一種StP5CS耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及基因StP5CS及其在耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆培育中應(yīng)用，提供利用該基因培育耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆方法、培育過(guò)程中使用的StP5CS過(guò)表達(dá)載體和工程菌、轉(zhuǎn)基因大豆StP5CS基因熒光定量方法和檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明提供的StP5CS耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆方法為：1)在植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StP5CS構(gòu)建基礎(chǔ)上，獲得StP5CS耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體；2)篩選純合體轉(zhuǎn)基因大豆。本發(fā)明解決現(xiàn)有技術(shù)中StP5CS在耐鹽轉(zhuǎn)基因育種中空白，該基因在轉(zhuǎn)基因植株中超量表達(dá)，提高目標(biāo)作物耐鹽性。本發(fā)明的載體還含有廣譜除草劑抗性基因，既方便檢測(cè)又賦予轉(zhuǎn)基因大豆抗除草劑特性，便于生產(chǎn)應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】-種StP5CS耐鹽轉(zhuǎn)基因大s_的培育方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及野生茄子Λ L吡咯啉-5-羧酸合成 酶基因 StP5CS及該基因在耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆培育中的應(yīng)用，提供利用該基因培育耐鹽轉(zhuǎn)基 因大豆的方法、在培育過(guò)程中使用的StP5CS過(guò)表達(dá)載體和工程菌、以及轉(zhuǎn)基因大豆StP5CS 基因熒光定量方法和檢測(cè)試劑盒。 技術(shù)背景
[0002] 大豆是我國(guó)重要的糧食作物和油料作物。然而，由于受國(guó)外進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆的影 響，我國(guó)大豆生產(chǎn)面積和產(chǎn)量逐年下降，截止2012年大豆總產(chǎn)量為1449萬(wàn)噸，僅占世界大 豆總產(chǎn)量的 5 % (國(guó)家統(tǒng)計(jì)局：http://data, stats, gov. cn/ 和 SoyStats :http://www. soystats. com)。目前，我國(guó)已經(jīng)成為是世界上主要的大豆消費(fèi)國(guó)和進(jìn)口國(guó)，每年消費(fèi)的大 豆約有80%依賴于國(guó)外進(jìn)口，其中2012年進(jìn)口大豆5838萬(wàn)噸，占世界大豆總產(chǎn)量的20% (國(guó)家統(tǒng)計(jì)局：http://data, stats, gov. cn/)。隨著經(jīng)濟(jì)的持續(xù)發(fā)展和人口數(shù)量的增加，我 國(guó)對(duì)大豆的需求量將日益增大，擴(kuò)大大豆種植面積，提高大豆產(chǎn)量已是當(dāng)務(wù)之急。東北地區(qū) 是大豆的主產(chǎn)區(qū)，同時(shí)也是土地鹽堿化最嚴(yán)重的地區(qū)之一，鹽堿土面積384萬(wàn)hm 2,約占全區(qū) 總面積的3.1% (姚榮江，楊勁松，劉廣明.東北地區(qū)鹽堿土特征及其農(nóng)業(yè)生物治理.土 壤，2006, 38:256-262.)。大豆屬鹽敏感作物，在鹽脅迫條件下栽培大豆的株高、莖節(jié)數(shù)、分 枝數(shù)、百粒重、單株莢數(shù)、粒數(shù)和粒重等顯著下降，品質(zhì)降低，東北地區(qū)的土壤鹽堿化嚴(yán)重限 制了大豆的生產(chǎn)（Phang T H，Shao G H, Lam Η M. Salt tolerance in soybean. Journal of Integrative Plant Biology, 2008, 50 (10): 1196-1212·)。因此，培育大豆耐鹽新品種對(duì) 減少鹽害對(duì)大豆生產(chǎn)的影響，擴(kuò)大大豆種植面積具有重要意義。
[0003] 隨著對(duì)大豆耐鹽機(jī)制的研究不斷深入和對(duì)耐鹽相關(guān)基因的挖掘，借助轉(zhuǎn)基因手 段培育耐鹽新種質(zhì)將是一種有效的途徑。目前，抗除草劑、抗蟲(chóng)、低反式脂肪酸和高油酸 轉(zhuǎn)基因大豆已經(jīng)在國(guó)外大面積種植，并取得較好的經(jīng)濟(jì)效益，然而關(guān)于耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆 的培育及商業(yè)化種植報(bào)道較少。有研究表明在大豆中過(guò)量表達(dá)擬南芥AtMYB44轉(zhuǎn)錄因 子能顯著提高200mM NaCl脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性，并且在田間試驗(yàn)中轉(zhuǎn)基因大 豆產(chǎn)量顯著高于對(duì)照（Seo J S，Sohn H B，Noh K, Jung C, An J H, Donovan C M, Somers D A, Kim D I,Jeong S C, Kim C G.Expression of the Arabidopsis AtMYB44gene confers drought/salt-stress tolerance in transgenic soybean.Molecular Breeding, 2012, 29:601-608.)。此外，在大豆中過(guò)量表達(dá)一個(gè)來(lái)源于水稻的0sDREB2A轉(zhuǎn)錄 因子，可以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因大豆中可溶性糖和脯氨酸的積累，以及誘導(dǎo)脅迫響應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 和基因的表達(dá)，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因大豆的耐鹽性（Zhang X X，Tang Y J，Ma Q B, Yang C Y, Mu Y H, Suo H C, Luo L H, Nian H. 0sDREB2A, a rice transcription factor, significantly affects salt tolerance in transgenic soybean. PloS One, 2013, 8:e83011. )〇 以 上報(bào)道說(shuō)明，通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段在大豆植株中過(guò)表達(dá)耐鹽相關(guān)基因培育耐鹽新種質(zhì)具有 可行性。目前，除了已經(jīng)報(bào)道的耐鹽相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子之外，已經(jīng)證實(shí)在轉(zhuǎn)基因植物中超量 表達(dá)小分子量化合物（如脯氨酸、甜菜堿、甘露醇、糖類、多胺類等）合成途徑的相關(guān)基 因，促進(jìn)這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在植物體內(nèi)的累積，能夠提高轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性（Ashraf M，Akram N A. Improving salinity tolerance of plants through conventional breeding and genetic engineering:an analytical comparison. Biotechnology Advances，2009, 27(6) :744-752.)。
