一個(gè)高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物的硬紫草轉(zhuǎn)LeEIL-1基因毛狀根株系的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個(gè)能高產(chǎn)紫草藥用天然產(chǎn)物(紫草寧及其衍生物)的硬紫草的轉(zhuǎn)基因毛狀根株系。該株系通過構(gòu)建一個(gè)硬紫草乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因(LeEIL-1)的植物過表達(dá)載體，然后將該載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834后，侵染硬紫草的無菌苗而獲得。該轉(zhuǎn)基因株系所產(chǎn)紫草寧及其衍生物的含量是直接用ATCC15834侵染硬紫草無菌苗所獲得的毛狀根株系的2.81倍。同時(shí)，該株系易于繁殖、生長迅速。本發(fā)明不僅可有效解決我國野外硬紫草資源日益短缺、人工栽培周期長、受氣候及地理?xiàng)l件等因素制約等問題，并且可高效大量生產(chǎn)硬紫草藥用天然產(chǎn)物。該高產(chǎn)株系將為利用硬紫草毛狀根工廠化生產(chǎn)硬紫草藥用天然產(chǎn)物提供材料支撐，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。
【專利說明】一個(gè)高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物的硬紫草轉(zhuǎn)LeE I L-1基因毛狀根株 系

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及將攜帶目的基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng) 桿菌，然后再侵染硬紫草無菌苗而誘導(dǎo)出轉(zhuǎn)基因的毛狀根株系。

【背景技術(shù)】
[0002] 硬紫草（Lithospermum erythrorhizon sieb. et zucc)是我國一種重要的藥用 植物，其根部可合成紫紅色的萘醌類藥用天然產(chǎn)物--紫草寧及其衍生物（以下簡稱紫草 寧），這類物質(zhì)具有抗菌、消炎、活血等功效，而且還是一種珍貴的天然色素，可以廣泛用于 食品、高級(jí)化妝品、日化產(chǎn)品與塑料制品的著色等 [η]。近年來國內(nèi)外的研究還發(fā)現(xiàn)紫草 寧通過活化Caspase-3和抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶活性來誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是繼喜樹堿、紫 杉醇之后又一類極具潛力的天然抗菌消炎、抗腫瘤、抑制HIV病毒等多種藥理活性的藥物
[4-6] 〇
[0003] 在我國有新疆紫草、東北硬紫草、內(nèi)蒙紫草、滇紫草、廣西紫草等分布于相應(yīng)地區(qū)。 近年來，隨著東北長白山脈及內(nèi)蒙古草原地帶的對(duì)人為過度開發(fā)利用及放牧，以及自然生 態(tài)環(huán)境日漸惡化，作為重要紫草種類的硬紫草，其野生紫草資源日趨枯竭。
[0004] 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，采用生物工程學(xué)手段生產(chǎn)人類所需的紫草寧，成為一 種非常重要的替代手段。上世紀(jì)70年代，日本即已成功利用兩階段培養(yǎng)法，即在光照條件 下B5固體培養(yǎng)基上繁殖紫草細(xì)胞，然后在黑暗條件下利用M9液體生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)紫草 細(xì)胞進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)紫草寧，紫草也從而成為世界上第一個(gè)采用細(xì)胞培養(yǎng)體系來商業(yè)化生 產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物的藥用植物 [7]。但在實(shí)踐過程中發(fā)現(xiàn)，用細(xì)胞生產(chǎn)紫草寧存在誘導(dǎo)愈傷細(xì) 胞困難、細(xì)胞易于老化褐化、紫草寧產(chǎn)量不高、產(chǎn)量不穩(wěn)定、夏季難產(chǎn)或不產(chǎn)紫草寧等諸多 問題。
