一種白及種子液體懸浮培養(yǎng)原球莖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種白及種子液體懸浮培養(yǎng)原球莖的方法，該方法包括以下步驟：（1）白及種子消毒；（2）懸浮發(fā)芽培養(yǎng)：在無菌條件下，用剪刀剪開白及蒴果外殼，將種子抖落在液體發(fā)芽培養(yǎng)基中，進(jìn)行震蕩培養(yǎng)30天；（3）懸浮壯苗培養(yǎng)：將經(jīng)步驟（2）懸浮發(fā)芽培養(yǎng)后得到的白及原球莖轉(zhuǎn)接于液體壯苗培養(yǎng)基中，進(jìn)行震蕩培養(yǎng)30-45天。本發(fā)明利用液體懸浮培養(yǎng)，能有效獲得白及原球莖，操作簡單、成本低、且能有效縮短生產(chǎn)周期。
【專利說明】一種白及種子液體懸淳培養(yǎng)原球蓮的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種白及種子育苗技術(shù)，具體涉及一種采用液體懸浮培養(yǎng)方法對白及 進(jìn)行原球莖培養(yǎng)的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 白及siriaia (Thunb. ) Rchb. f.)為蘭科白及屬多年生宿根草本植 物，肉質(zhì)肥厚的假鱗莖供藥用；總狀花序具數(shù)朵花，花紫色或淡紅色，花型較大，直徑約5厘 米，形態(tài)優(yōu)美，具有很高的藥用價值和觀賞價值。
[0003] 白及在自然狀態(tài)下主要靠分株繁殖，繁殖系數(shù)較低；雖然能產(chǎn)生大量的種子，但是 種子不易發(fā)芽。由于白及繁殖率低，無法適應(yīng)規(guī)?；N植的需求。目前針對白及繁殖的研 究主要集中于種子無菌輔助育苗和組織培養(yǎng)，該技術(shù)可以在短時間內(nèi)得到大量的實生苗， 是白及生產(chǎn)上快速有效的途徑。
[0004] 現(xiàn)有對白及組培均選用固體培養(yǎng)基，接種時將白及種子輕輕抖落在培養(yǎng)基的表 面，但是由于白及種子呈粉末狀，非常細(xì)小，操作時難以保證每個種子都能充分接觸培養(yǎng)基 或者種胚基部接觸到培養(yǎng)基，造成生長條件差異，導(dǎo)致出苗不整齊，且轉(zhuǎn)接操作煩瑣、工作 量巨大。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種操作方便、成本低的 白及種子培養(yǎng)原球莖的方法。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種白及種子液體懸浮培養(yǎng)原球莖的方法，該 方法包括以下步驟： (1) 白及種子消毒； (2) 懸浮發(fā)芽培養(yǎng)：在無菌條件下，用剪刀剪開白及蒴果外殼，將種子抖落在液體發(fā)芽 培養(yǎng)基中，進(jìn)行震蕩培養(yǎng)；液體發(fā)芽培養(yǎng)基采用1/2MS培養(yǎng)基(即采用MS培養(yǎng)基中物質(zhì)的大 量元素濃度減半，其它試劑濃度同MS培養(yǎng)基）;液體發(fā)芽培養(yǎng)基中含有NAA 0. 5-1. 0mg*L' 蔗糖;培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24-26°C，培養(yǎng)時間為30天； (3) 懸浮壯苗培養(yǎng)：將經(jīng)步驟（2)懸浮發(fā)芽培養(yǎng)后得到的白及原球莖轉(zhuǎn)接于液體壯苗 培養(yǎng)基中，進(jìn)行震蕩培養(yǎng)；所述液體壯苗培養(yǎng)基采用1/2MS培養(yǎng)基；液體壯苗培養(yǎng)基中含有 NAA 1.0mg*L'6-BA l.Omg·!/1、鹿糖30g·]^;培養(yǎng)條件為光照培養(yǎng)，光照時間為16h/d，光 照強(qiáng)度為2000-25001x，培養(yǎng)溫度為24-26°C，培養(yǎng)時間為30-45天。
[0007] 其中，步驟（2)中液體發(fā)芽培養(yǎng)基中NAA的優(yōu)選濃度為0. Smg·!/1。步驟（3)中培 養(yǎng)時間優(yōu)選30天。
[0008] 步驟（1)中對白及種子消毒采用以下方法：將白及蒴果表面清洗干凈，用洗衣粉 洗滌5-10min，置流水沖洗干凈，再用75%酒精表面消毒5min，無菌水沖洗干凈，然后用10% 次氯酸鈉溶液浸泡消毒白及蒴果，無菌水沖洗5-7遍。
