一種受病原誘導(dǎo)的水稻啟動(dòng)子p71z2及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種受病原誘導(dǎo)的水稻啟動(dòng)子P71Z2及其應(yīng)用，屬于水稻生物育種領(lǐng)域。本發(fā)明的目的是提供一種從水稻中分離到的能夠響應(yīng)白葉枯病菌侵害，可以作為病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子使用的DNA序列片段，該DNA序列片段是水稻P450單加氧化酶基因Oscyp71Z2（NCBI登錄號(hào)：Os07g0217600）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，其特征是它具有第1位到第1098位的啟動(dòng)子區(qū)核苷酸序列。本發(fā)明可以作為病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子使用，或用于其它轉(zhuǎn)基因植物的相關(guān)調(diào)控序列，培育抗病植物中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種受病原誘導(dǎo)的水稻啟動(dòng)子P71Z2及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種受病原誘導(dǎo)的水稻啟動(dòng)子P71Z2及其應(yīng)用，屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及到一個(gè)水稻病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P71Z2的克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用分析。

【背景技術(shù)】
[0002]水稻在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)受到各種病原(包括稻瘟病菌、白葉枯病菌、細(xì)菌條斑病菌以及水稻矮縮病毒等)的侵害。在與病原長(zhǎng)期相互作用的過(guò)程中，水稻已經(jīng)進(jìn)化成多種復(fù)雜而有效的抗病機(jī)制來(lái)抵抗病原的侵染?？共』虻目寺『蛻?yīng)用為水稻病害的防治提供了一個(gè)經(jīng)濟(jì)有效和環(huán)境友好的方法。
[0003]目前，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)把抗病基因轉(zhuǎn)入到感病且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻栽培品種是利用抗性資源改良水稻病害抗性的重要途徑。盡管大批的抗病基因被克隆以及應(yīng)用，但是由于應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因載體的啟動(dòng)子多數(shù)屬于組成型啟動(dòng)子。這不僅造成了植物體的負(fù)擔(dān)，使植物在不需要發(fā)生抗病反應(yīng)時(shí)表達(dá)額外的蛋白，造成了浪費(fèi)，而且嚴(yán)重地還造成了植物體生理和代謝的紊亂，致其產(chǎn)生變異或死亡，使得轉(zhuǎn)基因水稻一生中需要消耗掉大量的能量。這是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)防治水稻病害的最明顯的一個(gè)缺陷。為了解決這個(gè)問(wèn)題，申請(qǐng)者試圖利用受病原菌誘導(dǎo)啟動(dòng)子調(diào)控目的基因表達(dá)。
[0004]啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因上游能與RNA聚合酶結(jié)合并形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體，且對(duì)基因的表達(dá)起調(diào)控作用的一段DNA序列。一個(gè)典型的啟動(dòng)子包括CAAT-box和ΤΑΤΑ-box等核心作用元件。TATA框，又稱(chēng)Hogness框，其一致序列為:TATAAAA或TATATAT，而在它的兩側(cè)由富含G和C堿基對(duì)的序列組成，一般都位于_35bp附近。TATA框決定了轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的選擇，它是RNA聚合酶和DNA鏈結(jié)合的部位。CAAT框，其一致序列為GGC (T) CAATCT。一般位于_75bp附近，該框的堿基一旦缺失或突變，將會(huì)造成轉(zhuǎn)錄效率的急劇降低，CAAT框可能控制著轉(zhuǎn)錄起始的頻率。增強(qiáng)子(enhancer)，又稱(chēng)為遠(yuǎn)上游序列，一般都在-1OObp以上，它對(duì)依賴(lài)和不依賴(lài)TATA框的轉(zhuǎn)錄均有增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用。另外，不同的啟動(dòng)子上還有其他不同的順式(cis)調(diào)控元件，它們是反式(trans)調(diào)控因子或轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。不同的反式調(diào)控因子/轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白特異性的與順式調(diào)控元件結(jié)合，對(duì)基因的表達(dá)時(shí)間，空間或表達(dá)量進(jìn)行特異性的調(diào)控。按照功能及作用方式可大致分為組成型表達(dá)啟動(dòng)子、組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子三大類(lèi)。