[0005] 發(fā)根農(nóng)桿菌是在植物基因工程中廣泛應(yīng)用的一種侵染性很強(qiáng)的根瘤菌科農(nóng)桿菌 屬革蘭氏陰性菌，其攜帶的Ri質(zhì)粒能有效侵染絕大多數(shù)雙子葉植物，少數(shù)單子葉植物以及 個(gè)別裸子植物，誘發(fā)植物產(chǎn)生形狀如根系的發(fā)根即毛狀根（hairy root)。由于發(fā)根農(nóng)桿菌 轉(zhuǎn)化的毛狀根具有生長速度快、分支多，能夠持續(xù)合成次生代謝產(chǎn)物，獲得的次生代謝產(chǎn)物 量高且穩(wěn)定、不需要添加外源植物激素等特點(diǎn)，因此可作為生產(chǎn)和研究植物次生代謝物質(zhì) 的生物反應(yīng)器；同時(shí)，由于發(fā)根農(nóng)桿菌攜帶的Ri質(zhì)粒能將外源基因整合到寄主染色體、其 誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根易獲得再生植株等優(yōu)點(diǎn)，因此，建立特定植物的轉(zhuǎn)基因毛狀根體系，在定 向分子育種方面具有廣泛應(yīng)用前景。近年來利用發(fā)根農(nóng)桿菌已轉(zhuǎn)化大約160多種植物，在 40多種植物建立了毛狀根培養(yǎng)體系，特別是一些藥用植物建立了毛狀根轉(zhuǎn)基因體系，極大 地方便了藥用天然產(chǎn)物生產(chǎn)及遺傳育種研究。
[0006] 紫草寧的合成受到多種物理和化學(xué)因素的影響，如光、無機(jī)鹽離子、植物激素（乙 烯和茉莉酸等）[8_1(1]。乙烯是一種能調(diào)控植物生長發(fā)育、抗逆境脅迫反應(yīng)等多個(gè)方面的氣態(tài) 類激素，通過改變乙烯濃度，或者改變植物乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑中關(guān)鍵靶標(biāo)基因的表達(dá)，可以 改變植物對(duì)天然產(chǎn)物的合成調(diào)控，如改變煙草ERF189及ERF163表達(dá)，可直接促進(jìn)煙草生物 堿的合成[11];研究表明，乙烯同樣參與紫草寧的合成調(diào)控[12]。
[0007] 紫草的 LeEIL-1 (L. erythrorhizon EIN3_like protein 1)基因編碼 EIN3 轉(zhuǎn)錄因 子家族蛋白LeEIL-1。EIN3/EIL1是乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在乙烯介導(dǎo)的植 物生長發(fā)育及代謝調(diào)控中起重要作用。紫草細(xì)胞從B5轉(zhuǎn)入M9中后，LeEIL-Ι受誘導(dǎo)表達(dá)， 并且在紫草根部（紫草寧合成的特異性部位）高表達(dá)，推測該基因參與乙烯介導(dǎo)的對(duì)紫草 寧的合成調(diào)控 [13]。
[0008] 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將紫草本身的LeEIL-Ι基因轉(zhuǎn)入紫草中過表達(dá)，改變紫草細(xì)胞中 內(nèi)源乙烯對(duì)紫草寧的合成調(diào)控，從中篩選出高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物的硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根株 系，在理論上是完全可行的。
[0009] 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物的紫草毛狀根株系，不僅在系統(tǒng)研究紫草 藥用天然產(chǎn)物生物合成途徑及其分子調(diào)控機(jī)制方面具有重要的理論意義，并在商業(yè)化生產(chǎn) 紫草藥用天然產(chǎn)物方面具有非常重要的應(yīng)用前景和價(jià)值。盡管目前國內(nèi)外有利用毛狀根為 材料對(duì)紫草寧合成調(diào)控進(jìn)行的相關(guān)研究，但并無將紫草EIN3/EIL1家族蛋白的相關(guān)基因轉(zhuǎn) 入發(fā)根農(nóng)桿菌，誘導(dǎo)出能高效合成紫草藥用天然產(chǎn)物的紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根并藉此提高紫草 寧合成的相關(guān)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明需要解決的問題是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得一個(gè)高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物的硬紫草 轉(zhuǎn)基因毛狀根株系，主要是通過將所選擇的目的基因（硬紫草中編碼EIN3轉(zhuǎn)錄因子家族蛋 白LeEIL-Ι的基因 LeEIL-Ι)轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌，然后侵染硬紫草無菌苗，誘導(dǎo)出含目的基因 的硬紫草毛狀根，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因毛狀根擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行分子鑒定和藥用天然產(chǎn)物含量檢 測。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)方案包括如下步驟：
