一種擬南芥Mo敏感變異株篩選培養(yǎng)基及篩選方法
【專利摘要】一種擬南芥Mo敏感變異株的篩選方法以及篩選所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。此方法篩選出擬南芥Mo敏感的突變體。篩選所用的培養(yǎng)基包括不含鉬(-Mo)和含170nM鉬(+Mo)的固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)方法是：擬南芥M2種子先用75％的酒精浸泡30s，然后在1％次氯酸鈉中浸泡10min，最后用無菌去離子水沖洗5-6次，消毒后的種子接種于-Mo或+Mo培養(yǎng)基上，經(jīng)過4℃春化2天后，置于22℃、16h/8h光暗交替的光照培養(yǎng)箱中垂直培養(yǎng)。篩選方法是：以EMS誘變處理野生型擬南芥Col-0獲得的M2代種子為試驗材料，通過在-Mo和+Mo的培養(yǎng)基上進行反復篩選培養(yǎng)，根據(jù)擬南芥根系在兩種培養(yǎng)基上的生長差異篩選出在-Mo培養(yǎng)基上根生長不好而在+Mo培養(yǎng)基上根生長很好的擬南芥Mo敏感變異株，并對其表型進行了分析。
【專利說明】一種擬南芥Mo敏感變異株篩選培養(yǎng)基及篩選方法

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物生物技術(shù)，具體涉及一種擬南芥Mo敏感變異株的篩選方法 以及篩選用的培養(yǎng)基。

【背景技術(shù)】
[0002] 鑰（Molybdenum，Mo)是植物生長發(fā)育必不可少的微量礦質(zhì)元素。如果土壤缺Mo 植物無法生長，且植物出現(xiàn)典型的缺素癥狀，主要表現(xiàn)為：葉片失綠，葉脈間的組織形成黃 綠或桔紅色葉斑；葉緣卷曲、凋萎以至于壞死；葉柄和葉脈干枯等。據(jù)報道，自然界土壤中 Mo濃度為3-7mg · kg_S而地表水中Mo濃度為10-50nM。世界上許多地方的土壤不能提供 植物生長所必需的鑰元素，尤其是在酸性土壤中，然而在自然條件土壤中鑰元素含量對植 物生長是不足的。
[0003] 鑰在土壤中以輝鑰礦（MoS2)或者水鑰鐵礦[Fe2(Mo0 4)3]的形式存在，然而植物 在pH5以上的溶液中以鑰酸鹽（M〇0廣）的形態(tài)吸收和轉(zhuǎn)運鑰。鑰酸在植物體中主要是形 成鑰輔因子（Moco)參與植物生理功能。其中，鑰是由CNX1催化被插入到金屬靶定的蝶 呤（MPT)中，從而代替銅離子靶定的二硫酚硫，這個過程與肌動蛋白絲相關。也就是說， MPT是GTP經(jīng)過cPMP循環(huán)合成的。Moco也是一些氧化還原酶的重要組成成分，包括硝酸 還原酶（nitrate reductase, NR)、亞硫酸鹽氧化酶（sulfite oxidase, S0)、黃噪呤脫氫酶 (xanthine dehydrogenase, XDH)以及醒氧化酶（aldehyde oxidase, A0)等。除此之外，鑰 在植物的生長發(fā)育中還有以下主要功能：（1)鑰可以提高鐵離子等養(yǎng)分的吸收，從而提高 植物光合速率；（2)鑰能夠促進磷酸酶活性，增加植物體內(nèi)VC的合成以及有利于糖類的形 成與轉(zhuǎn)化；(3)鑰能促進植物產(chǎn)生抗壞血酸以及增加種子的含糖量，從而增強植物抗寒、抗 旱和抗病能力。有機鑰肥效高，對防治植物煙草花葉病效果明顯。另外，Moco在古細菌、原 核生物以及真核生物中都是高度保守的。
