粉防已的種子組培繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種粉防已的種子組培繁殖方法，包括種子儲(chǔ)藏、種子消毒、啟動(dòng)培養(yǎng)、誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)六大步驟，其特征在于，誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟中，首先采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基一對(duì)萌動(dòng)膨大的種子進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)出無菌苗，然后采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基二對(duì)無菌苗進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，從而降低了叢生芽的褐化率并消除了叢生芽的部分玻璃化現(xiàn)象。在增殖培養(yǎng)步驟中采用兩步增殖培養(yǎng)，第一步可以快速培養(yǎng)出大量的叢生芽，第二步可以培養(yǎng)出用于生根的健壯叢生芽苗以及部分新增殖的叢生芽，有效的提高本組培方法的繁殖效率，本發(fā)明方法培養(yǎng)流程簡(jiǎn)單，繁殖系數(shù)高，操作方便，適宜工廠化育苗，為商業(yè)化培養(yǎng)粉防已種苗提供了技術(shù)支持。
【專利說明】粉防已的種子組培繁殖方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說是一種粉防已的種子組培繁殖方法。

【背景技術(shù)】
[0002]粉防己，又叫漢防己，或者白木香，為防己植物石蟾蜍的根，屬野生資源，多年生藤本植物，生于山坡、丘陵地帶的草叢及灌木林緣。主產(chǎn)地江西、安徽。有利水消腫，祛風(fēng)止痛之功效。
[0003]粉防己喜濕潤(rùn)潮濕環(huán)境，灌木陰涼處生長(zhǎng)，怕干旱、水澇，由于根莖生長(zhǎng)較深，所以要求土層松軟，沙質(zhì)泥土，人工栽培種苗主要來源以兩方面，一是利用成熟果實(shí)經(jīng)發(fā)芽成苗后移植栽培，但由于自身繁殖能力低下，所以很少應(yīng)用，二是利用強(qiáng)壯成熟根莖培育發(fā)芽，這是我國(guó)多年從事粉防己栽培的主要方法之一。
[0004]粉防己是中藥防己的唯一來源。安徽作為粉防己的主產(chǎn)區(qū)之一，主要集中分布在皖南山區(qū)的岳西、寧國(guó)、祁門、休寧、績(jī)溪、旌德、石臺(tái)等(市)縣。通過對(duì)上述地區(qū)粉防己野生資源的調(diào)查發(fā)現(xiàn):粉防己自然繁殖成活率低，以根的無性繁殖為主，5年以上才能采挖入藥，生長(zhǎng)年限長(zhǎng)。目前粉防己藥材主要來源于野生，人工種植受種源的限制和生產(chǎn)周期長(zhǎng)等的影響，未見有規(guī)模的人工栽培，近十多年以來該藥材價(jià)格一漲再漲，伴隨著人們對(duì)野生資源的掠奪式采挖，已使粉防己資源瀕臨枯竭的邊緣。由于粉防己種子繁殖發(fā)芽率低，且3年以上的植株才開始漸漸掛果，而根莖繁殖又需要大量強(qiáng)壯新鮮根莖培育發(fā)芽，因此現(xiàn)有的種子和根莖繁殖技術(shù)都難以適應(yīng)人工培育的種源需求，為此利用現(xiàn)代生物技術(shù)之組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖粉防己種苗，解決粉防己人工種植的種源問題，進(jìn)行野生變家種或人工半野生撫育是解決粉防己資源緊缺的有效途徑之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種粉防已的種子組培繁殖方法，旨在尋求粉防己組織培養(yǎng)繁殖的新途徑，提供充足優(yōu)良的粉防己種苗，以期規(guī)?；?guī)范化種植，解決該藥材供應(yīng)緊張的資源問題。
[0006]本發(fā)明解決技術(shù)問題采用如下技術(shù)方案:
[0007]粉防已的種子組培繁殖方法，包括種子儲(chǔ)藏、種子消毒、啟動(dòng)培養(yǎng)、誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)六大步驟，其特點(diǎn)在于，
[0008]所述啟動(dòng)培養(yǎng)是指:將消毒好的種子接種到MS培養(yǎng)基上，在夜溫18°C，日溫22°C，相對(duì)濕度50%?60%暗箱條件下進(jìn)行種子啟動(dòng)培養(yǎng)，15天后，種子開始萌動(dòng)膨大；
[0009]所述誘導(dǎo)培養(yǎng)是指:將萌動(dòng)膨大的種子接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基一中培養(yǎng)，其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基一為 MS+BA2.0—3.0mg/L+NAA0.1-0.2mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5g/L，pH 值為 5.8，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度1500LX，光照12h，溫度22?26°C，培養(yǎng)4?6周，萌動(dòng)膨大的種子萌發(fā)為無菌苗；將無菌苗分切成l_3mm的塊莖段置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基二中培養(yǎng)，其中誘導(dǎo)培養(yǎng)基二為 MS+Ca (NO3) 2200mg/L+BAl.0—2.0mg/L+IAA0.2mg/L+VC10-20mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5g/L，pH值為5.8，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度1500LX，光照12h，溫度22?26°C，培養(yǎng)4周，即可誘導(dǎo)出大量的叢生芽；