[0004] 脯氨酸是一種小分子的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，是水溶性最大的氨基酸。植物體內(nèi)通 常大量積累脯氨酸以提高自身的抗?jié)B透脅迫能力（Szabados L，Savour6A.Proline:a multifunctional amino acid. Trends in Plant Science, 2010, 15(2):89-97. )〇 鹽 脅迫條件下，植物主要通過(guò)谷氨酸途徑合成脯氨酸（Kiran Kumar Ghanti S，Sujata K G, Vijay Kumar B M，Nataraja Karba N，Janardhan Reddy K，Srinath Rao M, Kavi Kishor P B. Heterologous expression of P5CS gene in chickpea enhances salt tolerance without affecting yield. Biologia Plantarum，2011，55 (4):634-640.)〇 Λ L吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 P5CS是谷氨酸途徑的關(guān)鍵基因，編碼脯氨酸生物合 成的關(guān)鍵酶，在植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮重要作用（Rai A N，Penna S.Molecular evolution of plant P5CS gene involved in proline biosynthesis. Molecular Biology R印orts，2013, 40:6429-6435.)。通過(guò)基因工程手段在植物體內(nèi)過(guò)量表達(dá)P5CS，可促進(jìn)脯 氨酸的積累，提高植物的耐鹽性。目前，已經(jīng)報(bào)道了多種耐鹽性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)P5CS基因植物， 如煙草、水稻、小麥、馬鈴薯、鷹嘴豆和鴻豆等（Ashraf M, Akram N A. Improving salinity tolerance of plants through conventional breeding and genetic engineering:an analytical comparison. Biotechnology Advances, 2009, 27 (6): 744-752·)。但未見(jiàn)有將 P5CS基因轉(zhuǎn)入大豆培育P5CS耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆的報(bào)道。
[0005] 野生爺子（Solanum torvum Swartz)是爺子的近緣野生種，耐鹽性強(qiáng)，在設(shè)施栽培 中常用作嫁接砧木以緩解設(shè)施土壤中次生鹽漬化的危害（Wei G P，Yang L F，Zhu Y L，Chen G. Changes in oxidative damage, antioxidant enzyme activities and polyamine contents in leaves of grafted and non-grafted eggplant seedlings under stress by excess of calcium nitrate. Scientia Horticulturae, 2009, 120:443-451.) 〇 目前關(guān) 于野生茄子中耐鹽基因的發(fā)掘報(bào)道較少，利用基因工程手段將野生茄子耐鹽基因特別是脯 氨酸合成積累相關(guān)基因?qū)胱魑镏信嘤望}新種質(zhì)尚未見(jiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中StP5CS基因在耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆育種中的空白，培 育大豆耐鹽新種質(zhì)，提高大豆的耐鹽性，從而降低鹽害對(duì)大豆生產(chǎn)中的影響，促進(jìn)大豆生 產(chǎn)。
[0007] 本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)手段獲得
[0008] 本發(fā)明提供一種野生茄子Λ L吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 StP5CS，該基因序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0009] 一種重組載體，該重組載體包含Λ L吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 StP5CS。
[0010] 重組載體可以將上述基因 StP5CS插入到克隆載體或表達(dá)載體而得到。本發(fā)明采 用的基礎(chǔ)載體包括PMD19-T載體和pCAMBIA3301載體，但本發(fā)明所述的重組載體并不限于 以上述2種載體為基礎(chǔ)與基因 StP5CS重組后獲得的載體，任何可以與基因 StP5CS進(jìn)行重 組并可在宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的重組載體均應(yīng)為本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0011] 本發(fā)明上述的重組載體，為植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StP5CS，含有StP5CS基因 和抗除草劑bar基因，將StP5CS基因的5'端和3'端分別引入CaMV35S啟動(dòng)子和nos終止 子，并克隆到基礎(chǔ)載體PCAMBIA3301的T-DNA區(qū)得到的。
[0012] 包含上述重組載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
[0013] 上述重組載體為包含基因 StP5CS的載體或質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化細(xì)胞是宿主細(xì)胞經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn) 化或侵染后得到的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以為原核生物細(xì)胞--其可用于繁殖載體和真核細(xì) 胞--其可用于表達(dá)核酸。
[0014] 一種StP5CS耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法，該方法將野生茄子StP5CS基因構(gòu)建至 PCAMBIA3301表達(dá)載體中，通過(guò)該表達(dá)載體將外源StP5CS基因?qū)氪蠖够蚪M中獲得耐鹽 轉(zhuǎn)基因大豆。
[0015] 本發(fā)明實(shí)施例中，將該表達(dá)載體所攜帶的外源基因 StP5CS基因?qū)氪蠖够蚪M 中是通過(guò)根癌農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法完成的，但是，本實(shí)驗(yàn)提供的方法不僅限 于此，任何一種轉(zhuǎn)化方法能將本發(fā)明提供的外源基因 StP5CS導(dǎo)入大豆基因組中都適用。
[0016] 上述的StP5CS耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法，包括如下步驟：
[0017] 1) StP5CS耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體的獲得
[0018] 將上述的植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StP5CS導(dǎo)入大豆基因組，通過(guò)除草劑篩選 獲得L代轉(zhuǎn)基因大豆植株；
[0019] 2)純合體轉(zhuǎn)基因大豆的篩選
[0020] 利用⑶S組織化學(xué)分析法和PCR鑒定法檢測(cè)?\代轉(zhuǎn)基因大豆，獲得陽(yáng)性植株，進(jìn) 行自交獲得τ 2代種子。選取Τ2代種子萌發(fā)后的第一片完全展開(kāi)葉，利用GUS組織化學(xué)分析 法和PCR鑒定法，選擇均為陽(yáng)性的株系，即為純合體轉(zhuǎn)基因株系。
[0021] 本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中，將植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StP5CS導(dǎo)入大豆基因組是 通過(guò)農(nóng)桿菌侵染大豆子葉外植體完成的。
