一種蘇丹草體外誘導(dǎo)管胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種蘇丹草體外誘導(dǎo)管胞分化的方法，屬于植物細(xì)胞工程【技術(shù)領(lǐng)域】。以蘇丹草種子組織培養(yǎng)誘導(dǎo)的淡黃色顆粒狀愈傷組織為外植體，在不含植物生長激素的基本培養(yǎng)基中，添加1.0～9.0g/L活性炭，在黑暗、每日16h和24h的散射光下培養(yǎng)5～21d，培養(yǎng)室溫度26～28℃，體外誘導(dǎo)獲得了管胞。本發(fā)明建立的蘇丹草體外誘導(dǎo)管胞分化的方法，管胞分化率最高達(dá)到47.23％，本發(fā)明的優(yōu)點是：操作簡便，誘導(dǎo)效率高，為蘇丹草次生細(xì)胞壁木質(zhì)素調(diào)控機(jī)制研究和定向改良提供了技術(shù)支撐。
【專利說明】一種蘇丹草體外誘導(dǎo)管胞的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蘇丹草體外誘導(dǎo)管胞的方法，屬于植物細(xì)胞工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
技術(shù)背景
[0002]高粱屬的蘇丹草是世界各國栽培最普遍的禾本科牧草，為各類草食畜禽及食草性魚類所喜食，同時，由于蘇丹草具有生物產(chǎn)量高、耐貧瘠、抗干旱、可多次刈割及光合效率高的特性，作為一種主要的木質(zhì)纖維素類高能密度作物正日益受到重視。已有研究表明，生產(chǎn)相同量的青貯飼料，土地種植面積蘇丹草是青貯玉米的60 %，單位重量的蘇丹草沼氣生產(chǎn)量比青貯玉米提高32 %，在歐洲，I公頃蘇丹草可發(fā)酵產(chǎn)生2130?6060m3的甲烷，而蘇丹草飼料化利用和能源轉(zhuǎn)化效率都與次生細(xì)胞壁中的木質(zhì)素含量負(fù)相關(guān)。國外的研究表明，體外誘導(dǎo)管胞分化的植物細(xì)胞培養(yǎng)方法是研究次生細(xì)胞壁木質(zhì)素生物合成機(jī)制的有效手段，可為木質(zhì)纖維素植物定向改良提供技術(shù)支撐，已報道建立了百日草(Zinnia elegans L.)、煙草(Nicotiana tabacum L.)和福射松(Pinus radiateD.)等植物細(xì)胞培養(yǎng)體外誘導(dǎo)管胞的方法，結(jié)果表明影響管胞形成的因子各不相同，而國內(nèi)外有關(guān)蘇丹草體外誘導(dǎo)管胞的方法尚未見報道。
[0003]中國專利200510122788.4公開了一種蘇丹草體細(xì)胞培養(yǎng)高頻率植株再生技術(shù)，然后中國專利201210522552.X公開了一種蘇丹草種子組織培養(yǎng)技術(shù)，這二項專利技術(shù)的目的均是為了獲得具有細(xì)胞全能性的胚性愈傷組織，獲得的胚性愈傷組織是活的細(xì)胞，能分化成苗，為深入進(jìn)行蘇丹草遺傳轉(zhuǎn)化和性狀改良提供了研究平臺。而管胞是一種無穿孔的狹長管狀分子，兩端漸尖，細(xì)胞壁明顯增厚，并木質(zhì)化，成熟后原生質(zhì)體解體，細(xì)胞死亡，不能分化成苗。正是由于上述不同，體外誘導(dǎo)管胞分化的影響因素，如所需的營養(yǎng)元素、激素的種類及濃度，還有誘導(dǎo)培養(yǎng)條件等均與蘇丹草種子和幼穗組織培養(yǎng)技術(shù)有很大差異，無法相互借鑒。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是:提供一種利用蘇丹草種子誘導(dǎo)胚性愈傷組織，并進(jìn)行體外誘導(dǎo)管胞分化的方法，該方法能夠使蘇丹草胚性愈傷組織管胞分化率最高達(dá)47.23%,為研究木質(zhì)纖維素能源作物次生細(xì)胞壁調(diào)控機(jī)制和蘇丹草定向改良提供研究基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。
[0005]本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0006]一種蘇丹草體外誘導(dǎo)管胞分化的方法，以蘇丹草種子組織培養(yǎng)誘導(dǎo)的淡黃色顆粒狀愈傷組織為外植體，在不含植物生長激素的基本培養(yǎng)基中，添加1.0?9.0g/L活性炭，在每日16h或24 h的散射光下培養(yǎng)5?21d，培養(yǎng)室溫度26?28°C，體外誘導(dǎo)獲得管胞；其中，所述的基本培養(yǎng)基為:MS大量元素+MS微量元素+B5有機(jī)成分+鹿糖30g/L+瓊脂條8g/L，培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值至5.8?5.9。
[0007]所述的蘇丹草體外誘導(dǎo)管胞分化的方法優(yōu)選以蘇丹草種子組織培養(yǎng)誘導(dǎo)的淡黃色顆粒狀愈傷組織為外植體，在不含植物生長激素的基本培養(yǎng)基中，添加1.0?7.0g/L活性炭，在每日16h或24h的散射光下培養(yǎng)12?21d，培養(yǎng)室溫度26?28°C，體外誘導(dǎo)獲得管胞。