[0012] (1)硬紫草無菌苗培養(yǎng)：選取飽滿的硬紫草種子，清洗后置于4°C環(huán)境中培養(yǎng)，直 至種子發(fā)芽；挑取剛發(fā)芽的種子，用6%的次氯酸鈉消毒后，無菌水洗干凈；置于MS培養(yǎng)基 培養(yǎng)一定數(shù)量的紫草無菌苗。一個(gè)月后，當(dāng)紫草無菌苗生長到一定高度后作為誘導(dǎo)毛狀根 的外植體。
[0013] (2)轉(zhuǎn)基因侵染菌液制備：高保真酶擴(kuò)增目的基因 LeEIL-Ι，將獲得的目的片段與 真核表達(dá)載體pBI121-eGFP(真核表達(dá)載體pBI121中插入增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因 eGFP 序列，代替了 PBI121中的標(biāo)記基因 GUS，以方便后續(xù)轉(zhuǎn)基因毛狀根的檢測驗(yàn)證）連接，將連 接產(chǎn)物用凍融法轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834感受態(tài)細(xì)胞；挑取陽性克隆，用YEB液體培養(yǎng)基 擴(kuò)增至0D600 = 0. 5時(shí)，添加 AS (乙酰丁香酮），作為轉(zhuǎn)基因侵染菌液。
[0014] (3)針刺莖節(jié)法誘導(dǎo)硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根：用接種針蘸上述活化的具有侵染特性 的轉(zhuǎn)基因菌液，用針尖穿刺紫草無菌苗的莖節(jié)處2-3次；將侵染的無菌苗轉(zhuǎn)移到MS固體培 養(yǎng)基上于26°C黑暗培養(yǎng)。10-15天左右即可發(fā)現(xiàn)侵染部位出現(xiàn)白色突起，2天后在侵染部位 的白色突起長出絨毛狀根系，然后長出一條或多條毛狀根。
[0015] (4)硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根的培養(yǎng)：剪取長度約1cm的毛狀根，轉(zhuǎn)入MS+500mg/L頭 孢霉素的固體除菌培養(yǎng)基，再過一星期轉(zhuǎn)入MS+250mg/L頭孢霉素除菌培養(yǎng)基，直至除去殘 留的發(fā)根農(nóng)桿菌；將徹底除菌的毛狀根轉(zhuǎn)入B5固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)；將固體擴(kuò)大培養(yǎng)的毛 狀根轉(zhuǎn)入B5液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0016] (5)轉(zhuǎn)基因毛狀根分子鑒定：分為分子鑒定和熒光鑒定2個(gè)部分。取一定數(shù)量毛 狀根，PCR方法檢測農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中RolC基因，判斷是否為毛狀根，再檢測綠色熒光蛋白， 驗(yàn)證是否是硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根。
[0017] (6)紫草寧合成及測定：將鑒定的轉(zhuǎn)基因紫草毛狀根轉(zhuǎn)入M9液體培養(yǎng)基，置于 26°C黑暗培養(yǎng)，一周后紫草寧含量即可達(dá)到很高濃度；用石油醚浸泡紫草毛狀根及含有紫 草寧的M9液體，提取紫草寧，紫外分光光度計(jì)測定紫草寧含量，以相同生長條件下的野生 型紫草毛狀根（只用不含外源基因的ATCC15834侵染而獲得的硬紫草毛狀根）為對(duì)照，計(jì) 算轉(zhuǎn)基因毛狀根中紫草寧含量變化。
[0018] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果是：