[0022] 上述基因或重組載體在耐鹽轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，優(yōu)選地，為耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆中 的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明所述野生茄子Λ L吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 StP5CS，取自野生茄子 (Solanum torvum Swartz cv. 'Torvum Vigor'）葉片中，是爺子的近緣野生種，屬爺科。因 此，可以預(yù)見(jiàn)，該基因可應(yīng)用于茄科任一種物種，而本發(fā)明優(yōu)選地在轉(zhuǎn)基因大豆中的應(yīng)用， 只是本發(fā)明實(shí)施例中的一個(gè)方案，證明該基因可應(yīng)用于非茄科物種中。
[0024] 上述轉(zhuǎn)化細(xì)胞在耐鹽轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，優(yōu)選地，為耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆中的應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明提供一種耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆StP5CS基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定方法，該方法通 過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)熒光定量PCR測(cè)定StP5CS基因在耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆中的表達(dá)量；
[0026] 其中，特異性引物：
[0027] 上游引物PF4 :如SEQ ID No. 13所示，
[0028] 下游引物PR4 :如SEQ ID No. 14所示。
[0029] 本發(fā)明還提供一種耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆StP5CS基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定的試劑盒，該試 劑盒包括如下序列：
[0030] StP5CS基因檢測(cè)引物，上游引物PF4 :如SEQ ID No. 13所示，下游引物PR4 :如SEQ ID No. 14 所示；
[0031] 大豆內(nèi)參基因 ELFlb的檢測(cè)引物，上游引物ELFlbF :如SEQ ID No. 15所示；下游 引物 ELFlbR :如 SEQ ID No. 16 所示。
[0032] 本發(fā)明有益效果：
[0033] 1.本發(fā)明提供了一個(gè)新的野生茄子Λ L吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 StP5CS基因， 該基因編碼脯氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶；在植物中過(guò)量表達(dá)該基因可以促進(jìn)目標(biāo)植物體內(nèi)脯 氨酸的大量積累，提高目標(biāo)植物的耐鹽性。
[0034] 2.本發(fā)明構(gòu)建的StP5CS基因重組植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StP5CS，將StP5CS 基因5'端和3'端分別引入CaMV35S啟動(dòng)子和nos終止子，提高了 StP5CS基因的表達(dá)水 平；該載體可以應(yīng)用于多種耐鹽轉(zhuǎn)基因植株的培育，尤其是耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆的培育，填補(bǔ)了 現(xiàn)有技術(shù)中的空白。
[0035] 3.采用本發(fā)明提供的耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法生產(chǎn)出的含有StP5CS基因的轉(zhuǎn) 基因大豆，具有耐鹽的特性，可在鹽漬化環(huán)境下種植，通過(guò)試驗(yàn)鑒定，通過(guò)本發(fā)明提供的培 育方法生產(chǎn)出的耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆，盆栽條件下可以耐受1. 17%氯化鈉（200mM NaCl)脅迫， 水培條件下可以耐受0.59%氯化鈉（100mM NaCl)脅迫，在脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)狀 況良好，結(jié)莢數(shù)也顯著高于野生型對(duì)照植株。
[0036] 4.本發(fā)明構(gòu)建的StP5CS基因重組植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StP5CS，除了含有 耐鹽StP5CS基因之外，還含有除草劑抗性基因 bar基因，賦予了轉(zhuǎn)基因植株耐鹽和抗除草 劑雙重特性，更有利于在生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0037] 5.本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)特異的檢測(cè)引物，使用熒光定量PCR技術(shù)，定量測(cè)定StP5CS基 因在轉(zhuǎn)基因大豆中的相對(duì)表達(dá)量，從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)StP5CS基因在轉(zhuǎn)基因大豆中的表達(dá)情況， 為轉(zhuǎn)基因大豆的育種和檢測(cè)提供方便。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StP5CS構(gòu)建流程圖
[0039] 圖2StP5CS的克隆及植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StP5CS的酶切鑒定
[0040] A圖：StP5CS瓊脂糖凝膠電泳分析
[0041] M :DNA Marker 電泳條帶，由上至下大小分別為 2Kb、lKb、0. 75Kb、0. 5Kb、0. 25Kb 和 0. 1Kb ；
[0042] 1 :StP5CS 電泳條帶；
[0043] B圖：中間載體pCAMBIA3301-T800雙酶切檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳分析
[0044] M :DNA Marker 電泳條帶，由上至下大小分別為 2Kb、lKb、0. 75Kb、0. 5Kb、0. 25Kb 和 0. 1Kb ；
[0045] 1 :HindIII/EcoRI 雙酶切 pCAMBIA3301-T800 產(chǎn)物電泳條帶；
[0046] 2 :pCAMBIA3301-T800 質(zhì)粒電泳條帶；
[0047] C圖：植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StP5CS雙酶切檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳分析
[0048] M:DNA Marker 由上至下大小分別為 15Kb、10Kb、7. 5Kb、5Kb、2. 5Kb、lKb 和 0.25Kb ；
[0049] 1，2 :BamHI/SalI 雙酶切 pCAMBIA3301-StP5CS 產(chǎn)物電泳條帶；
[0050] 3 :pCAMBIA3301-StP5CS 質(zhì)粒電泳條帶；
[0051] 圖3轉(zhuǎn)基因大豆的獲得流程圖
[0052] A圖：大豆種子萌發(fā)后的無(wú)菌苗；B圖：外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)；C圖：不定芽的誘 導(dǎo)；D圖：不定芽的伸長(zhǎng)；E圖：伸長(zhǎng)的不定芽；F圖：半葉法GUS組織化學(xué)分析；G圖：生根培 養(yǎng)；Η圖：移栽于溫室的轉(zhuǎn)基因苗；I圖：轉(zhuǎn)基因大豆植株抗除草劑Basta鑒定；J圖：非轉(zhuǎn)基 因大豆植株抗除草劑Basta鑒定；
[0053] 圖4轉(zhuǎn)基因大豆不同組織器官⑶S組織化學(xué)分析