[0004] 擬南芥（Arabidopsis thaliana)屬于十字花科（Brassicaceae)鼠耳芥屬 (Arabidopsis)，由于其基因組（125Mb)是目前已知植物基因組中最小的，這就使得擬南芥 經(jīng)常被作為植物材料來研究，是典型的模式植物。另外，擬南芥生長周期短，具有高等植物 的一般特點，對研究和闡明植物的生長發(fā)育機制具有重要意義。同時，擬南芥是自花受粉植 物，基因高度純合，用理化因素處理突變率很高，容易獲得各種功能缺陷型突變體。其中，使 用燒化劑甲基磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate，EMS)作為誘變劑現(xiàn)已被廣泛運用，它具 有突變頻率高，易獲得飽和突變，基因突變的多種效應（功能完全缺失、功能部分缺失、功 能的數(shù)量性變化、功能的組成性表達）等特點，能夠基本滿足篩選出各種功能基因缺陷的 突變體。此外，擬南芥基因組的成功測序為基因功能分析和遺傳改良奠定了堅實的基礎，繼 而可以通過圖位克隆等方法分離鑒定突變體基因，為進一步揭示基因的功能以及改良植物 品種都具有重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種擬南芥Mo敏感變異株篩選培養(yǎng)基及篩選方法。
[0006] 本發(fā)明解決技術(shù)問題采用如下技術(shù)方案：
[0007] -種擬南芥Mo敏感變異株篩選培養(yǎng)基，其特點在于由+Mo培養(yǎng)基和-Mo培養(yǎng)基組 成；
[0008] 所述+Mo培養(yǎng)基組成為每升+Mo培養(yǎng)基中含有pH5. 8的1. 75mM磷酸鈉緩沖液、 1. 5mM MgS04、2. OmM Ca(N03)2、3. OmM KN〇3、67 μ M Na2EDTA、8. 6 μ M FeS04、10. 3 μ M MnS04、 30μΜ Η3Β03、1·0μΜ ZnS04、24nM(NH4)6M〇70 24、130nM CoCl2、lyM CuS04 母液各 5ml，蔗糖 l〇g，結(jié)冷膠5g，余量為水，pH為5. 8。
[0009] 所述-Mo固體培養(yǎng)基為去除（NH4) 6M〇7024成分的+Mo培養(yǎng)基組分。
[0010] 一種擬南芥Mo敏感變異株的篩選方法，其特點在于，包括如下步驟：
[0011] (1)用EMS誘變處理野生型擬南芥Col-Ο種子，即為Ml ;將Ml種子種植，收獲擬南 芥種子M2 ;
[0012] (2)將經(jīng)消毒處理的擬南芥種子M2接種于-Mo培養(yǎng)基上；在4°C春化2天后，置于 22°C、16h/8h光暗交替的光照培養(yǎng)箱中垂直培養(yǎng)；
[0013] (3)將在-Mo培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周后的根系較短的幼苗選出，轉(zhuǎn)移到+Mo培養(yǎng)基上； 在22°C、16h/8h光周期的光照培養(yǎng)箱中垂直培養(yǎng)4-5天后，把根系伸長較好的幼苗再轉(zhuǎn)移 到-Mo培養(yǎng)基上；同樣條件下培養(yǎng)一周后，將根系生長停滯或幾乎不生長的幼苗移栽到充 滿蛭石的石棉上，在溫室中生長至開花結(jié)實，單株收獲擬南芥種子M3 ;
[0014] (4)再將步驟（3)所得的擬南芥種子M3消毒后，分別取同一單株的5粒種子接種 于-Mo和+Mo培養(yǎng)基上，在22°C、16h/8h光周期的光照培養(yǎng)箱中同時垂直培養(yǎng)進行第二次 篩選，若M3種子在-Mo培養(yǎng)基上根長相對較短，且在+Mo培養(yǎng)基根長相對較長，則該單株植 株為Mo敏感的擬南芥變異株；
[0015] (5)將篩選出的Mo敏感變異株，移栽到充滿蛭石的石棉上，在溫室中生長至開花 結(jié)實，單株收獲擬南芥種子M4 ;將每個單株收獲的M4種子取10粒消毒后分別接種于含 0nM、l. 7nM、170nM Mo的+Mo培養(yǎng)基中，以Col-Ο野生型種子為對照，通過比較其根系的長度 和形態(tài)以及葉片的生長情況分析，驗證其為Mo敏感的擬南芥變異株；