[0009] 并可將步驟（3 )懸浮壯苗培養(yǎng)后得到的白及原球莖轉(zhuǎn)入設(shè)施育苗設(shè)備中進(jìn)行煉苗 或轉(zhuǎn)接于固體培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。
[0010] 本發(fā)明白及種子液體懸浮培養(yǎng)原球莖的具體步驟如下： 1.白及種子消毒：將白及蒴果表面洗干凈，用洗衣粉洗滌5~10min，置流水沖洗干凈， 再用75%酒精表面消毒5min，無菌水沖洗干凈，然后用10%次氯酸鈉溶液浸泡消毒白及蒴 果，無菌水沖洗5~7遍。
[0011] 2.培養(yǎng)基配制：配制1/2MS +0.51^·!^ NAA+SOg·!/1蔗糖的白及液體發(fā)芽培養(yǎng)基 和1/2MS+1. On^PNAA+l. Orng·!/1 e-BA+SOg·!/1蔗糖的白及液體壯苗培養(yǎng)基，于高溫條件 下滅菌冷卻后待用。
[0012] 3.接種：在無菌條件下，用剪刀剪開白及蒴果外殼，將種子抖落在1/2MS +0.51^^171 NAA +30g·!^蔗糖的白及液體發(fā)芽培基中。
[0013] 4.懸浮發(fā)芽培養(yǎng)：將接種好的白及液體發(fā)芽培養(yǎng)基置于搖床中，震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng) 條件為黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 ± 1°C，培養(yǎng)30天。
[0014] 5.懸浮壯苗培養(yǎng)：將懸浮培養(yǎng)發(fā)芽30天后的白及原球莖轉(zhuǎn)接于 l/^MS+l.Omg^I^NAA + LOrng·!/1 e-BA+SOg·!/1蔗糖的白及液體壯苗培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗培 養(yǎng)，培養(yǎng)條件為為培養(yǎng)溫度為（25±1) °C，光照強(qiáng)度200(Γ25001χ，光照時間16MCT1。震蕩 培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為30-45天。
[0015] 6.白及種子懸浮壯苗培養(yǎng)結(jié)束，可以轉(zhuǎn)入設(shè)施育苗設(shè)備中進(jìn)行煉苗或轉(zhuǎn)接于固 體培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，為白及苗下地作準(zhǔn)備。
[0016] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點：本發(fā)明采用液體懸浮培養(yǎng)代替原固體培養(yǎng)， 能有效保證每個種子都充分接觸培養(yǎng)基或種胚基部接觸到培養(yǎng)基，出苗整齊，且轉(zhuǎn)接操作 簡單。本發(fā)明利用液體懸浮培養(yǎng)，能有效獲得白及原球莖，操作簡單、成本低、且能有效縮短 生產(chǎn)周期。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為不同光照條件下白及的發(fā)芽情況； 圖2為不同培養(yǎng)基對白及發(fā)芽的影響。
[0018] 圖1中，a為黑暗條件下白及的發(fā)芽情況，b為光照條件下白及的發(fā)芽情況； 圖2中，1為采用培養(yǎng)基配方1對白及發(fā)芽的影響，2為采用培養(yǎng)基配方2對白及發(fā)芽 的影響，3為采用培養(yǎng)基配方3對白及發(fā)芽的影響，4為采用培養(yǎng)基配方4對白及發(fā)芽的影 響。

【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0020] 1材料和方法 1.1材料 1. 1. 1實驗用材料為白及siriaia (Thunb. )Rchb. f.)的當(dāng)年成熟蒴果。 (由安徽省蕪湖市安徽中醫(yī)藥專科學(xué)校李林華老師提供，果實采集于安徽蕪湖市南陵縣丫 山） 1.1.2試劑、儀器及設(shè)備6-節(jié)氨基腺噪呤（6-Benzylaminopurine，簡稱6-BA)購自 上海萬疆生物技術(shù)有限公司、1_萘乙酸（l_Naphthaleneacetic acid,簡稱NAA)購自江蘇 強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；ESCO公司OptiMair超凈工作臺；上海申安醫(yī)療器械廠高壓 滅菌鍋；電子天平由上海海康電子儀器廠提供，解剖鏡為奧林巴斯CX41-12C02雙目顯微鏡 CX41上海澤仕光電科技有限公司；手術(shù)刀、濾紙等接種工具均購自南京壽德實驗器材有限 公司。