[0054] 所有小圖中左側(cè)為轉(zhuǎn)基因植株組織器官，右側(cè)為野生型對(duì)照植株組織器官；A圖： TQ葉片；B圖：TQ莖段；C圖和D圖：TQ花（花藥和柱頭）；E圖：T Q豆莢；F圖：萌發(fā)72h的?\ 種子；G圖：萌發(fā)24h的Τ2種子；Η圖：Τ2幼苗的側(cè)根；堅(jiān)線為標(biāo)尺，標(biāo)尺=0. 5cm
[0055] 圖5轉(zhuǎn)基因大豆L代植株P(guān)CR和Southern鑒定
[0056] A圖：轉(zhuǎn)基因大豆?；代植株P(guān)CR鑒定；B圖：轉(zhuǎn)基因大豆?；代植株Southern鑒定； P :pCAMBIA3301-StP5CS質(zhì)粒；WT :未轉(zhuǎn)化植株，Z1和Z2 :TQ轉(zhuǎn)基因植株；
[0057] 圖6轉(zhuǎn)基因大豆純合體株系的耐鹽性鑒定
[0058] A圖：T2代純合體轉(zhuǎn)基因植株在盆栽試驗(yàn)200mM NaCl脅迫條件下的生長(zhǎng)表現(xiàn)；
[0059] B圖：T3代純合體轉(zhuǎn)基因植株在水培試驗(yàn)lOOmM NaCl脅迫條件下的生長(zhǎng)表現(xiàn)；
[0060] 圖7T3代純合體轉(zhuǎn)基因植株中外源StP5CS基因的熒光定量表達(dá)分析
[0061] WT:野生型植株陰性對(duì)照；Z1-3和Z2-7 :分別為1~3代轉(zhuǎn)基因大豆株系Z1-3和 Z2-7 ;相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)為8次重復(fù)（8株植株）的平均值；數(shù)據(jù)采用Student's t測(cè)驗(yàn)進(jìn)行 顯著性差異分析，*表示處理間的差異達(dá)5%顯著水平，**表示處理間的差異達(dá)1%顯著水 平。

【具體實(shí)施方式】
[0062] 下述實(shí)施例中所用方法若無(wú)特殊說(shuō)明均為本領(lǐng)域慣用的技術(shù)手段，所用的試劑、 材料，如無(wú)特殊說(shuō)明均可通過(guò)商業(yè)途徑得到。
[0063] 一、StP5CS基因的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建
[0064] 本發(fā)明從野生爺子（Solanum torvum Swartz cv. 'Torvum Vigor'）葉片中克隆 了一個(gè)新的Λ L吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 StP5CS，以pCAMBIA3301載體為基礎(chǔ)載體構(gòu)建 含有該基因的過(guò)表達(dá)載體，構(gòu)建流程如圖1所示，【具體實(shí)施方式】如下：
[0065] 1.野生茄子Λ L吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 StP5CS的克?。?br> [0066] 以3周齡野生茄子幼苗葉片為材料，采用TaKaRa公司總RNA提取試劑（目錄號(hào)： D9108A)提取總RNA。然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。參照番茄P5CS基因序列信息（NCBI登 錄號(hào)：U60267)，設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增如SEQ ID NO. 1所示基因片段；
[0067] 其中，特異性引物為：
[0068] 正向引物PF1 :如SEQ ID N0. 2所示
[0069] 反向引物PR1 :如SEQ ID NO. 3所示
[0070] 以上述獲得的野生茄子cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，50yL反應(yīng)體系包含： 10 X PCRBuffer5. 0 μ L，dNTP mix4. 0 μ L (2. 5mmol · Γ1)，MgCl23 μ L (25mmol · Γ1)，PF1、PR1 引物各 1· Ομ L(20ymol .171)，Taq DNA PolymeraseO. 2μ L，cDNA 模板 1 μ L，ddH2034. 8μ L ; 反應(yīng)程序：95°C預(yù)變性4min，然后30個(gè)循環(huán)反應(yīng)包括94°C解鏈30sec，52. 7°C退火30sec， 72°C延伸2min30sec，最后72°C延伸lOmin ;PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果 如圖2A所示。檢測(cè)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒（AXYGEN，目錄號(hào)：AP-GX-50)回 收純化，用T 4DNA連接酶（TaKaRa，目錄號(hào)：D2011A)連接到pMD19-T載體（TaKaRa，目錄號(hào)： D102A)，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行序列測(cè)定；
[0071] 2.中間載體 pCAMBIA3301-T800 的改造
[0072] 全序列合成含有CaMV35S啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、nos終止子的T800序列片段，其序 列如SEQ ID N0. 4所示，通過(guò)合成在T800序列片段兩端分別引入EcoRI和Hindlll酶切位 點(diǎn)；使用EcoRI(Promega，目錄號(hào)：R6011)和HindIII(Promega，目錄號(hào)：R6041)雙酶切基礎(chǔ) 載體PCAMBIA3301 (CAMBIA，Australia)和T800片段，得到酶切產(chǎn)物，將酶切產(chǎn)物按1:4的 比例用T4DNA連接酶（TaKaRa，目錄號(hào)：D2011A)連接，產(chǎn)物按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài) 細(xì)胞，提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證，具體過(guò)程如下所述：
[0073] 1)取pCAMBIA3301質(zhì)粒和T800片段各15 μ L，分別用EcoRI和Hindlll雙酶切， 其中，50μ L 雙酶切體系：10XBuffer Ε5μ L，BSA0. 5μ L，DNA15y L，EcoR II. 25μ L，Hind III1. 25 μ L，ddH2027 μ L ;37°C酶切反應(yīng)3h，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，回收質(zhì)粒 PCAMBIA3301 大片段（11256bp)和 T800 小片段（849bp);
[0074] 2)將上述酶切后的回收片段，按照大片段與小片段1:4的比例用T4DNA連接酶連 接，連接反應(yīng)體系（25yL) :10XT4ligase Buffer2.5yL，pCAMBIA3301 大片段 2yL，T800 小片段8以1^，1'40嫩連接酶1以1^，(1(1!12011.5以1^161：反應(yīng)過(guò)夜，獲得連接產(chǎn)物 ；取1(^1^連 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)；挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后， 提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗(yàn)證，如圖2B所示；含有CaMV35S啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、nos終止子的 PCAMBIA3301-T800中間載體改造完成；
[0075] 3.植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StP5CS的構(gòu)建
[0076] 設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，在目的基因StP5CS的5'端和3'端分別引入酶切位點(diǎn) BamHI 和 Sail，米用 BamHI(Promega，目錄號(hào)：R6021)和 SalI(Promega，目錄號(hào)：R6051)雙 酶切PCAMBIA3301-T800中間載體和StP5CS基因PCR產(chǎn)物，回收pCAMBIA3301-T800大片段 (12097bp)和StP5CS (2250bp)片段，按1:4的比例用T4DNA連接酶連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感 受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，【具體實(shí)施方式】如下：
