一種藤蕹組織培養(yǎng)的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種藤蕹組織培養(yǎng)的方法，包括：A)獲得莖段至少帶有1個未萌發(fā)腋芽的藤蕹藤條；B)初代培養(yǎng)，初代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+2.0-3.0mg/L6-芐氨基腺嘌呤+0.1-0.3mg/L萘乙酸+30g/L碳源+6g/L的瓊脂粉，pH值為5.5-5.8；C)繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.5-1.5mg/L6-芐氨基腺嘌呤+0.3-0.7mg/L赤霉素+30g/L碳源+6g/L瓊脂粉，pH值為5.5-5.8；D)生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+0.3-0.6mg/L萘乙酸+15g/L碳源+6g/L瓊脂粉，pH值為5.5-5.8；E)將已生根的組培苗進行煉苗。
【專利說明】一種藤蕹組織培養(yǎng)的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，特別涉及一種藤蕹組織培養(yǎng)的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]蕹菜(Lpomoeaaquatica)屬旋花科(Convolvulaceae)甘薯屬(Lpomoea)的一年生或多年生草本植物，又名竹葉菜、空心菜、通心菜等，原產(chǎn)于我國熱帶多雨地區(qū)，具有生長速度快、產(chǎn)量高、采收期長、耐高溫高濕、抗性強、病蟲害較少等優(yōu)點，在我國長江流域及以南地區(qū)普遍栽培，為夏秋季重要葉類蔬菜之一，既有很高的營養(yǎng)價值，又有清熱解毒、利尿除濕、降低血糖等藥用價值。蕹菜分籽蕹和藤蕹兩種，藤蕹品質(zhì)較子蕹更佳，特別是長沙藤蕹，莖蔓生、節(jié)間短中空、莖桿粗壯、耐熱性好、質(zhì)地更為柔嫩，生長期更長，產(chǎn)量更高，更深得人們的喜愛。
[0003]近年來，雖然藤蕹作為春夏季主要葉菜類蔬菜，具有一定的種植規(guī)模，也取得了較好的經(jīng)濟效益，但由于藤蕹在長江流域不開花，難結(jié)籽，為無性繁殖的植物，目前生產(chǎn)上主要采取莖蔓扦插繁殖的方法繁育母苗。該方法有不少弊端，嚴重制約了生產(chǎn)的發(fā)展。主要體現(xiàn)在如下幾方面:第一，藤蕹無法獲得種子，傳統(tǒng)留種方式只能選擇老莖桿，立秋前重新進行扦插培育組織充實健壯的藤蔓做種蔓，再于初霜前挖取莖蔓貯存于地窖中留種，留種過程需保持10-15°C的低溫和75%的空氣濕度，翌年春氣溫達15°C才能取出種蔓育苗，采用此方法費時費力，對生長環(huán)境要求嚴格，種蔓成活率低于80 %。第二，扦插繁殖使藤蕹繁殖速度變慢，通常I根蕹條只能繁殖I株植株，且緩苗時間較長，田間管理較為復(fù)雜。第三，無性繁殖的作物都易受到一種或多種病原菌的周身侵染，病原菌的侵染不一定都會造成植株的死亡，很多病毒甚至可能不表現(xiàn)出任何癥狀，但病毒的存在在會減少作物產(chǎn)量和品質(zhì)。藤蕹在扦插繁殖過程中同樣易造成病毒的積累，導(dǎo)致種質(zhì)退化，嚴重影響藤蕹產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等性狀。通過調(diào)查，目前藤蕹的病害主要有輪斑病、褐斑病和花葉病毒病等病毒，人們在栽培過程中通常采用藥物控制，而忽略更新母苗，既污染環(huán)境，又埋下了食品安全隱患。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，提供一種藤蕹組織培養(yǎng)的方法，在短時間內(nèi)大量生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種苗的同時，還能減少病原危害，對推動湖南省這種傳統(tǒng)特色蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，解決蔬菜淡季供應(yīng)不足等問題有著十分重要的意義。
[0005]具體地，本發(fā)明提供了一種藤蕹組織培養(yǎng)的方法，所述方法包括如下步驟:
[0006]A)預(yù)處理:獲得藤蕹藤條，流水下沖洗干凈，將其剪成3_4cm的莖段，并保證所述莖段中至少帶有I個未萌發(fā)的腋芽，并對所述莖段表面消毒，例如可以用70%的酒精表面消毒，用無菌水沖洗多次，再用消毒溶液消毒，然后再次用無菌水沖洗多次；
