片恢復淡綠。
[0039] 圖2是WGL1基因在水稻第10染色體上的初步定位圖。
[0040] 圖3是WGL1基因的精細定位圖；
[0041] 圖 4 是 pCAMBIA1300-WGLl 載體圖譜；
[0042] 圖5是功能互補實驗?；代轉基因水稻（從左到右依次為：wgll植株表型為葉尖蒼 白并伴有褐色病斑；日本晴轉化互補載體PCAMBIA1300-WGL1 1；轉基因株，表型與普通日本 晴無明顯變化;wgll轉化互補載體pCAMBIA1300-WGLl，葉色表型恢復正常）；
[0043] 備注說明：圖5中，"：："前是材料名稱，后是所轉載體名稱。
[0044] 圖6是突變體wgll與NIP苗期、分蘗期、成熟期的光合色素含量對比圖；
[0045] 圖A為：葉綠素 a含量；圖B為：葉綠素 b含量；圖C為：類胡蘿卜素含量；圖D為： 葉綠素 a/b ;圖E為：分蘗期野生型和突變體葉片白色部分和淡綠部分的光合色素含量；圖 F為：分蘗期野生型和突變體葉片白色部分和淡綠部分的葉綠素 a/b。
[0046] 圖7是突變體和野生型的透射電鏡結果圖；
[0047] 圖A為：野生型葉肉細胞；圖B為：突變體wgll葉片綠色部分的葉肉細胞；圖C為： 突變體wgll葉片蒼白部分的葉肉細胞；圖D為：野生型葉綠體的結構；圖E為：突變體wgll 葉片綠色部分的葉綠體的結構；圖F為：突變體wgll葉片蒼白部分的葉綠體結構；
[0048] CP-葉綠體；G-基粒；SG-淀粉粒。

【具體實施方式】
[0049] 實施例1 :
[0050] 1、水稻材料：
[0051] 水稻（Oryza sativa L.)突變體wgll (white green leaf 1)，原始野生材料為粳稻 品種"日本晴"。
[0052] 水稻白綠葉突變體wgll來自日本晴EMS(Ethyl Methyl Sulfonate)誘變產生的 突變（如圖1所示），該突變體是在中國浙江省境內獲得。
[0053] wgll通過與野生型品種（即，秈稻品種TN1)的正交實驗構建遺傳群體，進行遺傳 分析。實驗的結果為：在M2代群體中隨機選擇51個單株進行遺傳分析，34株為野生型表 型，17株為突變型表型，卡平方檢測結果（乂 2=1.84〈乂20 . 05 = 3 . 84)，分離比符合3:1， 說明該突變表型由單隱性核基因控制。以突變體wgll為母本，TN1為父本進行正交所得的 F1代植株全部表現為正常表型，F2代種子播種四周后，隨機選200個單株其中156株表現 為野生型表型，44株表現為突變型表型?？ㄆ椒綑z測結果（X 2 = 0· 95〈 X 20· 05 = 3. 84)， 正常植株表型和突變體植株表型分離比符合3 :1 ;進一步證明該突變表型受隱性單隱性核 基因控制。
[0054] 2、分析和定位群體：
[0055] 純合的wgl 1突變體和野生型品種秈稻品種TN1進行雜交，Fi代自交，得到F2群體。 并從中選出1000株表型明顯的白綠葉wgll突變個體作為定位群體。在三葉期期每株取1 克左右的嫩葉，用來提取總DNA。
[0056] 3、SSR和STS標記定位WGL1基因：
[0057] 采用水稻微量DNA的快速提取方法從水稻葉片中提取用于基因定位的基因組 DNA。取大約0. 2g水稻葉片，經液氮冷凍，在直徑5cm的小研缽中磨成粉狀，轉移到1. 5ml 離心管里提取DNA，獲得的DNA沉淀溶解于150 μ 1超純水中。每一個PCR反應用2 μ 1 DNA 樣品。WGL1基因的初步定位：在wgll與TN1組合的F2群體中選取21個隱性個體，根據公 布的粳稻和秈稻創(chuàng)建的分子遺傳圖譜，選取近似均勻分布于各條染色體上的SSR引物，根 據已知的反應條件進行PCR擴增，經5%瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙啶（EB)染色，檢測 PCR產物的多態(tài)性，將WGL1初步定位在第10號染色體長臂上，ks9-37與ks9-39兩STS標 記之間（如圖2所示）。
[0058] WGL1基因的精細定位：選取wgll與TN1組合的F2群體中共630株隱性個體，在 初定位的基礎上進一步設計SSR和STS標記，最終將WGL1精確定位于精確定位于BAC號為 AC068923上54-kb范圍之內，兩邊的分子標記為ks9-38與ks9-17引物序列為：
[0059] ks9-38F ：ACAGGTCCAACTAATTACATATA,
[0060] ks9-38R ：AAAGTGAGTCACAAATAAAAG ；
[0061] ks9-17F ： TGCAGCGCAGTTTATACACTGTT,
[0062] ks9-17R :TGACACTGTTTCTGGTACTGTTTTACA。
[0063] 如圖3所示。
[0064] 上文中涉及的引物序列見表1。
[0065] 表1、WGL1基因的定位標記序列
[0066]

【權利要求】
1. 水稻白綠葉基因 WGL1編碼的蛋白質，其特征在于：該蛋白質為SEQ ID No :3所示的 氨基酸序列。
2. 根據權利要求1所述的水稻白綠葉基因 WGL1編碼的蛋白質，其特征在于：所述氨基 酸序列還包括在SEQ ID No :3所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基 酸或其他物種的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
3. 編碼權利要求1或2所述蛋白質的水稻白綠葉基因 WGL1，其特征在于：該基因為SEQ ID No :1、SEQ ID No :2所示的核苷酸序列。
4. 根據權利要求3所述的水稻白綠葉基因 WGL1，其特征在于：所述核苷酸序列還包括 在SEQ ID No :1和2所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一個或多個核苷酸而生成 的突變體、等位基因或衍生物。
5. -種含有權利要求3或4所述基因的質粒。
6. -種含有權利要求3或4所述基因的植物表達載體。
7. 宿主細胞，其特征在于：該宿主細胞含有權利要求3或4所述的基因。
8. 根據權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于：該細胞為大腸桿菌細胞、農桿菌細胞 或植物細胞。
9. 一種改良水稻葉片顏色的方法，其特征在于：包括用為SEQ ID No :1、SEQ ID No :2 所示的核苷酸序列的基因轉化水稻細胞，再將轉化后的水稻細胞培育成植株。
10. 如權利要求3或4所述的水稻白綠葉基因 WGL1的用途，其特征在于：用于構建轉 基因水稻，所述轉基因水稻的葉色得以改良。
【文檔編號】A01H5/00GK104087561SQ201410326612
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月10日 優(yōu)先權日:2014年7月10日
【發(fā)明者】錢前, 朱麗, 曾大力, 康書靜, 楊窯龍, 胡江, 張光恒, 徐杰, 郭龍彪, 董國軍, 高振宇, 任德勇, 顏美仙 申請人:中國水稻研究所