[0077] 其中，引物為：
[0078] 正向引物PF2:如SEQ ID N0. 5所示；
[0079] 反向引物PR2:如SEQ ID Ν0· 6所示。
[0080] 1)以野生茄子葉片cDNA作為模板，用高保真酶（PrimeSTAR? HS DNA Polymerase，TaKaRa 目錄號(hào)：DR010A)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，50yL 反應(yīng)體系：10XPCR Buffer5. 0 μ L，dNTP mix4. 0 μ L(2. 5mmol · Γ1)，引物 PF2 和 PR2 各 1· 0 μ L(20 μ mol · Γ1)， PrimeSTAR? HS DNA PolymeraseO. 4 μ L，cDNA 模板 1 μ L，ddH2037. 6 μ L ;反應(yīng)程序：95°C預(yù) 變性4min，然后30個(gè)循環(huán)反應(yīng)包括98°C解鏈10sec，68°C延伸2min30sec，最后72°C延伸 lOmin。PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收，進(jìn)行序列測(cè)定；
[0081] 2)分別取改造好的pCAMBIA3301-T800中間載體和含有酶切位點(diǎn)的StP5CS PCR產(chǎn) 物各15μL，用BamHI和SalI雙酶切，雙酶切體系（50μL):10XBufferE5μL，BSA(λ5μL， DNA15y L，BamHIl. 25μ L，Salll. 25μ L，（ΜΗ2027 μ L ;37°C酶切反應(yīng) 3h ;酶切結(jié)束后進(jìn)行 瓊脂糖凝膠電泳分離，回收質(zhì)粒PCAMBIA3301-T800大片段（12097bp)和StP5CS小片段 (2250bp)；
[0082] 3)上述回收的大片段和小片段，按照1:4的比例，用T4DNA連接酶連接，連接反應(yīng) 體系（25μ L) :10XT4ligase Buffer2. 5μ L，PCAMBIA3301-T800 大片段 2μ L，StP5CS 小片 段8 μ L，T4DNA連接酶1 μ L，ddH2011. 5 μ L ; 16°C反應(yīng)過(guò)夜，取10 μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感 受態(tài)細(xì)胞。37°C過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗(yàn)證（圖2C)，植物表 達(dá)載體pCAMBIA3301-StP5CS的構(gòu)建成功。
[0083] 二、植物表達(dá)載體采用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105
[0084] 實(shí)驗(yàn)用農(nóng)桿菌 EHA105 在文獻(xiàn)（Hood E E, Gelvin S B, Melchers L S, Hoekema A. New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Transgenic Research, 1993,2:208-218.)中公開(kāi)過(guò)，購(gòu)自北京天恩澤生物技術(shù)有限公司。凍融法轉(zhuǎn) 化農(nóng)桿菌的具體方法在文獻(xiàn)（Jyothishwaran G，Kotresha D，Selvaraj T，Srideshikan S,Rajvanshi P,Jayabaskaran C. A modified freeze-thaw method for efficient transformation of Agrobacterium tumefaciens. Current Science, 2007, 93:770-772.) 中公開(kāi)過(guò)。
[0085] 1.根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)的制備
[0086] 取_70°C保存的EHA105甘油菌于YEB固體培養(yǎng)基劃線活化；挑取單菌落，接到5mL YEB液體培養(yǎng)基，28°C，250rpm培養(yǎng)過(guò)夜進(jìn)行活化；取2. 5mL活化的菌液，加入到50mL YEB 液體培養(yǎng)基中，28°C，250rpm擴(kuò)大培養(yǎng)至0D_值約0. 5-0. 6左右；將菌液轉(zhuǎn)至50mL無(wú)菌離 心管中，冰浴3〇111；[11，41€，6000印1]1離心5111；[11 ;棄上清，沉淀用101]11^預(yù)冷的0.151似(]1懸浮 后4°C，6000rpm，離心5min，棄上清液；將沉淀再次用2mL CaCl2 (20mM)懸浮后，每份200 μ L 分裝到1. 5mL離心管中，液氮迅速冷凍lmin，保存于-70°C冰箱備用。
[0087] 2.植物表達(dá)載體凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌
[0088] 取_70°C保存的EHA105感受態(tài)細(xì)胞，置冰上融化；取2 μ g純化的植物表達(dá)載體 pCAMBIA3301-T800-StP5CS質(zhì)粒，加入到200 μ L已解凍的菌液中，輕輕混合，冰浴30min。然 后轉(zhuǎn)移至液氮中冷凍3min，迅速轉(zhuǎn)至37°C水浴中溫浴5min ;向菌液中加入800 μ L新鮮YEB 液體培養(yǎng)基（蛋白胨5g · ΙΛ酵母提取物lg · ΙΛ牛肉膏5g · L'MgSC^ · 7H200. 5g · ΙΛ蔗 糖5g · Γ1，pH值至7· 0)，28°C，lOOrprn，振蕩培養(yǎng)2-4h，使菌體復(fù)蘇。將菌液5000rpm離心 5min，棄去大部分上清液，剩余菌液吸打混勻；涂布于含有50mg · Γ1卡那霉素的YEB固體 培養(yǎng)基；28°C培養(yǎng)直至出現(xiàn)單克隆；挑取單克隆，接種到5mL YEB液體培養(yǎng)基（含50mg噸4 卡那霉素），28°C，250rpm培養(yǎng)過(guò)夜，PCR檢測(cè)陽(yáng)性菌液制備甘油菌，-70°C保存。
[0089] 三、農(nóng)桿菌介導(dǎo)StP5CS基因轉(zhuǎn)化大豆
[0090] 大豆品種 'ΝΥ-100Γ 及轉(zhuǎn)化方法在文獻(xiàn)（Liu S C，Zhang G C，Yang L F，Mii M，Gai J Y，Zhu Y L Bialaphos-resistant transgenic soybeans produced by the Agrobacterium-mediated cotyledonary-node method.Journal of Agricultural Science and Technology，2014, 16:175-190.)中公開(kāi)過(guò)。
[0091] 1.外植體的制備及農(nóng)桿菌侵染
[0092] 取成熟飽滿的'ΝΥ100Γ大豆種子，在密閉容器中氯氣表面消毒16h(氯氣由 3. 5mL12N的HC1和100mL5. 25%的次氯酸鈉混合制得）。消毒結(jié)束后轉(zhuǎn)移至萌發(fā)培養(yǎng)基 (B5基本培養(yǎng)基+3% (w/v)蔗糖+0.8% (w/v)瓊脂，pH5.8)，25°C條件下，光照（16/8h， 90 μ mol · m_2 · S_〇培養(yǎng)5天，獲得無(wú)菌苗（圖3A)，切取子葉節(jié)作為外植體。
[0093] 將含有pCAMBIA3301-T800-StP5CS載體的農(nóng)桿菌ΕΗΑ105劃線于ΥΕΒ平板，28°C培 養(yǎng)24h，挑取單克隆液體培養(yǎng)24h，然后取2mL復(fù)蘇的菌液加入200mL YEP液體培養(yǎng)基中，擴(kuò) 大培養(yǎng)至〇D65(l為0. 8,菌液離心后，用液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基（1/10B5,1. 67mg · L、-芐基氨基 噪呤，0.2511^^171 赤霉素，200 μ mol· L-1 乙酰丁香酮，3% (w/v)鹿糖和 0.7% (w/v)瓊脂， PH5. 4)重懸，調(diào)節(jié)0D65(I值為1。每25個(gè)外植體加入到50mL重懸菌液中，侵染30min，期間 每隔lOmin搖動(dòng)一次。侵染結(jié)束后，吸干多余菌液，將外植體近軸面向下放置于鋪有一層濾 紙的共培養(yǎng)基上（添加3. 3mmol · L^L-半胱氨酸，lmmol · I71硫代硫酸鈉和lmmol · I71二 硫蘇糖醇），22°C遮光共培養(yǎng)4天（圖3B)。
