一種黃綠綠僵菌mfyy090714及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種黃綠綠僵菌(Metarhizium?flavoviride)MFYY090714及其應用，其中，該黃綠綠僵菌MFYY090714于2014年4月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?NO.9020。該菌株是從白背飛虱體上分離得到的新菌株，培養(yǎng)比較簡單，生長快速，產孢量大，孢子萌發(fā)率高。其孢子懸浮液對白背飛虱成蟲致病力較好，環(huán)保無污染、不易產生抗藥性，可以廣泛用于白背飛虱的防治實踐中。
【專利說明】-種黃綠綠僵菌MFYY090714及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物農藥【技術領域】，尤其涉及一種黃綠綠僵菌MFYY090714及其應 用。

【背景技術】
[0002] 白背飛虱是一種水稻重要害蟲，常與褐飛虱和灰飛虱統(tǒng)稱為稻飛虱。近年來白背 飛虱已成為我國西南地區(qū)，尤其在云南稻區(qū)稻飛虱的優(yōu)勢種，由于其有繁殖快、遷飛性和抗 藥性強等特點，大發(fā)生時可造成水稻嚴重減產，甚至絕收，嚴重制約著水稻的生產。對白背 飛虱的防治一直以來都是害蟲防治研究的重要內容，但長期以來主要依靠化學農藥防治， 大量使用化學農藥對人類健康和環(huán)境造成威脅，因而探求環(huán)境友好的白背飛虱生物防治替 代化學防治，極大減少化學農藥的使用量已成為白背飛虱防治研究的重要課題。因白背飛 虱隸屬于刺吸式口器害蟲，而綠僵菌、白僵菌等蟲生真菌是以獨特的方式侵入，其分生孢子 主要通過表皮萌發(fā)侵入昆蟲體壁，這為利用綠僵菌和白僵菌生物防治白背飛虱提供了基 礎。黃綠綠僵菌（Metarhizium flavoviride)作為一種重要的昆蟲病原真菌，屬于半知菌亞 門絲孢綱綠僵菌屬真菌，其寄主范圍包括直翅目、同翅目、鞘翅目、半翅目、雙翅目、膜翅目、 鱗翅目等昆蟲目前英國已廣泛用于蝗蟲的生物防治。目前，有關稻田自然感染褐飛虱的黃 綠綠僵菌菌株及其致病性測定已有研究，但自然條件下侵染白背飛虱的黃綠綠僵菌及其對 白背飛虱的致病致病性及其防治應用方面的相關研究報道還未見到。
[0003] 黃綠綠僵菌遺傳穩(wěn)定性較好，對人、畜、禽類、植物均未發(fā)現(xiàn)毒害，本菌在白背飛虱 防治方面還未見報道。因此，在防治稻飛虱時又有很大的發(fā)展前景。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種黃綠綠僵菌（Metarhizium flavoviride)MFYY090714 及其應用，旨在以該黃綠綠僵菌高效、無毒、安全、無殘留、使用簡便地防治白背飛虱。
[0005] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種黃綠綠僵菌（Metarhizium flavoviride)MFYY090714 已于2014年4月8日保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC)，保 藏號為No. 9020,保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所， 郵編為100101。
[0006] 本發(fā)明從罹病白背飛虱成蟲上分離獲得黃綠綠僵菌野生菌株MFYY090714,將野生 菌株MFYY090714回接于白背飛虱成蟲上復壯得到黃綠綠僵菌菌株，對該菌株按常規(guī)方法 進行單孢分離、培養(yǎng)得到純的、致病力強的黃綠綠僵菌。在PDA培養(yǎng)基上菌落圓形展開，黃 綠色，氣生菌絲絨毛狀致密如絮，背面略顯黃色。分生孢子梗疏松輪狀分枝，其上著生1? 2個瓶梗，瓶梗桿狀，與孢子梗成寬的夾角，頂部劇尖（7. 2_) 12. 0?4. 8 (-15. 6) X 1. 8? 3. 0 μ m，分生孢子單胞，廣卵圓形，具不同的端部，大小為7. 2?9. 3 X 3. 0?4. 0 μ m，分生孢 子在瓶梗上形成向基性的鏈。該黃綠綠僵菌MFYY090714菌株屬于快生長類型，菌落直徑平 均每天都有l(wèi)cm以上的生長速度。產孢快、產孢量大，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)第5天時產孢量 就可達IX 108孢子/ml。24小時孢子的萌發(fā)率達85%以上。在26°C時，該菌分生孢子對 白背飛虱成蟲致死中濃度（LC5Q)為3. 43X 105孢子/ml，LT5Q為4. 15天。
[0007] 本發(fā)明的有益效果為：該菌株是從白背飛虱體上分離得到的新菌株，培養(yǎng)比較簡 單，生長快速，產孢量大，孢子萌發(fā)率高。其孢子懸浮液對白背飛虱成蟲致病力較好，環(huán)保無 污染、不易產生抗藥性，可以廣泛用于白背飛虱的防治實踐中。