其它化學(xué)試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0021] 1.2 方法 1.2.1材料處理及接種白芨蒴果表面清洗干凈，洗衣粉浸泡洗滌5~10min，流水沖 洗干凈，75%酒精浸沒消毒5min，無菌水沖洗干凈，10%次氯酸鈉溶液浸泡消毒白及蒴果，無 菌水沖洗5~7遍。無菌條件下，無菌剪刀剪開白及蒴果外殼，將種子均勻抖落至液體培養(yǎng)基 中。
[0022] 1.2.2液體培養(yǎng)基的配制以1/2MS液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加30g · Γ1蔗糖，調(diào) 節(jié)pH至5. 8，激素 NAA和6-BA設(shè)置3個不同的濃度梯度（0、0. 5mg · I71、1. Omg · I71)。培養(yǎng) 基配方見表1。
[0023] 表1白及發(fā)芽及原球莖生成培養(yǎng)基配置表

【權(quán)利要求】
1. 一種白及種子液體懸浮培養(yǎng)原球莖的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 白及種子消毒； (2) 懸浮發(fā)芽培養(yǎng)：在無菌條件下，用剪刀剪開白及蒴果外殼，將種子抖落在液體發(fā)芽 培養(yǎng)基中，進(jìn)行震蕩培養(yǎng)；所述液體發(fā)芽培養(yǎng)基采用1/2MS培養(yǎng)基；所述液體發(fā)芽培養(yǎng)基中 含有NAA 0. 5-1. Omg/L、蔗糖30g/L ;所述培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24-26°C，培養(yǎng)時間 為30天； (3) 懸浮壯苗培養(yǎng)：將經(jīng)步驟（2)懸浮發(fā)芽培養(yǎng)后得到的白及原球莖轉(zhuǎn)接于液體壯苗 培養(yǎng)基中，進(jìn)行震蕩培養(yǎng)；所述液體壯苗培養(yǎng)基采用1/2MS培養(yǎng)基；所述液體壯苗培養(yǎng)基中 含有NAA 1. 0mg/L、6-BA 1. Omg/L、蔗糖30g/L ;所述培養(yǎng)條件為光照培養(yǎng)，光照時間為16h/ d，光照強(qiáng)度為2000-25001x，培養(yǎng)溫度為24-26°C，培養(yǎng)時間為30-45天。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2)中液體發(fā)芽培養(yǎng)基中NAA的 含量為0· 5mg/L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（3)中培養(yǎng)時間為30天。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中對白及種子消毒 采用以下方法：將白及蒴果表面清洗干凈，用洗衣粉洗滌5-10min，置流水沖洗干凈，再用 75%酒精表面消毒5min，無菌水沖洗干凈，然后用10%次氯酸鈉溶液浸泡消毒白及蒴果，無 菌水沖洗5-7遍。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述的方法，其特征在于，所述步驟（3)懸浮壯苗培養(yǎng)后得 到的白及原球莖轉(zhuǎn)入設(shè)施育苗設(shè)備中進(jìn)行煉苗或轉(zhuǎn)接于固體培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。
【文檔編號】A01H4/00GK104137778SQ201410368387
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月30日
【發(fā)明者】周義峰, 湯興利, 劉彥紅, 吳亞萍, 王玫 申請人:中國科學(xué)院南京分院東臺灘涂研究院, 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 江蘇琵琶景觀有限公司