[0094] 2.轉(zhuǎn)基因大豆的再生與篩選
[0095] 1)不定芽的誘導(dǎo)
[0096] 共培養(yǎng)結(jié)束后的外植體，用液體芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（B5,1. 67mg · L、-芐基氨基嘌呤， 500mg .171羧節(jié)青霉素，3% (w/v)鹿糖，3mmol .1^2-嗎啉乙磺酸，pH5. 6)搖動(dòng)洗漆4-5次， 近軸面向上置于固體芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（液體芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加0.8% (w/v)瓊脂）。25°C光 照（16/8h，90ymol m^V1)培養(yǎng)10天。10天后，外植體轉(zhuǎn)移至含有4mg·]^雙丙氨膦的芽 誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基（圖3C)，篩選培養(yǎng)4周，每2周繼代一次。
[0097] 2)芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)
[0098] 將篩選后含有叢生芽的外植體，轉(zhuǎn)移到芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基（MS, lmg · I71玉米素， 0. 5mg · I71赤霉素,0. lmg · I71卩引哚乙酸，100mg · L-1焦谷氨酸，50mg · I^L-天冬酰胺， 30011^171羧芐青霉素，雙丙氨膦，3 % (w/v)蔗糖，3mmol .1^2-嗎啉乙磺酸和 0· 8% (w/v)的瓊脂，ρΗ5· 6)，芽伸長(zhǎng)6-8周（圖3D和3E)，每隔2周繼代1次。
[0099] 3)半葉法轉(zhuǎn)化體的篩選
[0100] 為盡早確定轉(zhuǎn)化體，當(dāng)有不定芽伸長(zhǎng)時(shí)，采用半葉法進(jìn)行GUS組織化學(xué)鑒定，先對(duì) 伸長(zhǎng)的芽逐一編號(hào)，用無(wú)菌手術(shù)剪從每個(gè)芽上剪半張葉片進(jìn)行GUS組織化學(xué)分析（圖3F)。 GUS陽(yáng)性的芽轉(zhuǎn)移到新的芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)。
[0101] 4)生根
[0102] 當(dāng)⑶S陽(yáng)性的芽伸長(zhǎng)至3-4cm時(shí)，用手術(shù)刀從基部切下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（1/2Β5， 0. Smg·!/1!!引哚丁酸，3% (w/v)鹿糖，0. 8% (w/v)瓊脂，pH5. 6)誘導(dǎo)生根。待有3-4條 健壯根長(zhǎng)出后（圖3G)，打開(kāi)培養(yǎng)瓶瓶蓋馴化2-3d，然后用鑷子小心將幼苗取出，洗凈根 部的培養(yǎng)基，移栽含有蛭石：草炭=1 :1的塑料盆中，開(kāi)始3-4天用保鮮膜覆蓋保濕，25°C 在光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)1周。1周后，逐漸將保鮮膜打開(kāi)馴化，并移入溫室中，在自然光下 生長(zhǎng)，每隔2天澆一次1/4濃度的園試配方營(yíng)養(yǎng)液，直至成熟收獲（圖3H)。所使用園 試配方營(yíng)養(yǎng)液大量元素及含量分別為（mmol · Γ1) :Ca(N03)2 · 4H20(4.00)、KN03(8 . 00)、 ΝΗ4Η2Ρ04(1· 33)和MgS04 ·7Η20(2· 00);微量元素及其含量分別為（μ mol 七1) :H3B03(B140)、 CuS04 ·5Η20(αι100)、MnCl2 ·4Η20(Μη36)、ZnS04 ·7Η20(Ζη46)、Fe-EDTA(Fe30)和％]?〇02(]\1〇1)。
[0103] 3.轉(zhuǎn)基因大豆植株的鑒定
[0104] 1)1；轉(zhuǎn)基因大豆Basta抗性鑒定
[0105] 用棉棒蘸取0. 05% Basta均勻涂抹于健康的轉(zhuǎn)基因大豆和未轉(zhuǎn)化大豆半張葉片 表面，10天后觀察葉片的癥狀，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株具有抗Basta除草劑特性（圖31)，而 非轉(zhuǎn)基因植株葉片黃化（圖3J)。
[0106] 2)轉(zhuǎn)基因大豆⑶S組織化學(xué)分析
[0107] 取?；代轉(zhuǎn)基因大豆和未轉(zhuǎn)化大豆的葉片、莖段、花、豆莢，以及?\代種子分別置于 ⑶S 反應(yīng)液[50mmol · I71 憐酸鈉緩沖液（ρΗ7· 0)，1 % (v/v) Triton X100, 20% (v/v)甲醇， 50mmol · I71六氰合亞鐵酸鉀，50mmol · I71六氰合鐵酸鉀，lmmol · Ll-Gluc (Goldbio,貨號(hào)： G1281C)]中，37°C反應(yīng)12h。70%乙醇去除葉綠素后，拍照觀察。結(jié)果如圖4所示，gus基 因在I代轉(zhuǎn)基因植株各器官中均有表達(dá)，并且在I\、T 2代種子以及T2代幼苗側(cè)根中穩(wěn)定地 表達(dá)，說(shuō)明外源基因已經(jīng)成功遺傳到后代中。
[0108] 3)TQ代轉(zhuǎn)基因大豆植株P(guān)CR鑒定
[0109] 取轉(zhuǎn)基因大豆幼嫩葉片，以常規(guī)SDS法提取基因組DNA，然后以獲得的基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR，分別檢測(cè)gus、bar和StP5CS基因。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株中含有清晰地gus 基因、bar基因和StP5CS基因目的條帶，而未轉(zhuǎn)化植株中沒(méi)有擴(kuò)增到相應(yīng)的條帶，說(shuō)明外源 基因已經(jīng)成功整合到大豆基因組中（圖5A)。
[0110] 反應(yīng)體系包含：10XPCR Buffer2. 0μ L，dNTP mixl. 6μ L(2. 5mmol · Γ1)， MgCl2l. 2 μ L(25mmol · I/1)，檢測(cè)弓 | 物各 1. 0 μ L (20 μ mol · I/1)，Taq DNA Polymerase?！?2 μ L，cDNA 模板 1 μ L，ddH2012 μ L ;
[0111] gus基因 PCR擴(kuò)增引物：
[0112] 正向引物gusF :如SEQ ID Ν0· 7所示
[0113] 反向引物gusR :如SEQ ID Ν0· 8所示
[0114] 反應(yīng)程序：94°C 5min，（95°C 45sec，55°C 45sec，72°C lmin) X30 循環(huán)，72°C lOmin ;
[0115] bar基因 PCR擴(kuò)增引物為：
[0116] 正向引物barF :如SEQ ID NO. 9所示
[0117] 反向引物barR :如SEQ ID Ν0· 10所示
[0118] 反應(yīng)程序：94°C 5min，（95°C lmin，55°C lmin，72°C lmin) X30 循環(huán)，72°C lOmin ;
[0119] StP5CS基因 PCR擴(kuò)增引物為：
[0120] 正向引物PF3 :如SEQ ID NO. 11所示
[0121] 反向引物PR3 :如SEQ ID NO. 12所示
[0122] 反應(yīng)程序：94 °C 5min，（94 °C 30sec，50 °C 30sec，72 °C 45sec) X30 循環(huán)， 72。。 lOmin ;
[0123] 4) L代轉(zhuǎn)基因大豆植株Southern雜交鑒定
[0124] 提取?；代轉(zhuǎn)基因大豆植株的基因組DNA，純化后用EcoRI進(jìn)行酶切16h，0. 8% (w/ v)瓊脂糖電泳分離，轉(zhuǎn)膜用于雜交。雜交探針的制備采用地高辛隨機(jī)引物標(biāo)記法進(jìn)行，選 用與大豆內(nèi)源P5CS基因序列相似性較低的639bp StP5CS基因編碼區(qū)片段用于探針標(biāo)記。 探針的標(biāo)記、雜交、顯色使用羅氏公司的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I (Roche, Germany)進(jìn)行。Southern雜交結(jié)果確認(rèn)StP5CS基因以低拷貝的形 式成功整合到大豆基因組中（圖5B)。