[0019] 如前所述，野生紫草資源的日益匱乏及缺乏真正高效的人工合成紫草寧的培養(yǎng)體 系，已經(jīng)成為紫草寧藥用研究及商業(yè)化大量應(yīng)用的一個(gè)制約因素。至今未見通過誘導(dǎo)出轉(zhuǎn) 入LeEIL-Ι基因的毛狀根，并藉此提高紫草寧合成產(chǎn)量的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明首次將一 個(gè)紫草EIN3/EIL1家族蛋白的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因 LeEIL-Ι轉(zhuǎn)入植物表達(dá)載體，將該載體轉(zhuǎn) 入發(fā)根農(nóng)桿菌后再轉(zhuǎn)入紫草無菌苗，誘導(dǎo)出紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根；獲得的硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀 根中紫草寧含量較野生型紫草毛狀根大大提高。該方法可克服紫草愈傷細(xì)胞誘導(dǎo)、培養(yǎng)困 難，細(xì)胞易于老化褐化、紫草寧產(chǎn)量不高、產(chǎn)量不穩(wěn)定、夏季難產(chǎn)或不產(chǎn)紫草寧等諸多問題； 解決了利用愈傷細(xì)胞進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化存在的周期長，轉(zhuǎn)化效率偏低等問題，轉(zhuǎn)基因毛狀根誘 導(dǎo)和繁殖不受外界環(huán)境、季節(jié)和紫草花性等因素制約，大大提高紫草轉(zhuǎn)基因效率；轉(zhuǎn)入的 LeEIL-Ι基因有助于紫草乙烯信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制及藥用天然產(chǎn)物合成的分子調(diào)控機(jī)制研究，對(duì) 紫草功能基因鑒定和研究及分子育種具有重要指導(dǎo)意義，對(duì)其他轉(zhuǎn)基因困難的木本植物提 供了可靠的借鑒方法；獲得的轉(zhuǎn)基因毛狀根紫草寧高產(chǎn)株系具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景和商 業(yè)價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1針刺莖節(jié)法誘導(dǎo)出的轉(zhuǎn)LeEIL-Ι基因的硬紫草毛狀根
[0021] 圖2轉(zhuǎn)基因毛狀根在B5固體培養(yǎng)基培養(yǎng)
[0022] 圖3轉(zhuǎn)基因毛狀根在B5液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)
[0023] 圖4轉(zhuǎn)LeEIL-Ι基因硬紫草毛狀根RolC基因檢測
[0024] 圖5轉(zhuǎn)LeEIL-Ι基因硬紫草毛狀根熒光檢測
[0025] 圖6轉(zhuǎn)基因毛狀根在M9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)
[0026] 圖7轉(zhuǎn)基因毛狀根紫草寧及其衍生物含量測定及比較

【具體實(shí)施方式】
[0027] 實(shí)施例1、轉(zhuǎn)硬紫草LeEIL-Ι基因毛狀根的誘導(dǎo)
[0028] (1)硬紫草無菌苗培養(yǎng)：選取飽滿的硬紫草種子，無菌水清洗后置于4°C環(huán)境中黑 暗培養(yǎng)1-2個(gè)月，直至種子發(fā)芽；挑取剛發(fā)芽的種子，清水洗干凈；用6 %的次氯酸鈉浸泡 5min，再用無菌水洗幾次；置于MS基本培養(yǎng)基，26°C _28°C光照培養(yǎng)，獲得一定數(shù)量的紫草 無菌苗。一個(gè)月后，當(dāng)紫草無菌苗生長到8-lOcm后，作為誘導(dǎo)毛狀根的外植體。
[0029] (2)轉(zhuǎn)基因侵染菌液制備：將市售的pBI121載體中的GUS基因片段用增強(qiáng)型綠色 熒光蛋白eGFP基因片段代替，改造成便于轉(zhuǎn)基因檢測的植物真核表達(dá)載體pBI121-eGFP ; 根據(jù) GenBank 公布的紫草 LeEIL-1 序列（FJ890314)設(shè)計(jì)引物 LeEIL-l-〇E-F :5' -CTAGTCT AGAATGATGATGTTCGAGGAGATGGGGT-3; ；LeEIL-1-〇E-R ： 5; -CTAGTCTAGAAAACCAGATGGATTCGT CCTGCTTT-3'，高保真酶擴(kuò)增目的片段；將獲得的目的片段切膠回收，并與pBI121-eGFP載 體連接，構(gòu)建pBI 121-LeEIL-l-eGFP質(zhì)粒；將pBI 121-LeEIL-l-eGFP質(zhì)粒用凍融法轉(zhuǎn)化發(fā)根 農(nóng)桿菌ATCC15834感受態(tài)細(xì)胞；挑取陽性克隆，轉(zhuǎn)入YEB液體培養(yǎng)基，在26-28°C，180rpm的 搖床中擴(kuò)增至0D600 = 0. 5時(shí)，添加200 μ L/L的AS，作為轉(zhuǎn)基因侵染菌液。