[0016] 所述+Mo培養(yǎng)基組分為每升+Mo培養(yǎng)基中含有1. 75mM磷酸鈉緩沖液（pH5. 8)、 1. 5mM MgS04、2. OmM Ca(N03)2、3. OmM KN〇3、67 μ M Na2EDTA、8. 6 μ M FeS04、10. 3 μ M MnS04、 30μΜ Η3Β04、1·0μΜ ZnS04、24nM(NH4)6M〇70 24、130nM CoCl2、lyM CuS04 母液各 5ml，蔗糖 l〇g，結(jié)冷膠5g，余量為水，pH為5. 8。
[0017] 所述-Mo固體培養(yǎng)基為去除（NH4) 6M〇7024成分的+Mo培養(yǎng)基組分。
[0018] 所述步驟⑴中擬南芥M2種子消毒處理是指將擬南芥M2種子先用質(zhì)量分數(shù)75% 的酒精浸泡30s，然后在質(zhì)量分數(shù)1 %次氯酸鈉中浸泡10min，最后用無菌去離子水沖洗5-6 次。
[0019] 與已有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在：
[0020] 本發(fā)明采用EMS作為化學誘變劑，它具有突變頻率高、易獲得基因突變的多種效 應（功能完全缺失、功能部分缺失、功能的數(shù)量性變化、功能的組成性表達）等特點，能夠基 本滿足篩選出各種功能基因缺陷的突變體。另外，Mo是植物生長發(fā)育的必需礦質(zhì)元素，如 果植物缺Mo,會產(chǎn)生專一的病癥。同時擬南芥具有生長周期短、容易培養(yǎng)等優(yōu)點，為本篩選 方法奠定了理論基礎。此外，擬南芥基因組小且成功測序為基因功能分析和遺傳改良奠定 了堅實的基礎，繼而可以通過圖位克隆等方法分離鑒定突變體的功能基因。
[0021] 本發(fā)明所篩選出的擬南芥Mo敏感變異株可利用圖位克隆技術(shù)分離突變體功能基 因，并驗證其吸收與轉(zhuǎn)運Mo的功能，為從分子水平闡明植物吸收與運輸Mo的機理以及改良 植物品種提供依據(jù)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1 :M2代種子在初篩中的根系生長狀況。
[0023] 圖2 :M3代種子在+Mo和-Mo中的生長情況。
[0024] 圖3 :Mo敏感變異株的表型。

【具體實施方式】
[0025] 以下結(jié)合附圖通過【具體實施方式】對本發(fā)明技術(shù)方案做進一步解釋說明。
[0026] (1)二種篩選培養(yǎng)基配制
[0027] 培養(yǎng)基母液配方：①磷酸鈉緩沖液（pH5. 8)，1. 75mM ;②MgS04,1. 5mM ;③Ca(N03)2， 2. OmM ;KN03, 3. OmM ;④ Na2EDTA，67 μ M ;FeS04,8· 6 μ M ;MnS04,10. 3 μ M ;H3B04, 30 μ M ;ZnS04， 1· 0 μ Μ ; (ΝΗ4)6Μ〇7024, 24ηΜ ;CoCl2,130ηΜ ;CuS04,1 μ Μ。
[0028] 表1培養(yǎng)基母液配方 [0029]

【權(quán)利要求】
1. 一種擬南芥Mo敏感變異株篩選培養(yǎng)基，其特征在于由+Mo培養(yǎng)基和-Mo培養(yǎng)基組 成； 所述+Mo培養(yǎng)基組成為每升+Mo培養(yǎng)基中含有pH5. 8的1. 75mM磷酸鈉緩沖液、1. 5mM MgS04、2.0mM Ca(N03)2、3.0mM ΚΝ03、67μΜ Na2EDTA、8.6yM FeS04、10.3yM MnS04、30yM Η3Β03、1·0μΜ ZnS04、24nM(NH4)6M〇70 24、130nM CoCl2、lyM CuS04 母液各 5ml，鹿糖 10g，結(jié)冷 膠5g,余量為水，pH為5. 8。 所述-Mo固體培養(yǎng)基為去除（NH4)6M〇7024成分的+Mo培養(yǎng)基。