[0125] 4.純合體轉(zhuǎn)基因大豆的篩選
[0126] 1)?\代轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
[0127] 將?；代轉(zhuǎn)基因植株自交收獲的種子置于去離子水中浸泡吸漲4_5h，種子完全膨脹 后轉(zhuǎn)移至含有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，在25°C條件下催芽。待種子萌發(fā)后，分別播種于含有蛭 石和草炭（1:1，v/v)的塑料盆中[23(上直徑）X13(下直徑）X20cm(高）]，每盆播一粒 種子。真葉展開(kāi)后每2天澆1/4濃度的園試配方營(yíng)養(yǎng)液。當(dāng)?shù)谝黄鰪?fù)葉完全展開(kāi)后， 剪取葉片進(jìn)行⑶S組織化學(xué)分析和PCR鑒定。結(jié)果表明，外源基因在?\代中以3:1的比例 分離，符合孟德?tīng)栠z傳定律。
[0128] 2) Τ2代純合體轉(zhuǎn)基因株系的篩選
[0129] 為篩選純合的轉(zhuǎn)基因株系，將GUS和PCR檢測(cè)陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因 ?\代植株分別進(jìn)行自 交，收獲Τ2種子。收獲的種子按照上述方法催芽并播種于溫室。當(dāng)?shù)谝黄瑥?fù)葉完全展開(kāi)后， 取葉片進(jìn)行⑶S組織化學(xué)分析和PCR鑒定。經(jīng)鑒定有兩個(gè)株系，命名為Ζ1-3和Ζ2-7的后 代植株均顯示⑶S陽(yáng)性和StP5CS基因 PCR陽(yáng)性，說(shuō)明這兩個(gè)株系為純合體轉(zhuǎn)基因株系。
[0130] 四、T2代和T3代純合體轉(zhuǎn)基因大豆耐鹽性鑒定
[0131] 1. Τ2代純合體轉(zhuǎn)基因大豆盆栽法耐鹽性鑒定
[0132] 采用盆栽法對(duì)篩選得到的Τ2代純合轉(zhuǎn)基因株系（Ζ1-3和Ζ2-7)進(jìn)行耐鹽性鑒定， 并以野生型大豆植株作為對(duì)照。試驗(yàn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室進(jìn)行，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，植株在 溫室中隨機(jī)排列。溫室環(huán)境采用人工控制，晝夜溫度：25/20°C，相對(duì)濕度：70 - 80%，光周 期：16/8h (光照/黑暗），光照強(qiáng)度：600 μ mol. πΓ2· s-1 (PPFD)，C02濃度：400ppm。植株栽培 于含有蛭石和草炭（1:1，v/v)的塑料盆中[23(上直徑）X 13(下直徑）X20cm(高）]，每2 天澆1/4濃度的園試配方營(yíng)養(yǎng)液。當(dāng)?shù)谖迤鰪?fù)葉完全展開(kāi)后，從每個(gè)株系隨機(jī)選取生 長(zhǎng)一致的6株植株進(jìn)行200mM NaCl鹽脅迫處理。為了防止鹽激反應(yīng)，NaCl處理的濃度從 50mM開(kāi)始以50mM的梯度緩慢提高：前3天的處理濃度分別為50, 100, 150mM ;從第4天開(kāi)始 在200mM NaCl濃度條件下連續(xù)處理10天。200mM NaCl鹽處理10天后，進(jìn)行鹽害級(jí)別的統(tǒng) 計(jì)，測(cè)定株高、葉面積、相對(duì)葉綠素含量生長(zhǎng)指標(biāo)，然后常規(guī)管理直至植株結(jié)莢。
[0133] 鹽害級(jí)別統(tǒng)計(jì)時(shí)，將大豆的鹽害癥狀分為1到5五個(gè)級(jí)別，其中1 =無(wú)明顯的黃化 失綠癥狀；2 =輕度黃化（25%的葉片黃化失綠）；3 =中度黃化（50%的葉片有黃化癥狀， 其中一部分葉片干枯）；4=嚴(yán)重黃化（75%以上的葉片黃化，并且葉片干枯死亡）；5=植 株死亡（葉片嚴(yán)重的干枯，萎蔫）。各株系平均鹽害級(jí)別=Σ (該級(jí)別植株數(shù)X單株鹽害 級(jí)別）/各株系植株總數(shù)。葉面積的測(cè)量使用自動(dòng)葉面積測(cè)量?jī)x（YMJ-C，浙江托普儀器有限 公司）進(jìn)行。相對(duì)葉綠素含量使用SPAD_502Plus葉綠素儀（Minolta Camera Co.，Japan) 測(cè)定，以SPAD值表示，每株測(cè)量9次，取平均值代表該株的相對(duì)葉綠素含量。
[0134] 正常栽培條件下，轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照植株沒(méi)有明顯地表型差異。然而，如表1所 示，鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性顯著高于對(duì)照植株，純合轉(zhuǎn)基因株系Z1-3和Z2-7 的鹽害級(jí)別分別為1. 67和1. 83,而非轉(zhuǎn)基因株系的鹽害級(jí)別為4. 17。鹽脅迫處理10天后， 轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)表現(xiàn)良好，上部葉片生長(zhǎng)正常仍然保持綠色，而對(duì)照植株葉片黃化萎蔫，植 株底部葉片出現(xiàn)焦枯癥狀（圖6A)，生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株的株高、最大單葉葉 面積、葉綠素含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株。此外，在鼓粒期，轉(zhuǎn)基因植株的有效莢數(shù)顯著多 于對(duì)照植株。
[0135] 2. T3代純合體轉(zhuǎn)基因大豆水培法耐鹽性鑒定
[0136] Τ3代純合體轉(zhuǎn)基因株系由Τ2代純合體轉(zhuǎn)基因植株自交獲得，采用水培法對(duì)篩選 得到的Τ 3代純合轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行耐鹽性鑒定，試驗(yàn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室進(jìn)行，采用完全隨 機(jī)設(shè)計(jì)，每個(gè)株系處理8株植株（8次重復(fù)），植株在溫室中隨機(jī)排列。溫室環(huán)境采用人工 控制，晝夜溫度：25/201：，相對(duì)濕度 ：70 - 80%，光周期：16/811(光照/黑暗），光照強(qiáng)度： 600 μ mol. m_2_ iT1 (PPFD)，C02濃度：400ppm。試驗(yàn)在水培條件下進(jìn)行，營(yíng)養(yǎng)液采用1/2濃度的 園試配方營(yíng)養(yǎng)液。為保證處理?xiàng)l件的一致性，將T 3代Z1-3和Z2-7純合轉(zhuǎn)基因株系和野生 型對(duì)照大豆植株，每株系各一株栽培于同一個(gè)含有14L園試配方營(yíng)養(yǎng)液（EC = 2. 40dS ?πΓ1) 的塑料桶中，植株用海綿固定于泡沫板上（圖6Β)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行通氣供氧，每隔3天更換 一次營(yíng)養(yǎng)液。當(dāng)植株第五片三出復(fù)葉完全展開(kāi)后，在營(yíng)養(yǎng)液中添加 l〇〇mM NaCl脅迫處理， 為防止鹽激，最初2天的處理濃度為50mM，從第3天開(kāi)始NaCl濃度提高至100mM并維持10 天。鹽處理期間，每隔2天更換一次營(yíng)養(yǎng)液，EC值保持在11. 0-11. 5ds.Hr1之間，pH保持 在6. 0-6. 5之間。100mM NaCl處理10天后，進(jìn)行鹽害級(jí)別的統(tǒng)計(jì)，測(cè)定株高、葉面積、相對(duì) 葉綠素含量生長(zhǎng)指標(biāo)，然后常規(guī)管理直至植株結(jié)莢。生長(zhǎng)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)方法同盆栽試驗(yàn)。