[0010]所述增殖培養(yǎng)是指:將生長(zhǎng)至5mm以上的叢生芽切下接種于增殖培養(yǎng)基一中，增殖培養(yǎng)基一為 MS+Ca(NO3)2200mg/L+BA1.0mg/L+IAA0.5mg/L+VC10_20mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂5g/L，pH值為5.8，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度1500LX，光照12h，溫度22?26°C，培養(yǎng)4周，可觀察到大量新增殖的叢生芽；將Icm以上的叢生芽叢切割成2-5mm的芽叢塊接種于增殖培養(yǎng)基二中，增殖培養(yǎng)基二為 MS+Ca (NO3) 2200mg/L+IBA2.5mg/L+IAA2.0mg/L+VC10-20mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5g/L，pH值為5.8，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度2000?3000LX，光照12h，溫度22?26°C，培養(yǎng)4-8周，獲得部分長(zhǎng)成2?4cm的健壯叢生芽苗以及部分新增殖的叢生芽。
[0011]本發(fā)明特點(diǎn)還在于:
[0012]所述種子儲(chǔ)藏是指:采集當(dāng)年秋后粉防已的成熟種子，將種子與含水率40% -50%的濕沙混合，混合體積比為1: 3，混合后放置于4°C的冰箱中儲(chǔ)藏2周以上。
[0013]所述種子消毒是指:將儲(chǔ)藏的種子取出，于流水中沖洗30min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用體積分?jǐn)?shù)75%酒精處理30s，無菌水沖洗3次，然后放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1 %的HgCl2中處理5?1min,無菌水沖洗4?6次,然后置于無菌濾紙上吸干水分。
[0014]所述生根培養(yǎng)是指:取增殖培養(yǎng)基二中的長(zhǎng)到2?4cm時(shí)的健壯叢生芽苗，將其切分成單芽，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)，其中，部分新增殖的叢生芽切割成叢生芽塊接種于增殖培養(yǎng)基二中繼續(xù)增殖培養(yǎng)，所述生根培養(yǎng)基組分為I/2MS+Ca(NO3)210mg/L+IBA2.0mg/L+VC10mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5g/L，pH 值為 5.8 ;在夜溫 22°C，日溫 26°C，光照強(qiáng)度30001x，每天光照時(shí)長(zhǎng)12小時(shí)的條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)1-2周，將形成根部突起的組培苗再進(jìn)行瓶外生根培養(yǎng)和苗床培養(yǎng)，可獲得大量的粉防已組培種苗。
[0015]與已有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在:
[0016]本發(fā)明采用種子組培繁殖，外植體的消毒成功率達(dá)95%以上，誘導(dǎo)得到的無菌苗污染率低，遺傳性狀穩(wěn)定，繁殖系數(shù)達(dá)4-6倍，本發(fā)明方法培養(yǎng)流程簡(jiǎn)單，操作方便，適宜工廠化育苗，為商業(yè)化培養(yǎng)粉防已種苗提供了技術(shù)支持。
[0017]本發(fā)明將種子與濕沙按1:3的體積比混合后放置于4°C的冰箱中儲(chǔ)藏，可以使防已種子提前進(jìn)入生理休眠期。
[0018]本發(fā)明種子消毒方法，其消毒成功率達(dá)95%以上。
[0019]本發(fā)明啟動(dòng)培養(yǎng)步驟，可以縮短種子萌發(fā)時(shí)間。
[0020]本發(fā)明誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟中，首先采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基一對(duì)萌動(dòng)膨大的種子進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)出無菌苗，然后采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基二對(duì)無菌苗進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，叢生芽的褐化率降低至5%以下并消除了叢生芽的部分玻璃化現(xiàn)象。
[0021]本發(fā)明增殖培養(yǎng)分兩步，第一步可以快速培養(yǎng)出大量的叢生芽，第二步可以培養(yǎng)出可用于生根的健壯的叢生芽苗以及部分仍可用于增殖培養(yǎng)二中繼續(xù)培養(yǎng)的新增殖叢生芽。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是本發(fā)明誘導(dǎo)培養(yǎng)中采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基一培養(yǎng)獲得的無菌苗。