正如前文所述，組成型表達(dá)啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因作物中驅(qū)使目的基因持續(xù)大量表達(dá)，浪費(fèi)作物能量并帶來(lái)?yè)p失，而組織特異性啟動(dòng)子使目的基因在某一組織中特定地表達(dá)，可以較好地解決這一方面的問(wèn)題。目前，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是公認(rèn)的有較好應(yīng)用前景的啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子對(duì)外界的某些物質(zhì)，如病原物，化學(xué)物質(zhì)或逆境作出反應(yīng)，啟動(dòng)植物體內(nèi)相應(yīng)的基因表達(dá)。因此，利用水稻來(lái)源的病原物誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗性基因的表達(dá)，是改良水稻抗性的最佳選擇之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 技術(shù)問(wèn)題
[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一個(gè)來(lái)自于水稻受到病原菌誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子P71Z2。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的克隆和功能鑒定的方法。
[0008]本發(fā)明的又一目的是提供病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的目的是從水稻中克隆抗病相關(guān)基因0scyp71Z2的啟動(dòng)子P71Z2DNA序列，并利用轉(zhuǎn)基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，同時(shí)分析該基因在水稻中的組織表達(dá)模式，為利用抗性基因改良水稻病害抗性提供了資源。
[0010]技術(shù)方案
[0011]本發(fā)明涉及一種受病原誘導(dǎo)的水稻啟動(dòng)子P71Z2，其特征在于:該啟動(dòng)子來(lái)自于粳稻品種日本晴基因組中0scyp71Z2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，是一段位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1098bp 的 DNA，序列如 SEQ.1D.N0.1。
[0012]所述水稻啟動(dòng)子P71Z2通過(guò)調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)可以在水稻細(xì)菌病害抗性中得到應(yīng)用。
[0013]采用PCR(Polymerase chain react1n)技術(shù)可以從基因組中擴(kuò)增得到本發(fā)明的啟動(dòng)子P71Z2以及任何一段DNA或與其同源的一段DNA。將克隆到的DNA片段構(gòu)建攜帶有報(bào)告基因gus的遺傳轉(zhuǎn)化載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法，獲得轉(zhuǎn)基因水稻。利用實(shí)驗(yàn)室人工接種方法對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行白葉枯病接菌，通過(guò)組織化學(xué)染色法和GUS活性檢測(cè)從而鑒定啟動(dòng)子P71Z2響應(yīng)病原的能力。
[0014]有益效果
[0015]本研究所提供的水稻病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子P71Z2的克隆及其應(yīng)用，具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0016]通過(guò)本發(fā)明獲得了水稻病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P71Z2。
[0017]將克隆的啟動(dòng)子P71Z2連接到雙元載體調(diào)控抗性基因表達(dá)，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入水稻，可以使轉(zhuǎn)基因水稻在受病原菌侵染后誘導(dǎo)目標(biāo)基因表達(dá)，從而避免植物因過(guò)量表達(dá)目標(biāo)基因?qū)ψ陨碓斐傻膿p傷。這也彌補(bǔ)了傳統(tǒng)組成型啟動(dòng)子因始終強(qiáng)啟動(dòng)目的基因表達(dá)造成生長(zhǎng)發(fā)育受阻等一系列致命缺陷。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1P71Z2啟動(dòng)子克隆。1，啟動(dòng)子P71Z2PCR擴(kuò)增；3，啟動(dòng)子P71Z2表達(dá)載體pBI121/Pro 雙酶切驗(yàn)證；2 和 5，DNAmarkerDL2000 ;4，DNAMarker λ -Hindlll。
[0019]圖2遺傳轉(zhuǎn)化載體圖譜。LB和RB分別是T-DNA左右邊界；N0S，胭脂堿合成酶編碼基因終止子；N0SP，胭脂堿合成酶編碼基因啟動(dòng)子；NPTII，是卡那霉素抗性基因(標(biāo)記基因)；Pro,啟動(dòng)子Ρ71Ζ2 ;gus,是β-glucuronidase gene ( β -葡萄糖醒酸酶,報(bào)告基因)。
[0020]圖3P71Z2啟動(dòng)子受白葉枯病菌誘導(dǎo)。R是抗白葉枯病轉(zhuǎn)hrfI基因水稻株系NJHl2 ；S是感病野生型水稻R109。
[0021]圖40scyp71Z2基因表達(dá)模式。(A)葉片；(C)莖節(jié)；(D)穎殼；(G)主根；(F)外稃；(B)和(E)為葉片和莖節(jié)的橫切面。
[0022]圖5轉(zhuǎn)P71Z2啟動(dòng)子水稻的⑶S活性受白葉枯病菌誘導(dǎo)。

【具體實(shí)施方式】