[0137] 如表2所示，鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性顯著高于對(duì)照植株，純合轉(zhuǎn)基因 株系Z1-3和Z2-7的鹽害級(jí)別分別為1. 75和1. 50,而非轉(zhuǎn)基因株系的鹽害級(jí)別為4. 13。鹽 脅迫處理10天后，轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)表現(xiàn)良好，大部分葉片仍然保持綠色，而對(duì)照植株葉片 嚴(yán)重黃化萎蔫（圖6B)，生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株的株高、最大單葉葉面積、葉綠 素含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株。此外，在鼓粒期，T 3代轉(zhuǎn)基因植株的有效莢數(shù)顯著多于對(duì)照 植株。這些結(jié)果說(shuō)明，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽特性順利的遺傳到了后代中。
[0138] 3. StP5CS基因在Τ3代純合體中的表達(dá)分析
[0139] 采用熒光定量的方法檢測(cè)1~3代純合體轉(zhuǎn)基因株系中StP5CS基因的表達(dá)；如圖7所 示，在正常栽培和鹽脅迫處理兩種條件下，StP5CS基因在兩個(gè)純合體株系中均成功表達(dá)，且 鹽處理后StP5CS基因的表達(dá)量提高；而對(duì)照植株沒(méi)有檢測(cè)到StP5CS基因的表達(dá)，具體定量 方法如下：
[0140] 提取T3代純合體株系和對(duì)照植株的總RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù) StP5CS基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)的特異引物擴(kuò)增128bp編碼區(qū)：
[0141] 正向引物PF4:如SEQ ID N0. 13所示，
[0142] 反向引物PR4:如SEQ ID NO. 14所示；
[0143] 以大豆真核延伸因子基因 ELFlb作為內(nèi)參基因，擴(kuò)增引物為：
[0144] 正向引物 ELFlbF:如 SEQ ID N0. 15 所示，
[0145] 反向引物 ELFlbR:如 SEQ ID NO. 16 所示。
[0146] 熒光定量PCR在安捷倫Mx3005P熒光定量PCR儀上進(jìn)行，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA樣品稀 釋10倍作為熒光定量PCR擴(kuò)增的模板，反應(yīng)體系參照TaKaRaSYBFT Premix Ex Taq?說(shuō)明 書(shū)。熒光定量PCR反應(yīng)體系（25yL)包含：SYBir Premix Ex Taq?(2X)12. 5yL;正向和 反向引物各 〇· 5 μ L (20 μ mol · Γ1)，cDNA50ng，dd Η209· 5 μ L ;熒光定量 PCR 反應(yīng)程序：95°C 預(yù)變性30s后，95 °C變性5s，60°C退火20s，40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)結(jié)束后采集熒光信號(hào)進(jìn)行 實(shí)時(shí)檢測(cè)。以大豆真核延伸因子基因 ELFlb作為內(nèi)參基因，StP5CS基因的相對(duì)表達(dá)量通過(guò) 公式 2_Δσ 來(lái)計(jì)算。Λ CT = CTstRTO-CTRI.F J，其中 CTstPsre :為 StP5CS 基因的 CT 值，CTRI.F1h :為 大豆真核伸長(zhǎng)因子基因的CT值。
[0147] 表1盆栽試驗(yàn)200mM NaCl處理對(duì)T2代純合體轉(zhuǎn)基因大豆的耐鹽性及生長(zhǎng)的影 響
[0148]

【權(quán)利要求】
1. 一種野生茄子Λ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因 StP5CS，其特征在于：該基因序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
2. -種重組載體，其特征在于：該重組載體包含權(quán)利要求1所述的Λ1-吡咯啉-5-羧 酸合成酶基因 StP5CS。
3. 權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于：該重組載體為植物表達(dá)載體 pCAMBIA3301-StP5CS，含有StP5CS基因和抗除草劑bar基因，將StP5CS基因的5'端和3' 端分別引入CaMV35S啟動(dòng)子和nos終止子，并克隆到基礎(chǔ)載體pCAMBIA3301的T-DNA區(qū)得 到的。
4. 包含權(quán)利要求2或3所述重組載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
5. -種StP5CS耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法，其特征在于：將野生茄子StP5CS基因構(gòu) 建至PCAMBIA3301表達(dá)載體中，通過(guò)該表達(dá)載體將外源StP5CS基因?qū)氪蠖够蚪M中獲得 耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆。
6. 權(quán)利要求5所述的StP5CS耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆的培育方法，其特征在于：包括如下步 驟： 1. StP5CS耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體的獲得 將權(quán)利要求3所述的植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-StP5CS導(dǎo)入大豆基因組，通過(guò)除草劑 篩選獲得?；代轉(zhuǎn)基因大豆植株； 2) 純合體轉(zhuǎn)基因大豆的篩選 利用⑶S組織化學(xué)分析法和PCR鑒定法檢測(cè)?\代轉(zhuǎn)基因大豆，獲得陽(yáng)性植株，進(jìn)行自 交獲得Τ2代種子；選取Τ2代種子萌發(fā)后的第一片完全展開(kāi)葉，利用GUS組織化學(xué)分析法和 PCR鑒定法，選擇均為陽(yáng)性的株系，即為純合體轉(zhuǎn)基因株系。
7. 權(quán)利要求1所述基因或權(quán)利要求2或3所述重組載體在耐鹽轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用， 優(yōu)選地，為耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求4所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞在耐鹽轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，優(yōu)選地，為耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆 中的應(yīng)用。
9. 一種耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆StP5CS基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定方法，其特征在于：設(shè)計(jì)特異性 引物，通過(guò)熒光定量PCR測(cè)定StP5CS基因在耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆中的表達(dá)量； 其中，特異性引物： 上游引物PF4 :如SEQ ID No. 13所示， 下游引物PR4 :如SEQ ID No. 14所示。
10. -種耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆StP5CS基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定的試劑盒，其特征在于：該試劑 盒包括如下序列： StP5CS基因檢測(cè)引物，上游引物PF4:如SEQ ID No. 13所示，下游引物PR4:如SEQ ID No. 14所示； 大豆內(nèi)參基因 ELFlb的檢測(cè)引物，上游引物ELFlbF :如SEQ ID No. 15所示；下游引物 ELFlbR :如 SEQ ID No. 16 所示。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104099355SQ201410332153
【公開(kāi)日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月11日
【發(fā)明者】朱月林, 蓋鈞鎰, 張功臣 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)