[0023]圖2是本發(fā)明誘導(dǎo)培養(yǎng)中采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基二培養(yǎng)獲得的叢生芽。
[0024]圖3、圖4均為本發(fā)明增殖培養(yǎng)中在增殖培養(yǎng)基二中獲得的健壯的叢生芽苗以及部分仍可用于增殖培養(yǎng)二中繼續(xù)培養(yǎng)的新增殖叢生芽。
[0025]圖5是本發(fā)明生根培養(yǎng)步驟中獲得的形成根部突起的組培苗。

【具體實(shí)施方式】
[0026]本實(shí)施例粉防已的種子組培繁殖方法，包括種子儲(chǔ)藏、種子消毒、啟動(dòng)培養(yǎng)、誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)六大步驟，
[0027]種子儲(chǔ)藏是指:采集當(dāng)年秋后粉防已的成熟種子，將種子與含水率40% -50%的濕沙混合，混合體積比為1: 3，混合后放置于4°C的冰箱中儲(chǔ)藏2周以上。
[0028]種子消毒是指:將儲(chǔ)藏的種子取出，于流水中沖洗30min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用體積分?jǐn)?shù)75%酒精處理30s，無菌水沖洗3次，然后放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的HgCl2中處理5?1min,無菌水沖洗4?6次,然后置于無菌濾紙上吸干水分。
[0029]啟動(dòng)培養(yǎng)是指:將消毒好的種子接種到MS培養(yǎng)基上，在夜溫18°C，日溫22°C，相對(duì)濕度50%?60%暗箱條件下進(jìn)行種子啟動(dòng)培養(yǎng)，15天后，種子開始萌動(dòng)膨大；
[0030]誘導(dǎo)培養(yǎng)是指:將萌動(dòng)膨大的種子接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基一中培養(yǎng)，其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基一為 MS+BA2.0—3.0mg/L+NAA0.1-0.2mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5g/L，pH 值為 5.8，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度1500LX，光照12h，溫度22?26°C，培養(yǎng)4_6周，萌動(dòng)膨大的種子萌發(fā)為無菌苗，如圖1所示；將無菌苗分切成1_3_的塊莖段置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基二中培養(yǎng)，其中誘導(dǎo)培養(yǎng)基二為 MS+Ca (NO3) 2200mg/L+BAl.0—2.0mg/L+IAA0.2mg/L+VC10_20mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂5g/L, pH值為5.8，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度1500LX，光照12h，溫度22?26°C，培養(yǎng)4周，SP可誘導(dǎo)出大量的叢生芽，如圖2所示；
[0031]增殖培養(yǎng)是指:將生長(zhǎng)至5mm以上的叢生芽切下接種于增殖培養(yǎng)基一中，增殖培養(yǎng)基一為 MS+Ca (NO3) 2200mg/L+BAl.0mg/L+IAA0.5mg/L+VC10_20mg/L+蔗糖 30g/L+ 瓊脂5g/L, pH值為5.8，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度1500LX，光照12?16h，溫度22?26°C，培養(yǎng)4周，可觀察到大量新增殖的叢生芽；將Icm以上的叢生芽叢切割成2-5mm的芽叢塊接種于增殖培養(yǎng)基二中，增殖培養(yǎng)基二為 MS+Ca (NO3) 2200mg/L+IBA2.5mg/L+IAA2.0mg/L+VC10-20mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5g/L，pH值為5.8，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度2000?3000LX，光照12h，溫度22?26°C，培養(yǎng)4-8周，獲得部分長(zhǎng)成2?4cm的健壯叢生芽苗以及部分仍可用于增殖培養(yǎng)二中繼續(xù)培養(yǎng)的新增殖叢生芽，如圖3、圖4所示。
[0032]生根培養(yǎng)是指:取增殖培養(yǎng)基二中的長(zhǎng)到2?4cm時(shí)的健壯叢生芽苗，將其切分成單芽，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)，其中，部分新增殖的叢生芽切割成叢生芽塊接種于增殖培養(yǎng)基二中繼續(xù)增殖培養(yǎng)，所述生根培養(yǎng)基組分為I/2MS+Ca (NO3) 210mg/L+IBA2.0mg/L+VC10mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5g/L，pH 值為 5.8 ;在夜溫 22°C，日溫 26°C，光照強(qiáng)度30001x，每天光照時(shí)長(zhǎng)12小時(shí)的條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)1-2周，將形成根部突起的組培苗，如圖5所示，然后將根部突起的組培苗再進(jìn)行瓶外生根培養(yǎng)和苗床培養(yǎng)，可獲得大量的粉防已組培種苗。
【權(quán)利要求】