[0007]B)初代培養(yǎng):接種于初代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述初代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+2.0-3.0mg/L的6-芐氨基腺嘌呤+0.1-0.3mg/L的萘乙酸+30g/L的碳源+6g/L的瓊脂粉，pH值范圍為5.5-5.8 ；
[0008]C)繼代培養(yǎng):選擇初代培養(yǎng)后苗高4cm以上，且具有3_5個腋芽的外植體，剪成帶有1-2個腋芽的莖段，接種于繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待外植體產(chǎn)生的叢生芽長有3-5個腋芽時，分離所述叢生芽，轉(zhuǎn)接至初代培養(yǎng)基中使腋芽伸長，苗高4cm以上后再轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，所述繼代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.5-1.5mg/L的6-芐氨基腺嘌呤+0.3-0.7mg/L的赤霉素+30g/L的碳源+6g/L的瓊脂粉，pH值范圍為5.5-5.8 ；
[0009]D)生根培養(yǎng):選擇苗高4cm以上，具有3_5個腋芽的外植體，接種于生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+0.3-0.6mg/L的萘乙酸+15g/L的碳源+6g/L的瓊脂粉，PH值范圍為5.5-5.8 ；
[0010]E)選擇根據(jù)所述步驟D)的苗高4cm以上，具有3_5個腋芽的組培苗，已生根且根系發(fā)達的組培苗進行煉苗。
[0011]經(jīng)實驗證實，與側(cè)藤藤條相比，組培時選擇主藤藤條做為實驗材料，其外植體更易耐受消毒液的侵蝕，生長勢更強，因此，在一個優(yōu)選的實施方式中，藤蕹藤條選自主藤藤條。
[0012]本文中所述的頂芽指生長在植株主干或側(cè)枝頂端的芽。腋芽通常是指著生在葉腋處的芽。在本發(fā)明中的腋芽除非特別指出，否則的話，腋芽可以包括頂芽。叢生芽指由植物器官和愈傷組織發(fā)育而來的群體叢生芽苗，在本發(fā)明中指藤蕹莖段基部愈傷化后由愈傷組織分化而形成的簇生狀不定芽。外植體是指從活植物體上切取下來進行組織培養(yǎng)的那部分組織或器官，具體為含腋芽的藤蕹莖段。
[0013]在一個具體的實施方式中，所述步驟A)中的消毒液為添加吐溫20的5%的次氯酸鈉溶液或添加吐溫20的0.1 %的升萊溶液,且每10mL消毒液中滴入50 μ L即I滴吐溫20，消毒時間為5-8分鐘。
[0014]在一個具體的實施方式中，所述初代培養(yǎng)基中還包括0.3-1.0g/L的核糖核酸酵母。添加核糖核酸酵母的有益效果主要為核糖核酸酵母能使藤蕹外植體莖桿黃化率顯著降低，腋芽生長速度相對較快，植株生長勢更為旺盛。
[0015]在一個優(yōu)選的實施方式中，所述初代培養(yǎng)基中還包括0.5g/L的核糖核酸酵母。
[0016]在一個具體的實施方式中，所述繼代培養(yǎng)基中還包括0.02g/L的特丁基對苯二酚、0.05g/L的硝酸銀、0.05g/L的Vc和0.lg/L的檸檬酸中的一種。從效果上來看，抗氧化劑特丁基對苯二酚能夠顯著降低莖桿基部愈傷組織的褐化率，并且效果優(yōu)于0.05g/L的硝酸銀、0.05g/L的Vc和0.1的g/L檸檬酸，因此優(yōu)選0.02g/L的特丁基對苯二酚。
[0017]在一個具體的實施方式中，所述繼代培養(yǎng)基中還包括0.1-0.5g/L的L-羥基脯氨酸、0.3-0.7g/L L-絲氨酸和0.1-0.5g/L的L-鹽酸半胱氨酸中的一種或多種。所述氨基酸的混合使用大大提高叢生芽繁殖系數(shù)，更有利于組培苗的繼代培養(yǎng)。
[0018]在一個具體的實施方式中，所述繼代培養(yǎng)基中還包括15%的藤蕹傷流液。15%的藤蕹傷流液對提高叢生芽的繁殖的效果與所述抗氧化劑和氨基酸的以最佳濃度的混合使用具有等同的效果。
[0019]在一個具體的實施方式中，所述繼代培養(yǎng)基中MS培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基，其中，所述改良的MS培養(yǎng)基具體為2475mg/L的硝酸銨、1900mg/L的硝酸鉀、440mg/L的二水氯化鈣、370mg/L的七水硫酸鎂、225mg/L的磷酸二氫鉀、70mg/L的氯化鉀、0.83mg/L的碘化鉀、6.2mg/L的硼酸、22.3mg/L的四水硫酸錳、8.6mg/L的七水硫酸鋅、0.25mg/L的二水鑰酸鈉、0.025mg/L的五水硫酸銅、0.025mg/L的六水氯化鈷、100mg/L的肌醇、0.5mg/L的煙酸、0.5mg/L的鹽酸卩比卩多醇、0.lmg/L的鹽酸硫胺素、2.0mg/L的甘氨酸、0.3mg/L的泛酸隹丐、139.0mg/L的七水硫酸亞鐵和186.5mg/L的乙二胺四乙酸二鈉。