[0023]下面實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
[0024](一 )實(shí)驗(yàn)方法
[0025]1.1載體構(gòu)建
[0026]根據(jù)啟動(dòng)子在線分析軟件PROSCAN (http: //bimas.dcrt.nih.gov/molb1/proscan)預(yù)測(cè)的0scyp71Z2基因啟動(dòng)子P71Z2序列如SEQ.1D.N0.1，利用引物設(shè)計(jì)軟件 01igo6 設(shè)計(jì)啟動(dòng)子 P71Z2 上游引物 Up:cccaagcttGTACAAGGGCTGACAGATGGG,上游引物加 HindIII 酶切位點(diǎn)；下游引物 Down:cgcggatccGCCCGTAGGATCGATGTGCTGTA，下游引物加BamHI酶切位點(diǎn)。用HS高保真酶從模式粳稻品種日本晴基因組中擴(kuò)增0scyp71Z2編碼區(qū)5，端1098bp序列片段。擴(kuò)增條件:95°C預(yù)變性4min ;95°C變性40s、58°C復(fù)性45s,72°C延伸45s，32個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。凝膠電泳顯示在1098bp處有特征條帶(圖1)。用PCR產(chǎn)物試劑盒純化DNA后，用HindIII和BamHI分別雙酶切純化的啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物 DNA、pBI121 雙兀表達(dá)載體(Shao M, WangJ, Dean RA, Lin Y, GaoX, Hu S.Express1nof a harpin-encoding gene in rice confers durable nonspecific resistance toMagnaporthe grisea.Plant B1technolJ, 2008, 6 (I): 73-81),凝膠電泳、分別切膠回收啟動(dòng)子DNA、pBI121大片段DNA，T4連接酶過(guò)夜連接構(gòu)建pBI121::P71Z2質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a (Shao Μ, WangJ, Dean RA, Lin Y, Gao X, HuS.Express1n of a harpin-encodinggene in rice confers durable nonspecific resistance to Magnaporthe grisea.Plant B1technolJ, 2008, 6 (I): 73-81)，挑取單克隆，接種含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C過(guò)夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒分別用HindIII和BamHI雙酶切驗(yàn)證，凝膠電泳結(jié)果顯示在1098bp處具有特征條帶(圖1)。隨后送2ml菌液到上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序，結(jié)果顯示沒(méi)有堿基錯(cuò)配，此時(shí)已成功構(gòu)建由啟動(dòng)子P71Z2驅(qū)動(dòng)gus基因表達(dá)的雙元表達(dá)載體pBI121/Pro(圖 2)。
[0027]1.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
[0028]1.2.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(I)受體菌DH5 α在LB平板上劃線，37°C活化培養(yǎng)；挑取一個(gè)單菌落接種到20ml的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；
[0029](2)按I %的接種量，吸取0.5ml將過(guò)夜培養(yǎng)的母液接種到50mlLB液體培養(yǎng)基，于37°C劇烈振蕩培養(yǎng)2-3h ；
[0030](3)在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)滅菌50ml離心管中，在冰上放置lOmin，使培養(yǎng)物冷卻至0°C ;(后面的5-9步驟必須在冰浴條件下完成。)
[0031](4)離心收集菌體細(xì)胞(4，000r/min,4°C, 1min)。倒出培養(yǎng)液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。
[0032](5)用5ml冰預(yù)冷的0.lmol/LCaCl2重新懸浮菌體沉淀,放置于冰上lOmin。
[0033](6)離心收集菌體(4，000r/min,4°C, 1min)。到出CaCl2，將管倒置Imin以使殘留的CaCl2流盡。
[0034] (7)用Iml冰預(yù)冷的0.lmol/LCaCl2重懸菌體。此時(shí),將懸浮液用eppendorf管分裝成小份，每管200μ I ;
[0035](8)用無(wú)菌吸頭在每管中加DNA(體積≤10 μ I, DNA ≤ 50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)或輕彈管壁以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min ；
[0036](9)將管放到42°C水浴中熱激90s，不要搖動(dòng)試管；
[0037](10)快速將試管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻l_2min ；
[0038](11)每管中加入800 μ ILB液體培養(yǎng)基后，放到37°C搖床振蕩培養(yǎng)45min ；
[0039](12)吸取適當(dāng)體積已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞加到含Km(20 μ g/ml)的LB固體平板上，用L玻棒輕輕地把細(xì)胞均勻地涂到瓊脂平板表面；