【具體實施方式】
[0008] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明 進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0009] 實施例一、病原菌的分離、鑒定
[0010] 1、材料與方法
[0011] 1. 1 材料
[0012] 在云南省元陽梯田稻田采集到被一種蟲生真菌侵染后的罹病白背飛虱Sogatella furcifera(Horv0th)成蟲。
[0013] 馬鈴薯葡萄糖（PDA)培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水lL，20min后紗布 過濾，濾液中加葡萄糖20g、瓊脂15?20g，加熱溶化，定溶至1000mL無菌操作條件：所有的 器皿和用具均經高溫滅菌鍋（121°C，30min)，接種等操作均在超凈工作臺內進行。
[0014] 培養(yǎng)條件：置于26°C光照（12L :12D)恒溫箱中培養(yǎng)，待菌落形成后，轉移到試管 PDA斜面，培養(yǎng)3?4天，轉入4°C冰箱儲存。
[0015] 1.2病原菌的分離和純化
[0016] 分離：從罹病白背飛虱成蟲尸體上分離病原菌。將白背飛虱成蟲尸體按順序依次 經過70%酒精浸泡30秒、再經過0. 1 %升汞溶液浸泡3分鐘（徹底消毒）、最后用無菌水沖 洗三次，將處理好的白背飛虱成蟲尸體接種于PDA培養(yǎng)基上。在溫度為26°C條件下培養(yǎng)， 長出菌絲后按常規(guī)方法進行單孢分離、培養(yǎng)得到純的、致病力強的黃綠綠僵菌菌株，轉移到 PDA斜面上生長3?4天，在4°C冰箱儲存。
[0017] 復壯：將分離到的菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7?10天后，加入含1 %吐溫-80的無 菌水收集孢子，后轉移到燒杯內，用玻璃棒攪拌均勻，得到適當濃度（1〇8孢子/ml)的孢子 懸浮液，用小型噴霧器均勻噴于白背飛虱成蟲體表（以蟲體表面濕潤為度），保持相對濕度 90%以上。收集死蟲并保濕，得到的成蟲蟲尸再按以上方法分離得到致病力更強的菌株。
[0018] 純化：挑取培養(yǎng)基上菌落上的菌絲，再次接種在新的培養(yǎng)基上。如此多培養(yǎng)幾代， 菌株就得到了純化。
[0019] 1.3病原菌的鑒定
[0020] 根據病原菌的培養(yǎng)性狀、菌絲和分生孢子的形態(tài)進行鑒定。在40X 10倍生物顯微 鏡，鏡檢菌絲和分生孢子的形態(tài)。
[0021] 2、結果
[0022] 從被蟲生真菌自然侵染的白背飛虱成蟲蟲體上分離獲得野生菌株，在馬鈴薯葡 萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA)上培養(yǎng)，并回接于白背飛虱成蟲復壯獲得一菌株，對該菌株進行單 菌絲分離獲得純化的菌株，即黃綠僵菌（Metarhizium flavoviride)MFYY090714，CGMCC No. 9020〇
[0023] 在PDA培養(yǎng)基上菌落圓形展開，黃綠色，氣生菌絲絨毛狀致密如絮，背面略顯黃 色。分生孢子梗疏松輪狀分枝，其上著生1?2個瓶梗，瓶梗桿狀，與孢子梗成寬的夾角，頂 部劇尖（7. 2_) 12. 0?4. 8(-15. 6) X 1. 8?3. 0 μ m，分生孢子單胞，廣卵圓形，具不同的端 部，大小為7. 2?9. 3X3. 0?4. 0 μ m，分生孢子在瓶梗上形成向基性的鏈。
[0024] 根據觀察到的菌落、菌絲和孢子形態(tài)，與《昆蟲真菌學》上的有關黃綠綠僵菌的形 態(tài)特征描述和圖譜進行對比分析，鑒定為黃綠綠僵菌。
[0025] 實施例二、黃綠綠僵菌純化菌株生物學特性
[0026] 1、材料與方法
[0027] 1. 1供試菌株選擇純化后長得均勻且生長旺盛的一皿作為供試菌株。取菌絲再 次接種到PDA培養(yǎng)基上，于26 °C的恒溫光照（12L:12D)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0028] 1. 2菌落生長速率和產孢量的測定將事先培養(yǎng)好的黃綠綠僵菌取一皿用8mm 的打孔器打孔取菌，接種于新的培養(yǎng)基上，做三個重復，置于26°C的恒溫光照（12D:12L)培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時測定其直徑并記錄，直到菌落長滿培養(yǎng)基為止。用直徑為8_的打孔 器在培養(yǎng)基相同的位置取菌餅，加1 %吐溫-80和20ml無菌水，將孢子洗下，制成孢子懸浮 液，用血球計數板測定產孢量。
[0029] 1. 3孢子萌發(fā)率的測定將菌株培養(yǎng)5?10天，分別用無菌水收集分生孢子，制 成懸浮液，用帶凹槽的載玻片測定孢子萌發(fā)率。將孢子懸浮液直接滴在無菌載玻片上，置于 底鋪濾紙的培養(yǎng)皿內，滴加幾滴無菌水保持濕度在100% RH，培養(yǎng)24小時后鏡檢，每個處理 三次重復。
[0030] 2、結果
[0031] 由表1可以看出，黃綠綠僵菌菌株MFYY090714屬于快速生長的類型。第一天生長 緩慢，是因為菌株剛接種時需要一段時間適應，菌落從第2天生長速度較快。由表2可以看 出，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)至第5天產孢量就可達IX 108孢子/ml。產孢量較高。由表3可 以看出，24小時孢子的萌發(fā)率可達85%以上。這些均說明該菌株生長繁殖較快，生物學特 性良好。
[0032] 表1菌落直徑的生長速度
[0033]

【權利要求】
1. 一種黃綠綠僵菌（Metarhizium flavoviride)MFYY090714,于 2014 年 4 月 8 日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 9020。
2. 權利要求1所述的黃綠綠僵菌MFYY090714在白背飛虱防治方面的應用。
【文檔編號】A01N63/04GK104120084SQ201410335748
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月15日 優(yōu)先權日:2014年7月15日
【發(fā)明者】陳斌, 杜廣祖, 肖關麗, 和淑琪, 張立敏, 桂富榮, 李正躍, 嚴乃勝 申請人:云南農業(yè)大學