[0020]在一個具體的實施方式中，在所述步驟B)中的培養(yǎng)的條件為:所述未萌發(fā)腋芽伸長至Icm之前的溫度為30.0±0.50C ;所述腋芽伸長至Icm之后的溫度為25.0±0.5°C，光照強度為20001x，光照時間為16小時/天；
[0021]和/或在所述步驟C)中的培養(yǎng)的條件均為:光照時的溫度為28.0±0.5°C，黑暗時的溫度為18.0±0.5°C，光照強度為30001x，光照時間為16小時/天；
[0022]和/或在所述步驟D)中的培養(yǎng)的條件均為:光照時的溫度為28.0±0.5°C，黑暗時的溫度為18.0±0.5°C，光照強度為30001x，光照時間為16小時/天；
[0023]和/或在所述步驟E)中，所述煉苗時溫度為25.0±0.5°C，光照強度為20001x，光照時間為16小時/天，濕度控制在85%以上。
[0024]在一個具體的實施方式中，所述步驟B)中的培養(yǎng)時間在7-10天；和/或所述步驟
C)中的繼代I次培養(yǎng)時間12-16天；和/或所述步驟D)中的培養(yǎng)時間8-12天；和/或所述步驟E)中的煉苗時間為10-14天。
[0025]在一個優(yōu)選的實施方式中，所述步驟B)中的培養(yǎng)時間在7天；和/或所述步驟C)中的繼代I次培養(yǎng)時間12天；和/或所述步驟D)中的培養(yǎng)時間8天；和/或所述步驟E)中的煉苗時間為10天。
[0026]在一個具體的實施方式中，所述碳源選自葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖和白糖中的一種或多種，優(yōu)選白糖。
[0027]在一個具體的實施方式中，還包括藤蕹脫毒培養(yǎng)的步驟i)，所述步驟i)在所述步驟B)之后且在步驟C)之前，取初代培養(yǎng)后腋芽伸長至3cm以上的外植體的頂芽，或直接獲取生長于室外的藤蕹主藤上頂芽，剝?nèi)￠L度為0.8-1.2mm莖尖后，將所述頂芽莖尖接種至啟動培養(yǎng)基中進行脫毒培養(yǎng)，所述生長于室外的藤蕹主藤上頂芽需要消毒，消毒方法同所述步驟A)的預(yù)處理中的所述消毒方法；所述啟動培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.1-0.3mg/L的萘乙酸+0.05-0.20mg/L的赤霉素+30g/L的碳源+6g/L的瓊脂粉+1.5g/L的活性炭；和/或所述步驟i)中的脫毒培養(yǎng)時間為14-18天，優(yōu)選為14天。對于受到病原菌侵染的母株，通過莖尖脫毒獲得的組培苗，相對于未經(jīng)脫毒的母苗，其抗病性、抗逆性、適應(yīng)性均大大增強，生長期更短，產(chǎn)量更高，農(nóng)藥、化肥的施用量減少，既降低了生產(chǎn)成本，又減輕了對環(huán)境造成的污染，生產(chǎn)出來的安全無公害蔬菜具有良好的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益。此外，藤蕹脫毒I次后，可直接在實驗室或室外進行營養(yǎng)快繁，無需再次進行脫毒；對于未受病毒侵染的母株，無需考慮脫毒步驟，直接進行快速繁殖，可以在較短的時間和較少的空間內(nèi)，由I個個體繁殖出大量植株。
[0028]在一個具體的實施方式中，所述藤蕹選自長沙藤蕹。
[0029]與傳統(tǒng)育苗方式相比，本發(fā)明的有益效果:
[0030](I)本發(fā)明提供的方法不受季節(jié)限制，每個月份均可出苗。如果I月份開始進行藤蕹組織培養(yǎng)，3月份即可出苗，3月底就有藤蕹可以上市。與傳統(tǒng)的藤蕹埋地窖越冬保存母苗相比，本發(fā)明提供的方法可以使上市時間將近提早I個月。而且，對于優(yōu)化的實施方案來說，整個培養(yǎng)過程所需要的時間比未優(yōu)化的實施方案能夠提早半個月的時間，這更有利于藤蕹提早上市。
[0031](2)本發(fā)明提供的方法短時間內(nèi)能獲得大量植株。從外植體接種到大田繁苗僅需55天，組培苗出瓶到移入大田僅需10天，誘導(dǎo)成活率高達97.59%。與傳統(tǒng)扦插繁殖相比較，本發(fā)明提供的方法帶I個腋芽藤條莖段通過組織培養(yǎng)技術(shù)可繁殖140株藤蕹組培植株，短時間內(nèi)獲得的植株數(shù)量大。