[0040](13)將平板置于室溫至液體被吸收；
[0041](14)倒置培養(yǎng)皿于37°C培養(yǎng)12_16h，待單菌落長(zhǎng)出后提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證。
[0042]1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(I)受體菌 EHAlO5 (Shao M, Wang J, Dean RA, Lin Y, GaoX, HuS.Express1n of a harpin-encoding gene in rice confers durable nonspecificresistance to Magnaporthe grisea.Plant B1technolJ, 2008, 6 (I): 73-81)在 YEB 平板上劃線，28 °C活化培養(yǎng)；
[0043](2)挑取一個(gè)單菌落接種到2ml的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；
[0044](3)在200ml的YEB培養(yǎng)基中稀釋?zhuān)?8 °C振蕩培養(yǎng)3_4h。
[0045](4)在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)滅菌50ml離心管中，3000rpm4°C離心10min，
去上清O
[0046](5)用 1ml 預(yù)冷的 ΤΕ(ρΗ7.5)洗滌。
[0047](6) 3000rpm4°C離心 1min,去上清。
[0048](7)用 20mlYEB 重懸。
[0049](8)按每管500 μ I分裝，液氮中冷凍，即為感受態(tài)細(xì)胞。
[0050](9)將感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中，加入0.5-1.0yg重組質(zhì)粒DNA，冰上放置5min。
[0051](10)置液氮中 5min。37°C保溫 5min。
[0052](11)用 ImlYEB 稀釋?zhuān)?28 °C 震搖 2_4h。
[0053](12)取200 μ I涂布于含有卡那霉素50mg/L+利福平50mg/L的YEB平板上，28°C培養(yǎng)過(guò)夜，待單菌落長(zhǎng)出后提取質(zhì)粒驗(yàn)證。
[0054]1.3水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代
[0055](I)將表面滅菌的含胚米粒接種到N6D2培養(yǎng)基上，28°C生化培箱培養(yǎng)2周左右，誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生；
[0056](2)將新長(zhǎng)出的愈傷組織從種子上剝下，轉(zhuǎn)入新的N6D2培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)。每?jī)芍芾^代一次，共繼代2次，取新鮮嫩黃的愈傷組織用于農(nóng)桿菌侵染。
[0057]1.4愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)
[0058](I)將愈傷組織浸入重懸的農(nóng)桿菌菌液中，搖勻后靜置30min ；
[0059](2)移出愈傷 ，用滅菌濾紙吸凈殘液，平鋪到盛有無(wú)菌濾紙的N6D2固體培養(yǎng)基表面，用2-3mlN6D2-AS培養(yǎng)液潤(rùn)濕愈傷，23°C生化培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)3d。
[0060]1.5獲得轉(zhuǎn)？7122啟動(dòng)子水稻
[0061](I)挑選l_2mm生長(zhǎng)良好、結(jié)構(gòu)致密的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)至MS1-CG培養(yǎng)基上在智能光照培養(yǎng)箱26°C，光強(qiáng)300001ux，預(yù)分化2周。
[0062](2)轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基MS2-CG上培養(yǎng)，在智能光照培養(yǎng)箱26°C，光強(qiáng)300001ux，分化。每2周繼代一次，直至得到抗性植株。
[0063](3)部分矮小叢生小苗轉(zhuǎn)至MStlG培養(yǎng)基上使其伸長(zhǎng)。
[0064](4)分化好的幼苗轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基1/2MSNG上。篩選、生根直至長(zhǎng)成完整植株。
[0065](5)將生長(zhǎng)完整的水稻植株移入滅菌土中，在智能光照培養(yǎng)箱26 °C，光強(qiáng)300001ux，光照14h，黑暗1h培養(yǎng)或移入溫室中培養(yǎng)生長(zhǎng)。
[0066]1.6病原菌接種
[0067]將抗白葉枯病轉(zhuǎn)hrf I基因水稻株系NJH12和感病野生型水稻R109(材料均為公知公用，見(jiàn) Li ffenqi, Shao Min, Zhong ffeigong, Yang Jie, Kazunori Okada, HisakazuYamane, Zhang Lei, Wang Guang, Wang Dong,Xiao Shanshan, Chang Shanshan,QianGuoliang, Liu Fengquan.Ectopic express1n of hrfI enhances bacterial resistancevia regulat1n of diterpene phytoalexins, silicon and reactive oxygen speciesburst in rice.PLoS ONE, 2012, 7(9):e43914.)