2. -種擬南芥Mo敏感變異株的篩選方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 用EMS誘變處理野生型擬南芥Col-Ο種子，即為擬南芥種子Ml ;將種子Ml種植，收 獲擬南芥種子M2 ; (2) 將經(jīng)消毒處理的擬南芥種子M2接種于-Mo培養(yǎng)基上；在4°C春化2天后，置于 22°C、16h/8h光暗交替的光照培養(yǎng)箱中垂直培養(yǎng)； (3) 將在-Mo培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周后的根系較短的幼苗選出，轉(zhuǎn)移到+Mo培養(yǎng)基上；在 22°C、16h/8h光周期的光照培養(yǎng)箱中垂直培養(yǎng)4-5天后，把根系伸長較好的幼苗再轉(zhuǎn)移 到-Mo培養(yǎng)基上；同樣條件下培養(yǎng)一周后，將根系生長停滯或幾乎不生長的幼苗移栽到充 滿蛭石的石棉上，在溫室中生長至開花結(jié)實，單株收獲擬南芥種子M3 ; ⑷再將步驟⑶所得的擬南芥種子M3消毒后，分別取5粒接種于-Mo和+Mo培養(yǎng)基 上在22°C、16h/8h光周期的光照培養(yǎng)箱中同時垂直培養(yǎng)進行第二次篩選，若在-Mo培養(yǎng)基 上根生長較短，而在+Mo培養(yǎng)基上根生長較長，則該植株為Mo敏感的擬南芥變異株； (5)將篩選出的Mo敏感變異株，移栽到充滿蛭石的石棉上，在溫室中生長至開花結(jié) 實，單株收獲擬南芥種子M4 ;將每個單株收獲的M4種子取10粒消毒后分別接種于含OnM、 1. 7nM、170nM Mo的+Mo培養(yǎng)基中，以Col-Ο野生型種子為對照，通過比較其根系的長度和形 態(tài)以及葉片的生長情況分析，進一步驗證其為Mo敏感的擬南芥變異株； 所述+Mo培養(yǎng)基組分為每升+Mo培養(yǎng)基中含有1. 75mM磷酸鈉緩沖液（pH5. 8)、1. 5mM MgS04、2.0mM Ca(N03)2、3.0mM ΚΝ03、67μΜ Na2EDTA、8.6yM FeS04、10.3yM MnS04、30yM Η3Β04、1·0μΜ ZnS04、24nM(NH4)6M〇70 24、130nM CoCl2、lyM CuS04 母液各 5ml，鹿糖 10g，結(jié)冷 膠5g,余量為水，pH為5. 8。 所述-Mo固體培養(yǎng)基為去除（NH4)6M〇7024成分的+Mo培養(yǎng)基組分。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種擬南芥Mo敏感變異株的篩選方法，其特征在于，所述步 驟（1)中擬南芥M2種子消毒處理是指將擬南芥M2種子先用質(zhì)量分數(shù)75%的酒精浸泡30s， 然后在質(zhì)量分數(shù)1 %次氯酸鈉中浸泡lOmin，最后用無菌去離子水沖洗5-6次。
【文檔編號】A01H1/06GK104145811SQ201410406815
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月18日
【發(fā)明者】高俊山, 巫飛飛, 沈知臨, 孟艷, 蔡永萍, 林毅 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學