[0008]所述的蘇丹草體外誘導(dǎo)管胞分化的方法，進(jìn)一步優(yōu)選包含以下步驟:
[0009]a.種子的消毒
[0010]b.愈傷組織的誘導(dǎo):將經(jīng)消毒處理的種子接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)室暗培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度為26?28°C，35?40d后獲得淡黃色、顆粒狀愈傷組織；
[0011]c.愈傷組織的繼代培養(yǎng):從愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上選用淡黃色、顆粒狀胚性愈傷組織，接種到繼代培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)21?28d，培養(yǎng)室溫度26?28°C ；
[0012]d.愈傷組織的管胞誘導(dǎo):取生長旺盛的淡黃色較松散的顆粒狀胚性愈傷組織，接種到愈傷組織管胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每天光照16H或24h，培養(yǎng)12?21d，培養(yǎng)室溫度26?28 0C ；
[0013]其中，所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:基本培養(yǎng)基附加2，4-D3mg/L、ΚΤ0.2mg/L和水解酪蛋白酶lg/L ；
[0014]所述的愈傷組織繼代培養(yǎng)基為:基本培養(yǎng)基附加2，4-D2mg/L和0.05mg/L6_BA ；
[0015]所述的管胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:基本培養(yǎng)基附加3.0g/L活性炭；
[0016]培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值至5.8?5.9。
[0017]所述的蘇丹草體外誘導(dǎo)管胞分化的方法，步驟a所述的種子消毒方法優(yōu)選為:選擇生長健壯、外形飽滿的蘇丹草種子，在超凈工作臺上，放入1ml無菌離心管中用70%酒精浸泡處理lmin，輕輕搖動，倒掉70%酒精后加入50%次氯酸鈉溶液，蓋緊無菌離心管，固定在振蕩器上振蕩處理30min后，在超凈工作臺上用無菌水沖洗消毒種子8?10次。
[0018]有益效果
[0019]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點和積極效果:
[0020]本發(fā)明以蘇丹草種子組織培養(yǎng)誘導(dǎo)獲得的胚性愈傷組織為外植體，通過在不含激素的繼代培養(yǎng)基中添加1.0?9.0g/L活性碳，每日光照16h或24h條件下體外培養(yǎng)誘導(dǎo)管胞分化，管胞分化率達(dá)31.01?47.23%，是國內(nèi)外率先建立的蘇丹草胚性愈傷組織體外培養(yǎng)誘導(dǎo)管胞分化的方法，為開展蘇丹草次生細(xì)胞壁木質(zhì)素調(diào)控機(jī)制研究、高消化率和乙醇高轉(zhuǎn)化效率定向育種提供了重要的技術(shù)支撐。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1種子誘導(dǎo)的愈傷組織
[0022]圖2無管胞分化的細(xì)胞
[0023]圖3蘇丹草胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的管胞，其中A圖為10X40倍物鏡下的管胞，B圖為1X 100倍物鏡下的管胞
[0024]圖4活性炭含量3g/L的管胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中蘇丹草管胞分化率隨培養(yǎng)天數(shù)的變化

【具體實施方式】
[0025]實施例1
[0026](I)材料
[0027]選用蘇丹草自交系2098，于1996年引自日本；擬高粱系野生種質(zhì)，1998年從福建農(nóng)學(xué)院引進(jìn)；2002年以蘇丹草為母本、擬高粱為父本遠(yuǎn)緣雜交獲得多年生蘇丹草(公知公用，鐘小仙，顧洪如，丁成龍，等.蘇丹草與擬高粱遠(yuǎn)緣雜交初報.草地學(xué)報，2002，10 (I):24-27.)。
[0028](2)試驗方法
[0029]a.種子消毒
[0030]選擇生長健壯、外形飽滿、可多年生的蘇丹草種子，在超凈工作臺上，放入1ml無菌離心管中用70%酒精浸泡處理lmin，輕輕搖動，倒掉70%酒精后加入50%次氯酸鈉溶液，蓋緊無菌離心管，固定在振蕩器上振蕩處理30min后，在超凈工作臺上用無菌水沖洗消毒種子10次；
[0031]b.愈傷組織的誘導(dǎo)
[0032]將經(jīng)上述處理的種子接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)室暗培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度為26?28°C，誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:MS大量元素、MS微量元素、B5有機(jī)成分、蔗糖30g/L、瓊脂條8g/L為基本培養(yǎng)基，附加2，4-D3mg/L、KT0.2mg/L和水解酪蛋白酶lg/L，培養(yǎng)基pH值至