以及轉(zhuǎn) P71Z2 啟動(dòng)子水稻盆栽于江蘇省南京市江蘇省農(nóng)科院糧食作物研究所網(wǎng)室，用白葉枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.0ryzae, Xoo)強(qiáng)致病菌株 PX099A(公知公用，見(jiàn) Li ffenqi, Shao Min, Zhong ffeigong, YangJie,Kazunori Okada, Hisakazu Yamane, Zhang Lei, Wang Guang, Wang Dong, XiaoShanshan, Chang Shanshan, Qian Guoliang, Liu Fengquan.Ectopic express1n of hrfIenhances bacterial resistance via regulat1n of diterpene phytoalexins, siliconand reactive oxygen species burst in rice.PLoS ONE, 2012, 7 (9):e43914.)分別在分蘗期和孕穗期接種，具體操作方法參考《植病研究方法》。
[0068]1.7⑶S組織化學(xué)染色
[0069](I)取2支1.5ml離心管，各加入0.5mllmol/LGUS染色液；
[0070](2)采取適量大小的轉(zhuǎn)基因和野生型水稻組織，分別放入上述離心管中；
[0071](3)37°〇浸泡過(guò)夜(或2-511);
[0072](4)倒掉染色液，加入75%乙醇脫色；換一次75%乙醇脫色；
[0073](5)觀察染色情況，拍照。如果有⑶S表達(dá)產(chǎn)物，則出現(xiàn)藍(lán)色出現(xiàn)藍(lán)色。
[0074]⑶S染色液配置:在450mlddH20中加入82mg鐵氰化鉀，105.6mg亞鐵氰化鉀，50ml lmol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.0)，加水至500ml，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0075]ImoI/LGUS染色液:用DMSO溶解lOOmgX-Gluc，再加入⑶S工作液，定容100ml，分裝成小管，置于_20°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0076]( 二)結(jié)果顯示
[0077]利用啟動(dòng)子分析軟件預(yù)測(cè)啟動(dòng)子P71Z2序列，并利用PCR技術(shù)從粳稻模式種日本晴中克隆該啟動(dòng)子(圖1)。成功構(gòu)建了用于病原菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P71Z2的雙元表達(dá)載體(圖2)，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得轉(zhuǎn)P71Z2啟動(dòng)子水稻。用白葉枯病菌強(qiáng)致病菌株P(guān)X099a接種抗白葉枯病轉(zhuǎn)hrf I基因水稻株系NJH12和感病野生型水稻R109后，該啟動(dòng)子P71Z2受白葉枯病菌誘導(dǎo)(圖3)。在轉(zhuǎn)P71Z2啟動(dòng)子水稻中，主要在根、節(jié)和葉片中檢測(cè)到GUS活性(圖4)。轉(zhuǎn)P71Z2啟動(dòng)子水稻受到白葉枯病菌PX099a侵染后，GUS蛋白活性顯著升高，約是未接菌的2-4倍(圖5)。這些結(jié)果表明，該啟動(dòng)子P71Z2能夠響應(yīng)白葉枯病菌的侵染。
[0078]附錄
[0079]1、LB培養(yǎng)基(培養(yǎng)大腸桿菌)
[0080]LB液體培養(yǎng)基成份:稱(chēng)取胰蛋白胨1g ;氯化鈉1g ;酵母粉5g ;加水500ml ;加熱溶解后定容至1000ml，調(diào)pH值至7.0-7.2，每瓶50ml分裝后高壓滅菌。LB固體培養(yǎng)基(LA)為每100ml液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂,加相應(yīng)抗生素(氨節(jié)霉素和潮霉素)后倒入平板備用。
[0081 ] 2、YEB培養(yǎng)基(培養(yǎng)農(nóng)桿菌)
[0082]液體培養(yǎng)基成份:稱(chēng)取牛肉浸膏5g ;鹿糖5g ;聚蛋白胨5g ;硫酸鎂2mmol/L ;酵母粉Ig ;加入500ml水，加熱溶解后定容至1000ml，調(diào)pH值至7.2，分裝后高壓滅菌。配制YEB固體培養(yǎng)基時(shí)每100ml液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂，加相應(yīng)抗生素后倒入平板。
[0083]3、轉(zhuǎn)基因用到的培養(yǎng)基配方
[0084]所涉及到的培養(yǎng)基:
[0085]

【權(quán)利要求】
1.一種受病原誘導(dǎo)的水稻啟動(dòng)子P71Z2，其特征在于:該啟動(dòng)子來(lái)自于粳稻品種日本晴基因組中基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，是一段位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1098 bp的DNA，序列如 SEQ.1D.N0.1。
2.權(quán)利要求1所述一種受病原誘導(dǎo)的水稻啟動(dòng)子P71Z2的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，水稻啟動(dòng)子P71Z2通過(guò)調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)在水稻細(xì)菌病害抗性 中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104131011SQ201410385644
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月6日
【發(fā)明者】李文奇, 楊杰, 王軍, 范方軍, 朱金燕, 仲維功 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院