[0032](3)本發(fā)明提供的方法節(jié)約場地。整個培養(yǎng)過程在控溫控光的光照培養(yǎng)室中進行，I個培養(yǎng)瓶可以培養(yǎng)6株組培苗，I層培養(yǎng)架(規(guī)格為長1250mmX寬500mmX高360mm)即可培養(yǎng)672株組培苗，與扦插繁殖相比較，占用場地面積小。
[0033](4)本發(fā)明提供的方法可以節(jié)約勞動成本。在藤蕹整個培養(yǎng)過程中無需整地、蓋膜、澆灌肥水，無需配備專門管理的人員，與傳統(tǒng)扦插繁殖相比較，要節(jié)約大量勞動力和成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1煉苗的藤蕹組培苗。

【具體實施方式】
[0035]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做詳細說明，但本發(fā)明的范圍并不限于此。
[0036]所用的MS培養(yǎng)基為Murashige and Skoog,配方見表1,1/2MS培養(yǎng)基的配方見表
2。其中，F(xiàn)eSO4.7H20 可使用 FeSO4.7H20 與 Na2.EDTA.2H20 進行配制，形成 Fe.EDTA 螯合形式，其原因為二價鐵只有在PH5.2左右時才能被組織所利用，而以螯合形式提供的鐵直到培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中PH上升至7.6-8.0時仍可以被植物組織所利用。
[0037]表I MS培養(yǎng)基成分(單位:mg/L)
[0038]
大量元素 I含量I微量元素I含量I有機物質(zhì)I含量I鐵鹽[￥?
NH4NO31650 Κ?0.83~ 肌醇100~ FeSO4.7Η2027.8
KNO^1900 H3BO36?2 煙酸0Γδ~Na2.EDTA.2Η20 37.3
CaCl2.2Η20 440~ MnSO4.4Η20 22.3~ 鹽酸吡哆醇 0.5MgSO4.7Η20~~ZnSO4.7Η20 8?6 鹽酸硫胺素 07?KH2PO4170~ Na2MoO4.2Η20 0.25~ 甘氨酸 ?70

CuSO4.5Η20 0.025
CoCl2.6Η20 0.025
[0039]表2 1/2MS培養(yǎng)基成分(單位:mg/L)
[0040]
大量元素 I含量I微量元素I含量I有機物質(zhì)I含量I鐵鹽[Wl

【權(quán)利要求】
1.一種藤蕹組織培養(yǎng)的方法，其特征在于，包括如下步驟: A)預(yù)處理:獲得藤蕹藤條，流水下沖洗干凈，將其剪成3-4cm的莖段，所述莖段中至少帶有I個未萌發(fā)的腋芽，并對所述莖段表面消毒； B)初代培養(yǎng):接種于初代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述初代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+2.0-3.0mg/L的6-芐氨基腺嘌呤+0.1-0.3mg/L的萘乙酸+30g/L的碳源+6g/L的瓊脂粉，pH值范圍為5.5-5.8 ； C)繼代培養(yǎng):選擇初代培養(yǎng)后苗高在4cm以上，且具有3-5個腋芽的外植體，剪成帶有1-2個腋芽的莖段，接種于繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待外植體產(chǎn)生的叢生芽長有3-5個腋芽時，分離所述叢生芽，轉(zhuǎn)接至初代培養(yǎng)基中使腋芽伸長，苗高4cm以上后再轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖；所述繼代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.5-1.5mg/L的6-芐氨基腺嘌呤+0.3-0.7mg/L的赤霉素+30g/L的碳源+6g/L的瓊脂粉，pH值范圍為5.5-5.8 ； D)生根培養(yǎng):選擇苗高4cm以上，具有3-5個腋芽的外植體，接種于生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+0.3-0.6mg/L的萘乙酸+15g/L的碳源+6g/L的瓊脂粉，PH值范圍為5.5-5.8 ； E)選擇根據(jù)所述步驟D)的苗高4cm以上，具有3-5個腋芽的組培苗，已生根且根系發(fā)達的組培苗進行煉苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A)中的消毒液為添加吐溫20的5%次氯酸鈉溶液或添加吐溫20的0.1 %的升汞溶液，且每10mL消毒液中滴入50 μ L吐溫20，消毒時間為5-8分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述初代培養(yǎng)基中還包括0.3-1.0g/L的核糖核酸酵母；所述初代培養(yǎng)基中優(yōu)選包括0.5g/L的核糖核酸酵母。