紅竹體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了紅竹Phyllostachys iridescens體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方法，它是通過(guò)將外植體適宜消毒后，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，胚性愈傷組織經(jīng)增殖培養(yǎng)后首先在胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上形成胚狀體，然后在萌發(fā)培養(yǎng)基上形成再生植株，最后再生植株經(jīng)過(guò)壯苗培養(yǎng)、煉苗后移栽成活。本發(fā)明解決了紅竹體細(xì)胞胚胎發(fā)生的難題，為實(shí)現(xiàn)紅竹的轉(zhuǎn)基因研究、原生質(zhì)體再生等生物技術(shù)育種奠定了基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】紅竹體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及林木生物技術(shù)和組織培養(yǎng)領(lǐng)域，特別涉及到紅竹體細(xì)胞胚胎發(fā)生。

【背景技術(shù)】
[0002]自1958年德國(guó)科學(xué)家培養(yǎng)胡蘿卜根實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生以來(lái)，體細(xì)胞胚胎發(fā)生已經(jīng)成為植物育種領(lǐng)域的重要方法之一。竹類植物首例體細(xì)胞胚胎發(fā)生的報(bào)道始于1982年，迄今，國(guó)內(nèi)外和本專利有關(guān)的竹類植物胚性愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的報(bào)道主要有:
[0003]1982年，Metha等報(bào)道了由印度刺竹(Bambusa arundinacea)成熟胚誘導(dǎo)出愈傷組織并獲得再生植株(參考文獻(xiàn)I)。
[0004]1985年，Rao等報(bào)道以牡竹(Dendrocalamus strictus)成熟種子誘導(dǎo)出愈傷組織，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)植株再生(參考文獻(xiàn)2)。
[0005]1986年，Yeh等用綠竹(B.0Idhamii)的花序誘導(dǎo)出愈傷組織，并獲得再生植株(參考文獻(xiàn)3)。
[0006]1987 年，Yeh 等報(bào)道由麻竹(Sinocalamus latiflora) ( = D.1atiflorus)種胚愈傷組織實(shí)現(xiàn)植株再生(參考文獻(xiàn)4)。
[0007]1990年，Tsay等利用麻竹(S.latiflora)花藥誘導(dǎo)出愈傷組織并實(shí)現(xiàn)植株再生(參考文獻(xiàn)5)。
[0008]1994 年，Rout 等實(shí)現(xiàn)了龍頭竹(B.vulgaris)、龍竹(D.giganteus)和牡竹(D.strictus)等三個(gè)竹種的植株再生(參考文獻(xiàn)6)。
[0009]2002年,Godbole等用版納甜龍竹(D.hamiItonii)桿芽誘導(dǎo)出愈傷組織并實(shí)現(xiàn)植株再生(參考文獻(xiàn)7)。
[0010]2003年，Ramanayake等誘導(dǎo)出龍竹(D.giganteus)的愈傷組織并實(shí)現(xiàn)器官再生(參考文獻(xiàn)8)。
[0011]2004年，Kalia等培養(yǎng)俯竹(B.nutans)的枝條和葉片并實(shí)現(xiàn)植株再生(參考文獻(xiàn)9);同年，Lin等報(bào)道實(shí)現(xiàn)烏腳綠竹(B.edulis)的植株再生(參考文獻(xiàn)10)。
[0012]2007年，Gillis等利用巴苦竹(B.balcooa)小穗誘導(dǎo)出愈傷組織并建立了高效再生體系(參考文獻(xiàn)11)。
[0013]2008年,吳濤等以金絲慈竹(B.affinis ‘viridiflavus’)的桿芽誘導(dǎo)出愈傷組織并獲得再生植株(參考文獻(xiàn)12)。
[0014]2009年，袁金玲等利用孝順竹種胚和花序誘導(dǎo)出愈傷組織并實(shí)現(xiàn)植株再生(參考文獻(xiàn)13);同年，Ojha等利用馬來(lái)麻竹(D.asper)的根、葉片、莖段誘導(dǎo)出愈傷組織并獲得再生植株(參考文獻(xiàn)14)。
[0015]2011年,裴海燕利用雷竹(PLv1lascens)種胚誘導(dǎo)出愈傷組織并實(shí)現(xiàn)植株再生(參考文獻(xiàn)15);同年，Cheah等報(bào)道利用佛肚竹(B.ventricosa)桿芽誘導(dǎo)出愈傷組織并建立再生體系(參考文獻(xiàn)16)。
[0016]2012年,Hu等培養(yǎng)大葉慈竹(D.farinosus)的種胚和幼笑獲得愈傷組織并實(shí)現(xiàn)植株再生(參考文獻(xiàn)17)。
[0017]2013年，丫皿II等報(bào)道了毛竹(911.11一丨一！'似！'.一8。一118)經(jīng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生實(shí)現(xiàn)植株再生(參考文獻(xiàn)18)。
[0018]紅竹是特產(chǎn)我國(guó)的剛竹屬竹種，在竹筍及竹材的利用、園林觀賞和生態(tài)維護(hù)等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和顯著的經(jīng)濟(jì)效益。迄今未見(jiàn)紅竹愈傷組織誘導(dǎo)或植株再生方面的研究報(bào)道，再生體系的缺乏阻礙了紅竹生物技術(shù)育種的研究。
[0019]本發(fā)明提供了紅竹體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方法，將為紅竹的遺傳轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體再生等生物技術(shù)育種的研究提供技術(shù)支撐。
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[0039]本發(fā)明的特點(diǎn)