5.8-5.9，35d后獲得淡黃色、顆粒狀愈傷組織(圖1);
[0033]c.胚性愈傷組織的繼代培養(yǎng)
[0034]從誘導(dǎo)培養(yǎng)基上選用結(jié)構(gòu)致密的愈傷組織塊上自動脫落的淡黃色、顆粒狀胚性愈傷組織，接種到繼代培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)25d，繼代培養(yǎng)基配方為:MS大量元素、MS微量元素、B5有機(jī)成分、蔗糖30g/L、瓊脂條8g/L為基本培養(yǎng)基，附加2，4_D2mg/L和0.05mg/L6-BA,培養(yǎng)基pH值至5.9，培養(yǎng)室溫度26?28°C ;
[0035]d.胚性愈傷組織的管胞分化
[0036]取繼代暗培養(yǎng)25d、生長旺盛的淡黃色顆粒狀胚性愈傷組織，接種到愈傷組織管胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)或每天光照16h或24h，培養(yǎng)5?21d，培養(yǎng)基配方為:MS大量元素、MS微量元素、B5有機(jī)成分、蔗糖30g/L、瓊脂條8g/L為基本培養(yǎng)基，附加1.0?9.0g/L活性炭，培養(yǎng)基PH值至5.9，培養(yǎng)室溫度26?28V。
[0037]e.管胞分化率的測定
[0038]每個不同活性炭濃度處理隨機(jī)選取5塊愈傷，共3次重復(fù)，用刀片切取愈傷組織塊表面部分，用10%的NaOH浸泡過夜后用蒸餾水沖洗3次，用0.01 %番紅染液染色30min，光學(xué)顯微鏡明場下進(jìn)行圖像采集，每塊愈傷隨機(jī)挑選10個圖像進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和管胞分化率的測定，管胞分化率計算公式如下:
[0039]管胞分化率=圖像中管胞總數(shù)/圖像中細(xì)胞總數(shù)X 100%。
[0040](3)試驗結(jié)果
[0041]a.不同光照培養(yǎng)時間對胚性愈傷組織管胞分化率的影響
[0042]當(dāng)繼代培養(yǎng)25d的胚性愈傷組織接種到不含任何激素的管胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，20d時取樣觀察結(jié)果表明，黑暗條件下培養(yǎng)的愈傷組織無任何管胞產(chǎn)生，每天光照16h和24h條件下培養(yǎng)的愈傷組織管胞分化率分別為20.59%和20.81 %，每天光照16h和24h培養(yǎng)條件下管胞分化率無顯著差異。
[0043]在管胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加lg/L的活性炭，黑暗、16h/d和24h/d光照條件下培養(yǎng)，蘇丹草胚性愈傷組織均能分化管胞，管胞分化率分別為19.56%,31.01%,30.38%，管胞分化率黑暗培養(yǎng)顯著低于每天光照16h和24h培養(yǎng)，但每天光照16h與每天光照24h培養(yǎng)條件下管胞分化率無顯著差異。
[0044]b.不同活性炭濃度對胚性愈傷組織管胞分化率的影響
[0045]黑暗培養(yǎng)條件下，在活性炭濃度為1.0,3.0,5.0,7.0和9.0g/L的管胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，胚性愈傷組織培養(yǎng)20d時取樣觀察，結(jié)果表明，管胞分化率分別為19.68%,28.75%,21.89%,21.83%,20.60%，除活性炭濃度為5g/L、7g/L的兩處理組間管胞分化率無顯著差異外，其他各活性炭濃度處理間管胞分化率均有顯著差異，其中以活性炭濃度為3.0g/L的培養(yǎng)基中管胞分化率顯著最高。
[0046]光照16h/d條件下培養(yǎng)，在活性炭濃度為1.0、3.0、5.0、7.0和9.(^/1管胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，胚性愈傷組織培養(yǎng)20d時取樣觀察結(jié)果表明，管胞分化率分別為31.32%、47.05%,32.68%,28.61%,24.96%，不同處理組間差異均達(dá)到顯著水平，且以培養(yǎng)基中含3g/L活性炭的培養(yǎng)基中，管胞分化率極顯著高于其它處理。
[0047]c.培養(yǎng)天數(shù)對胚性愈傷組織管胞分化率的影響