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述繼代培養(yǎng)基中還包括0.02g/L的特丁基對苯二酚、0.05g/L的硝酸銀、0.05g/L的Vc和0.lg/L的檸檬酸中的一種，優(yōu)選包括0.02g/L的特丁基對苯二酚。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項所述的方法，其特征在于，所述繼代培養(yǎng)基中還包括0.1-0.5g/L的L-羥基脯氨酸、0.3-0.7g/L的L-絲氨酸和0.1-0.5的g/L的L-鹽酸半胱氨酸中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項所述的方法，其特征在于，所述繼代培養(yǎng)基中還包括15%的藤蕹傷流液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述繼代培養(yǎng)基中MS培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基，其中，所述改良的MS培養(yǎng)基具體為2475mg/L的硝酸銨、1900mg/L的硝酸鉀、440mg/L的二水氯化鈣、370mg/L的七水硫酸鎂、225mg/L的磷酸二氫鉀、70mg/L的氯化鉀、0.83mg/L的碘化鉀、6.2mg/L的硼酸、22.3mg/L的四水硫酸錳、8.6mg/L的七水硫酸鋅、0.25mg/L的二水鑰酸鈉、0.025mg/L的五水硫酸銅、0.025mg/L的六水氯化鈷、100mg/L的肌醇、0.5mg/L的煙酸、0.5mg/L的鹽酸卩比B多醇、0.lmg/L的鹽酸硫胺素、2.0mg/L的甘氨酸、0.3mg/L的泛酸鈣、139.0mg/L的七水硫酸亞鐵和186.5mg/L的乙二胺四乙酸二鈉。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟B)中的培養(yǎng)的條件為:所述未萌發(fā)的腋芽伸長至Icm之前的溫度為30.0±0.5°C ;所述腋芽伸長至Icm之后的溫度為25.0±0.5°C，光照強度為20001x，光照時間為16小時/天； 和/或在所述步驟C)中的培養(yǎng)的條件均為:光照時溫度為28.0±0.5°C，黑暗時溫度為18.0±0.5°C，光照強度為30001x，光照時間為16小時/天； 和/或在所述步驟D)中的培養(yǎng)的條件均為:光照時溫度為28.0±0.5°C，黑暗時溫度為18.0±0.5°C，光照強度為30001x，光照時間為16小時/天； 和/或在所述步驟E)中，所述煉苗時溫度為25.0±0.5°C，光照強度為20001x，光照時間為16小時/天，濕度控制在85%以上。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括藤蕹脫毒培養(yǎng)的步驟i)，所述步驟i)在所述步驟B)之后且在步驟C)之前，取初代培養(yǎng)后腋芽伸長至3cm以上的外植體的頂芽，或直接獲取生長于室外的藤蕹主藤上頂芽，剝?nèi)￠L度為0.8-1.2_頂芽莖尖后，將所述頂芽莖尖接種至啟動培養(yǎng)基中進行脫毒培養(yǎng)，所述生長于室外的藤蕹主藤上頂芽需要消毒，消毒方法同所述步驟A)的預(yù)處理中所述消毒方法；所述啟動培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.1-0.3mg/L的萘乙酸+0.05-0.20mg/L的赤霉素+30g/L的碳源+6g/L的瓊脂粉+1.5g/L的活性炭。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述藤蕹選自長沙藤蕹。
【文檔編號】A01H4/00GK104160959SQ201410386348
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月7日
【發(fā)明者】楊博智, 袁祖華, 周書棟, 楊建國, 戴雄澤, 楊曉, 童輝, 楊劍 申請人:湖南省蔬菜研究所