一種誘導(dǎo)楸樹體細(xì)胞胚發(fā)生的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)楸樹體細(xì)胞胚發(fā)生的方法，該方法是將成熟的楸樹種子經(jīng)過消毒后，放置于誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基中經(jīng)過暗培養(yǎng)生成愈傷組織，然后愈傷經(jīng)過繼代增殖培養(yǎng)后獲得大量的愈傷，最后將愈傷平鋪于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)楸樹體細(xì)胞胚的發(fā)生。本發(fā)明為楸樹利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗病蟲的新品種提供了一個(gè)成熟的再生體系。
【專利說明】一種誘導(dǎo)楸樹體細(xì)胞胚發(fā)生的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)的方法，尤其涉及一種植物組織培養(yǎng)技術(shù)，具體為 楸樹體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)發(fā)生。

【背景技術(shù)】
[0002] 楸樹（Catalpa bungei)為紫葳科（Bignoniaceae)梓屬（Catalpa)高大喬木，原產(chǎn) 中國(guó)，已有2000多年的栽培歷史。楸樹樹體高大挺拔，樹冠濃密，枝、葉和花都具有很高的 觀賞價(jià)值，其木材質(zhì)地堅(jiān)韌致密，不易蟲蛀、耐磨、耐腐、隔潮，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在中國(guó) 豐富的樹木資源中，惟其"材"貌雙全，自古素有"木王"之美稱。楸樹的適應(yīng)性強(qiáng)，分布于 我國(guó)東起海濱，西至甘肅，南始云南，北到長(zhǎng)城的廣大區(qū)域內(nèi)，是可以大面積栽培的優(yōu)良珍 貴的用材樹種。近年來楸樹病蟲害比較嚴(yán)重，限制了楸樹的大面積推廣。因此利用轉(zhuǎn)基因 技術(shù)培育抗病蟲楸樹新品種對(duì)楸樹人面積的推廣具有重要的意義。
[0003] 高頻率的再生體系是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)之一。目前，楸樹的再生體系主要以 器官發(fā)生途徑為主，但該體系產(chǎn)生的嵌合體較多。體細(xì)胞胚胎發(fā)生是在離體培養(yǎng)條件下，植 物離體培養(yǎng)的細(xì)胞、組織、器官可以產(chǎn)生類似于胚的結(jié)構(gòu)，其形成過程也經(jīng)歷一個(gè)類似于胚 胎發(fā)生和發(fā)育的過程。在木本植物上，體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究始于上世紀(jì)70年代后期，在 80年代后期得到了迅猛發(fā)展。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展及其在體細(xì)胞胚胎 研究中的應(yīng)用，植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)不僅成為植物快速繁殖的最重要的手段，而且已 發(fā)展成為植物胚胎發(fā)生機(jī)理、遺傳轉(zhuǎn)化的重要系統(tǒng)。目前關(guān)于楸樹體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的研究還 鮮有報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為楸樹利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗病蟲的新品種提供一個(gè)成熟的再 生體系。
[0005] 本發(fā)明是通過以下實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)現(xiàn)的：
[0006] (1)楸樹成熟種子處理
[0007] 將楸樹成熟的種子用紗布包好后用自來水沖洗30min，接著75%酒精表面滅菌 60s，無菌水沖洗2次后用0. 1 %氯化汞溶液滅菌12min，無菌水沖洗6次。接種時(shí)剪開紗布， 將種子兩端邊緣種皮略微剪破接種。
[0008] ⑵愈傷組織誘導(dǎo)
[0009] 將處理過的楸樹種子平鋪于1/2MS+0. 3-0. 5mg · L玉米素+0· 3?0· 9mg · L吲哚 乙酸的誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基放置于溫度25?28°C，無光照的培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)20d 后獲得愈傷組織。
[0010] (3)愈傷組織的繼代增殖培養(yǎng)
[0011] 將愈傷組織放置在相同的誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基上，在光強(qiáng)為15001uX，光照時(shí)間是 12h/d，溫度25?28°C培養(yǎng)室中培養(yǎng)10d。
[0012] (4)體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)