[0030] (3)針刺莖節(jié)法誘導(dǎo)硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根：用接種針蘸上述活化的具有侵染特性 的轉(zhuǎn)基因菌液，用針尖穿刺紫草無菌苗的莖節(jié)處，針尖每浸蘸菌液一次，刺莖節(jié)處一下，每 株共穿刺2-3次；將侵染的無菌苗轉(zhuǎn)移到MS固體培養(yǎng)基上于26°C黑暗培養(yǎng)。10-15天左右 即可發(fā)現(xiàn)侵染部位出現(xiàn)白色突起，2天后在侵染部位的白色突起長出絨毛狀根系，然后長出 一條或多條毛狀根（圖1);以不含外源基因的野生型ATCC15834菌液按照上述相同方法， 誘導(dǎo)出紫草野生型毛狀根，作為對(duì)照材料。
[0031] 實(shí)施例2、轉(zhuǎn)硬紫草LeEIL-Ι基因毛狀根的培養(yǎng)
[0032] (1)毛狀根除菌培養(yǎng)：誘導(dǎo)出來的毛狀根經(jīng)過一星期的生長，剪取長度約1cm的毛 狀根，轉(zhuǎn)入MS+500mg/L頭孢霉素的固體除菌培養(yǎng)基，再過一星期轉(zhuǎn)入MS+250mg/L頭孢霉 素，直至除去殘留的發(fā)根農(nóng)桿菌；將徹底除菌的毛狀根轉(zhuǎn)入B5固體培養(yǎng)基培養(yǎng)（圖2);
[0033] (2)毛狀根擴(kuò)大培養(yǎng)：將固體擴(kuò)大培養(yǎng)的毛狀根轉(zhuǎn)入B5液體培養(yǎng)基，lOOrpm的搖 床中光照擴(kuò)大培養(yǎng)（圖3)。
[0034] 實(shí)施例3、轉(zhuǎn)硬紫草LeEIL-Ι基因毛狀根的鑒定
[0035] 分為分子檢測和熒光檢測2個(gè)部分。取一定數(shù)量毛狀根，CTAB法提取 毛狀根 DNA 為模板，設(shè)計(jì)引物 rolc-F:5' -ACAAGCCACTTCTGTTTCCC-3' ；rolC-R: 5, -CAGCGACTGCAACCAGTTTA-3'，用PCR方法擴(kuò)增，以硬紫草基因組DNA為對(duì)照，擴(kuò)增產(chǎn)物測 序比對(duì)，檢測轉(zhuǎn)基因毛狀根中農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中RolC基因存在與否，隨機(jī)選取的3個(gè)擴(kuò)大培 養(yǎng)硬紫草毛狀根株系，均檢測到RolC基因的存在（圖4)，說明獲得的均為毛狀根；同時(shí)上 述株系中長度約2-3_的毛狀根，制作成切片，用激光共聚焦顯微鏡檢測熒光，結(jié)果顯示均 檢測到熒光（圖5)，表明所擴(kuò)大培養(yǎng)的紫草毛狀根均為轉(zhuǎn)基因毛狀根。
[0036] 實(shí)施例4、轉(zhuǎn)硬紫草LeEIL-Ι基因毛狀根紫草寧含量測定
[0037] (1)將驗(yàn)證為轉(zhuǎn)入目的基因的轉(zhuǎn)基因硬紫草毛狀根及野生型毛狀根轉(zhuǎn)入M9液體 培養(yǎng)基，置于26°C、100rpm的搖床中黑暗培養(yǎng)，一周后紫草寧含量即可達(dá)到很高濃度（圖 6)；
[0038] (2)用石油醚浸泡紫草毛狀根及含有紫草寧的M9液體，提取紫草寧，紫外分光光 度計(jì)測定紫草寧含量，以野生型紫草毛狀根為對(duì)照，計(jì)算轉(zhuǎn)基因毛狀根中紫草寧含量變化 (圖7)。紫草寧含量總量包括紫草細(xì)胞或毛狀根和分泌到M9培養(yǎng)基中的紫草寧含量總和。 具體方法如下：稱取在M9培養(yǎng)體系中的毛狀根，并取含有分泌的紫草寧的M9培養(yǎng)基，用石 油醚浸泡，反復(fù)提取紫草寧，直到提取液無色，合并提取液，紫外分光光度計(jì)測定0D520的 吸光值，由下列方程得到紫草寧含量：紫草寧含量（mg/gFW) = 41. 66X0D520X稀釋倍數(shù)。
[0039] (3)紫草寧含量測定顯示，所得到的這一個(gè)轉(zhuǎn)LeEIL-1基因的硬紫草毛狀根 在M9液體培養(yǎng)基中一周后紫草寧含量比相同生長條件下的野生型毛狀根中的含量提 高2. 81倍，而且該株系具有生長速度快、繁殖容易的特點(diǎn)，適于商業(yè)化生產(chǎn)所用，命名為 LeEIL-l-line-001〇
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【權(quán)利要求】
1. 一個(gè)高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物（紫草寧及其衍生物）的硬紫草轉(zhuǎn)LeEIL-1基因毛狀根株 系。
2. 權(quán)利要求1中所述的硬紫草轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)株系的商業(yè)化應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01H5/06GK104195167SQ201410366238
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】楊永華, 戚金亮, 方榮俊, 趙胡, 趙華, 劉靜, 朱煜, 吳鳳瑤, 王小明, 陸桂華, 楊榮武 申請人:南京大學(xué)