[0040]縱觀國(guó)內(nèi)外竹類植物再生體系的研究現(xiàn)狀，可以發(fā)現(xiàn):迄今實(shí)現(xiàn)植株再生的方式以器官再生為主，有效的體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系匱乏；和體細(xì)胞胚胎發(fā)生相比，器官再生體系往往存在穩(wěn)定性差、效率低、重復(fù)性不好等缺點(diǎn)，難以應(yīng)用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)和原生質(zhì)體再生研究。并且，實(shí)現(xiàn)植株再生的報(bào)道多數(shù)是叢生竹種，獲得散生竹再生植株的例子較少，迄今未見(jiàn)我國(guó)特產(chǎn)重要經(jīng)濟(jì)竹種紅竹植株再生的報(bào)道。散生竹種由于生理習(xí)性與叢生竹不同，培養(yǎng)難度大，盡管已有多家單位開(kāi)展了研究，但鮮有進(jìn)展。經(jīng)過(guò)開(kāi)展大量研究和試驗(yàn)，并對(duì)同類研究進(jìn)行了重要改良和革新，發(fā)明人掌握了紅竹胚性愈傷組織誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚胎發(fā)生的關(guān)鍵技術(shù)，在國(guó)際上首次公開(kāi)紅竹體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0041]紅竹Phyllostachys iridescens體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方法,其特征在于,包括:夕卜植體消毒，胚性愈傷組織誘導(dǎo)與增殖，胚狀體誘導(dǎo)與萌發(fā)，以及壯苗、煉苗和移栽的過(guò)程，具體步驟如下:
[0042](I)外植體消毒:選擇健康飽滿的種實(shí)，先用75%體積比的乙醇浸泡消毒Imin ;再用每升加5-6滴吐溫-80的0.2%次氯酸鈉浸泡消毒15-20min，期間振蕩3_4次；然后用無(wú)菌水沖洗5-6次；最后用無(wú)菌紙吸干表面水分，接種備用；
[0043](2)胚性愈傷組織誘導(dǎo)與增殖:將消毒后的外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)30-50d使愈傷組織形成，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加1.0-6.0mg/L的2,4_D、0.01-1.0mg/L 的 picloram、0.1-5.0mg/L 的 ΖΤ、8.0g/L 的卡拉膠、300mg/L 的脯氨酸、300mg/L的谷氨酰胺、200mg/L的水解酪蛋白；然后將淡黃色致密的胚性愈傷組織分離出來(lái)，接種到增殖培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)60-90(1使胚性愈傷組織增殖，每30(1轉(zhuǎn)接一次，增殖培養(yǎng)基是以 18 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加 1.0-6.0111^/1 的 2,4-0,0.01-1.0^/1 的？ 1010^111,8.0^/I的卡拉膠、3001^/1的脯氨酸、3001^/1的谷氨酰胺、200呢/1的水解酪蛋白；
[0044](3)胚狀體誘導(dǎo)與萌發(fā):將增殖培養(yǎng)后的胚性愈傷組織接種到胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)10-20(1，使胚狀體形成，胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以13培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加
1.0-8.0111^/1 的 21,0.1-5.0^/1 的艦、0.1-5.0^/1 的 30^/1 的蔗糖、88凡的卡拉膠；然后將胚狀體接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)20-30(1，胚狀體逐漸萌發(fā)形成再生植株，萌發(fā)培養(yǎng)是以13培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加0.1-5.0111^/1的嫩八、0.1-5.0^/1的￠13001^/1的脯氨酸、3001118/1的谷氨酰胺、2001118/1的水解酪蛋白、88/1的卡拉膠；光照時(shí)間1211/山光照強(qiáng)度1000-20001^ ；
[0045](4)壯苗、煉苗和移栽:將體細(xì)胞胚胎再生的小植株接種到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)20-30(1，開(kāi)瓶煉苗5-7(1，取出小苗清洗根部的培養(yǎng)基，再用0.1 %的高錳酸鉀溶液清洗根部，然后將小苗栽植到滅菌的介質(zhì)中，遮陰散射光培養(yǎng)一個(gè)月后，幼苗成活；壯苗培養(yǎng)基是以13培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加1.0-4.0111^/1的嫩八、0.2-0.5呢/1的11)238/1的卡拉膠。

【具體實(shí)施方式】
[0046]下面結(jié)合紅竹？11711081:51(31178 1:^1(168(36118實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0047](1)挑選飽滿健康種實(shí)，先用75%體積比的乙醇浸泡消毒1-11 ；再用每升加5-6滴吐溫-80的0.2%的次氯酸鈉浸泡消毒15-20111111，期間振蕩3-4次；然后用無(wú)菌水沖洗5-6次；最后用無(wú)菌紙吸干表面水分，接種備用；
[0048](2)將消毒后的外植體接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，261暗培養(yǎng)40-50(1，夕卜植體形成米粒大小的愈傷組織，誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以13培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加308/1的2，4-0、