[0013] 選擇淺黃色、緊致、表面上呈顆粒狀的愈傷組織，切成0. 5X0. 5X0. Scm的小塊， 放置于MS+0. 5-3. Omg · L激動(dòng)素+0. 05mg · L吲哚乙酸的誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的培養(yǎng)基上，在光強(qiáng) 為15001ux，光照時(shí)間是12h/d，溫度25?28°C培養(yǎng)室中誘導(dǎo)楸樹體細(xì)胞胚發(fā)生。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1 :楸樹成熟種子處理后接入培養(yǎng)基。
[0015] 圖2 :楸樹成熟種子經(jīng)暗培養(yǎng)20d后誘導(dǎo)的愈傷組織。
[0016] 圖3 :繼代增殖培養(yǎng)10d后的楸樹愈傷組織。
[0017] 圖4 :愈傷組織誘導(dǎo)30d后楸樹體細(xì)胞胚發(fā)生。

【具體實(shí)施方式】：
[0018] (1)楸樹成熟種子處理
[0019] 將楸樹成熟的種子用紗布包好后用自來水沖洗30min，接著75 %酒精表面滅菌 60s，無菌水沖洗2次后用0. 1 %氯化汞溶液滅菌12min，無菌水沖洗6次。接種時(shí)剪開紗布， 將種子兩端邊緣種皮略微剪破接種。接種時(shí)剪開紗布，將種子兩端邊緣種皮略微剪破接種。 每瓶接3個(gè)種子，每處理30瓶，重復(fù)3次。
[0020] (2)愈傷組織誘導(dǎo)
[0021] 將處理過的楸樹種子平鋪于1/2MS+0. 3-0. 5mg · L玉米素+0· 3?0· 9mg · L吲哚 乙酸的誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基添加蔗糖3%，調(diào)節(jié)PH = 5. 8,培養(yǎng)基放置于溫度25? 28°C，無光照的培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)20d后獲得愈傷組織。
[0022] (3)愈傷組織的繼代增殖培養(yǎng)
[0023] 將子葉上的愈傷切下放置在相同的誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基上，在光強(qiáng)為15001UX，光照 時(shí)間是12h/d，溫度25?28°C培養(yǎng)室中培養(yǎng)10d。
[0024] (4)體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)
[0025] 選擇淺黃色、緊致、表面上呈顆粒狀的愈傷組織，切成0. 5X0. 5X0. 5cm的小塊， 放置于MS+0. 5-3. Omg · L激動(dòng)素+0. 05mg · L吲哚乙酸的誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基 添加蔗糖3%，調(diào)節(jié)PH = 5. 8,在光強(qiáng)為15001ux，光照時(shí)間是12h/d，溫度25?28°C培養(yǎng)室 中培養(yǎng)30d獲得楸樹體細(xì)胞胚。
【權(quán)利要求】
1. 一種誘導(dǎo)楸樹體細(xì)胞胚發(fā)生的方法，包括下列步驟： (1)楸樹成熟種子處理 將楸樹成熟的種子用紗布包好后用自來水沖洗30min，接著75%酒精表面滅菌60s，無 菌水沖洗2次后用0. 1 %氯化汞溶液滅菌12min，無菌水沖洗6次。接種時(shí)剪開紗布，將種 子兩端邊緣種皮略微剪破接種。（2)愈傷組織誘導(dǎo) 將處理過的楸樹種子平鋪于誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基放置于溫度25?28°C，無光 照的培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)20d后獲得愈傷組織。 (3) 愈傷組織的繼代增殖培養(yǎng) 將愈傷組織放置在相同的誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基上，在光強(qiáng)為15001UX，光照時(shí)間是12h/ d，溫度25?28°C培養(yǎng)室中培養(yǎng)10d。 (4) 體細(xì)胞胚的誘導(dǎo) 選擇活力高的愈傷組織將其切成合適的小塊后放置于誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的培養(yǎng)基上，在光 強(qiáng)為15001ux，光照時(shí)間是12h/d，溫度25?28°C培養(yǎng)室中誘導(dǎo)楸樹體細(xì)胞胚發(fā)生。
2. 如權(quán)利要求1 (2)中所述的誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基，其特征是1/2MS+0. 3-0. 5mg · L玉米 素+0. 3?0. 9mg · L吲哚乙酸。KT為激動(dòng)素。
3. 如權(quán)利要求1(4)中所述的活力高的愈傷組織，其特征是淺黃色、緊致、表面上呈顆 粒狀的愈傷組織。
4. 如權(quán)利要求1(4)中所述的誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的培養(yǎng)基，其特征是MS+0. 5-3. 0mg*L激動(dòng) 素+0· 05mg · L卩引哚乙酸。
5. 如權(quán)利要求1(4)中所述合適的小塊，其特征是愈傷大小為0. 5X0. 5X0. 5cm。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104041418SQ201410327692
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月8日
【發(fā)明者】王鵬, 楊如同, 李亞, 馬玲玲, 汪慶, 李林芳 申請(qǐng)人:江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所