1.粉防已的種子組培繁殖方法，包括種子儲(chǔ)藏、種子消毒、啟動(dòng)培養(yǎng)、誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)六大步驟，其特征在于， 所述啟動(dòng)培養(yǎng)是指:將消毒好的種子接種到MS培養(yǎng)基上，在夜溫18°C，日溫22°C，相對(duì)濕度50%?60%暗箱條件下進(jìn)行種子啟動(dòng)培養(yǎng)，15天后，種子開始萌動(dòng)膨大； 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)是指:將萌動(dòng)膨大的種子接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基一中培養(yǎng)，其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基一為 MS+BA2.0—3.0mg/L+NAA0.1-0.2mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5g/L，pH 值為 5.8，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度1500LX，光照12h，溫度22?26°C，培養(yǎng)4?6周，萌動(dòng)膨大的種子萌發(fā)為無菌苗；將無菌苗分切成l_3mm的塊莖段置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基二中培養(yǎng)，其中誘導(dǎo)培養(yǎng)基二為MS+Ca (NO3) 2200mg/L+BAl.0—2.0mg/L+IAA0.2mg/L+VC10-20mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5g/L，pH值為5.8，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度1500LX，光照12h，溫度22?26°C，培養(yǎng)4周，即可誘導(dǎo)出大量的叢生芽； 所述增殖培養(yǎng)是指:將生長(zhǎng)至5mm以上的叢生芽切下接種于增殖培養(yǎng)基一中，增殖培養(yǎng)基一為 MS+Ca (NO3) 2200mg/L+BAl.0mg/L+IAA0.5mg/L+VC10_20mg/L+蔗糖 30g/L+ 瓊脂5g/L，pH值為5.8，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度1500LX，光照12h，溫度22?26°C，培養(yǎng)4周，可觀察到大量新增殖的叢生芽；將Icm以上的叢生芽叢切割成2-5mm的芽叢塊接種于增殖培養(yǎng)基二中，增殖培養(yǎng)基二為 MS+Ca(NO3)2200mg/L+IBA2.5mg/L+IAA2.0mg/L+VC10-20mg/L+ 蔗糖30g/L+瓊脂5g/L，pH值為5.8，培養(yǎng)條件為:光照強(qiáng)度2000?3000LX，光照12h，溫度22?26°C，培養(yǎng)4-8周，獲得部分長(zhǎng)成2?4cm的健壯叢生芽苗以及部分新增殖的叢生芽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粉防已的種子組培繁殖方法，其特征在于，所述種子儲(chǔ)藏是指:采集當(dāng)年秋后粉防已的成熟種子，將種子與含水率40% -50%的濕沙混合，混合體積比為1: 3，混合后放置于4°C的冰箱中儲(chǔ)藏2周以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的粉防已的種子組培繁殖方法，其特征在于，所述種子消毒是指:將儲(chǔ)藏的種子取出，于流水中沖洗30min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用體積分?jǐn)?shù)75%酒精處理30s，無菌水沖洗3次，然后放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1 %的HgCl2中處理5?lOmin，無菌水沖洗4?6次，然后置于無菌濾紙上吸干水分。
4.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1所述的粉防已的種子組培繁殖方法，其特征在于，所述生根培養(yǎng)是指:取增殖培養(yǎng)基二中的長(zhǎng)到2?4cm時(shí)的健壯叢生芽苗，將其切分成單芽，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)，其中，部分新增殖的叢生芽切割成叢生芽塊仍可接種于增殖培養(yǎng)基二中繼續(xù)增殖培養(yǎng)，所述生根培養(yǎng)基組分為1/2MS+Ca (NO3) 2100mg/L+IBA2.0mg/L+VC10mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5g/L，pH值為5.8 ;在夜溫22 °C，日溫26 °C，光照強(qiáng)度30001x，每天光照時(shí)長(zhǎng)12小時(shí)的條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)1-2周，將形成根部突起的組培苗再進(jìn)行瓶外生根培養(yǎng)和苗床培養(yǎng)，可獲得大量的粉防已組培種苗。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104170732SQ201410401162
【公開日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月13日
【發(fā)明者】鄺荔香, 劉靜, 趙笑, 閆雨瀅 申請(qǐng)人:安徽醫(yī)科大學(xué)