0.1^/1 的51118/1 的 21、88凡的卡拉膠、3001^/1 的脯氨酸、3001^/1 的谷氨酰胺、200^/1的水解酪蛋白；然后將淡黃色致密的胚性愈傷組織分離出來(lái)，接種到增殖培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)60-90(1，每30(1轉(zhuǎn)接一次，增殖培養(yǎng)基是以13培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加1.0^/1的2,4-0^0.1111^/1 的 5^/1 的 21\88凡的卡拉膠、30011^/1 的脯氨酸、3001^/1 的谷氨酰胺、20008/1的水解酪蛋白；
[0049](3)將增殖后的胚性愈傷組織接種到胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，261暗培養(yǎng)10-20(1，胚狀體形成，胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以13培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加3.0111^/1的21、1.0^/1的嫩八、
1.0呢凡的以、308凡的鹿糖、如凡的卡拉膠；然后將胚狀體接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)20-30(1，光照時(shí)間光照強(qiáng)度1000-20001111胚狀體逐漸萌發(fā)形成再生植株，萌發(fā)培養(yǎng)基是以13培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加1.0111^/1的購(gòu)V、1.0^/1的￠13001^/1的脯氨酸、300^/I的谷氨酰胺、20008/1的水解酪蛋白、88/1的卡拉膠；
[0050](4)壯苗、煉苗和移栽:將體細(xì)胞胚胎再生的小植株接種到壯苗培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20-30(1，開(kāi)瓶煉苗5-7(1，取出小苗清洗根部的培養(yǎng)基，再用0.1 %的高錳酸鉀溶液清洗根部，然后將小苗栽植到滅菌的介質(zhì)(山地黃壤土:蛭石:泥炭土 = 1: 1: 1)中，遮陰散射光培養(yǎng)一個(gè)月后，幼苗成活；壯苗培養(yǎng)基是以13培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加208/1的2111^/1的丁02、8871的卡拉膠。
【權(quán)利要求】
1.紅竹Phyllostachys iridescens體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方法,其特征在于,包括:外植體消毒，胚性愈傷組織誘導(dǎo)與增殖，胚狀體誘導(dǎo)與萌發(fā)，以及壯苗、煉苗和移栽的過(guò)程，具體步驟如下: (1)外植體消毒:選擇健康飽滿的種實(shí)，先用75%體積比的乙醇浸泡消毒Imin;再用每升加5-6滴吐溫-80的0.2%次氯酸鈉浸泡消毒15-20min，期間振蕩3_4次；然后用無(wú)菌水沖洗5-6次；最后用無(wú)菌紙吸干表面水分，接種備用； (2)胚性愈傷組織誘導(dǎo)與增殖:將消毒后的外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng).30-50d使愈傷組織形成，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加1.0-6.0mg/L的.2,4_D、0.01-1.0mg/L 的 picloram、0.1-5.0mg/L 的 ΖΤ、8.0g/L 的卡拉膠、300mg/L 的脯氨酸、300mg/L的谷氨酰胺、200mg/L的水解酪蛋白；然后將淡黃色致密的胚性愈傷組織分離出來(lái)，接種到增殖培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)60-90d使胚性愈傷組織增殖，每30d轉(zhuǎn)接一次，增殖培養(yǎng)基是以 MS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加 1.0-6.0mg/L 的 2，4_D、0.01-1.0mg/L 的 picloram、8.0g/L的卡拉膠、300mg/L的脯氨酸、300mg/L的谷氨酰胺、200mg/L的水解酪蛋白； (3)胚狀體誘導(dǎo)與萌發(fā):將增殖后的胚性愈傷組織接種到胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)10-20d，使胚狀體形成，胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加1.0-8.0mg/L的ZT,0.1-5.0mg/L的ΝΑΑ、0.1-5.0mg/L的GA、30g/L的蔗糖、8g/L的卡拉膠；然后將胚狀體接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)20-30d，胚狀體逐漸萌發(fā)形成再生植株，萌發(fā)培養(yǎng)是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加0.1-5.0mg/L的ΝΑΑ、0.1-5.0mg/L的GA、300mg/L的脯氨酸、300mg/L的谷氨酰胺、200mg/L的水解酪蛋白、8g/L的卡拉膠；光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度1000-20001ux (4)壯苗、煉苗和移栽:將體細(xì)胞胚胎再生的小植株接種到壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)20-30d，開(kāi)瓶煉苗5-7d，取出小苗清洗根部的培養(yǎng)基，再用0.1 %的高錳酸鉀溶液清洗根部，然后將小苗栽植到滅菌的介質(zhì)中，遮陰散射光培養(yǎng)一個(gè)月后，幼苗成活；壯苗培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加1.0-4.0mg/L的NAA、0.2-0.5mg/L的TDZ、8g/L的卡拉膠。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104303996SQ201410394490
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月7日
【發(fā)明者】岳晉軍, 顧小平, 袁金玲, 吳曉麗 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所