[0048]含3g/L活性炭的管胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中、每天光照16h條件下培養(yǎng)胚性愈傷組織，培養(yǎng)I?4d的蘇丹草胚性愈傷組織，顏色為淡黃色，與繼代培養(yǎng)初始愈傷相比沒有發(fā)生明顯的外形變化；培養(yǎng)5d的蘇丹草愈傷組織，顏色絕大部分為淡黃色，但愈傷組織表面開始出現(xiàn)褐色斑點；培養(yǎng)1d的蘇丹草愈傷組織，表面出現(xiàn)大面積褐色、水潰狀愈傷；培養(yǎng)20d的蘇丹草愈傷組織，表面絕大部分呈現(xiàn)褐色。管胞分化率變化曲線顯示，在胚性愈傷組織培養(yǎng)前4d，蘇丹草愈傷組織中未發(fā)現(xiàn)管胞，第5d開始出現(xiàn)管胞，隨著誘導(dǎo)時間的延長，管胞的分化率迅速增加，至18?21d管胞分化率達(dá)到穩(wěn)定，胚性愈傷組織培養(yǎng)5、6、9、12、15、18 和 21d 的管胞分化率分別為 5.36%,18.40%,27.20%,41.77%,42.22%,47.17%和47.23%，除培養(yǎng)18d和21d的管胞分化率無顯著差異外，其它處理間均達(dá)到極顯著差異，在活性炭含量為3g/L的管胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18d和21d的胚性愈傷組織管胞分化率平均值為 47.20% (圖 4)。
【權(quán)利要求】
1.一種蘇丹草體外誘導(dǎo)管胞分化的方法，其特征在于:以蘇丹草種子組織培養(yǎng)誘導(dǎo)的淡黃色顆粒狀愈傷組織為外植體，在不含植物生長激素的基本培養(yǎng)基中，添加1.0?9.0g/L活性炭，在16h/d或24h/d的散射光下培養(yǎng)5?21d，培養(yǎng)室溫度26?28°C，體外誘導(dǎo)獲得管胞；其中，所述的基本培養(yǎng)基為:MS大量元素+MS微量元素+B5有機(jī)成分+鹿糖30g/L+瓊脂條8g/L，培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值至5.8?5.9。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘇丹草體外誘導(dǎo)管胞分化的方法，其特征在于以蘇丹草種子組織培養(yǎng)誘導(dǎo)的淡黃色顆粒狀愈傷組織為外植體，在不含植物生長激素的基本培養(yǎng)基中，添加1.0?7.0g/L活性炭，在16h/d或24/d的散射光下培養(yǎng)12?21d，培養(yǎng)室溫度26?28°C，體外誘導(dǎo)獲得管胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蘇丹草體外誘導(dǎo)管胞分化的方法，其特征在于包含以下步驟: a.種子的消毒； b.愈傷組織的誘導(dǎo):將經(jīng)消毒處理的種子接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)室暗培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度為26?28°C，35?40d后獲得淡黃色、顆粒狀愈傷組織； c.愈傷組織的繼代培養(yǎng):從愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上選用淡黃色、顆粒狀胚性愈傷組織，接種到繼代培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)21?28d，培養(yǎng)室溫度26?28°C ； d.愈傷組織的管胞誘導(dǎo):取生長旺盛的淡黃色較松散的顆粒狀胚性愈傷組織，接種到愈傷組織管胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，光照16h/d或24h/d，培養(yǎng)12?21d，培養(yǎng)室溫度26?28°C ； 其中，所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:基本培養(yǎng)基附加2，4-D3mg/L、KT0.2mg/L和水解酪蛋白酶lg/L ； 所述的愈傷組織繼代培養(yǎng)基為:基本培養(yǎng)基附加2，4-D2mg/L和0.05mg/L6_BA ； 所述的管胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:基本培養(yǎng)基附加3.0g/L活性炭； 培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值至5.8?5.9。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蘇丹草體外誘導(dǎo)管胞分化的方法，其特征在于步驟a所述的種子消毒方法為:選擇生長健壯、外形飽滿的蘇丹草種子，在超凈工作臺上，放入1ml無菌離心管中用70%酒精浸泡處理lmin，輕輕搖動，倒掉70%酒精后加入50%次氯酸鈉溶液，蓋緊無菌離心管，固定在振蕩器上振蕩處理30min后，在超凈工作臺上用無菌水沖洗消毒種子8?10次。
【文檔編號】A01H4/00GK104126510SQ201410364395
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】鐘小仙, 劉兆明, 劉智微, 馬鐘杰, 錢晨, 張建麗, 吳娟子 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院