控制白菜型油菜多室角果基因BrCLV3的克隆及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于農(nóng)作物分子育種【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及一種控制白菜型油菜多室角果基因BrCLV3的克隆與應(yīng)用。該基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，序列全長3527bp，包含3個外顯子，2個內(nèi)含子，編碼94個氨基酸。該基因編碼的蛋白質(zhì)具有信號肽和CLE motif，其蛋白質(zhì)的序列如SEQ ID NO：2所示。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得BrCLV3轉(zhuǎn)化擬南芥clv3-2突變體的植株，7個株系能將突變體的多室角果恢復(fù)成兩室。同時，體外多肽(SEQ ID NO：2所示)處理實驗發(fā)現(xiàn)BrCLV3多肽的第9位脯氨酸突變成亮氨酸后喪失了對植株的抑制能力。本發(fā)明克隆的基因為油菜產(chǎn)量育種提供了新的基因資源。
【專利說明】控制白菜型油菜多室角果基因 BrCLV3的克隆及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及油菜分子育種【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及到一種控制白菜型油菜多室角果性 狀的基因 BrCLV3的克隆及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 油菜是十字花科（Cruciferae)重要的油料作物，其角果通常由兩心皮的雌蕊 發(fā)育而來，角果內(nèi)被假隔膜分為兩室、種子著生于其中，外被兩片殼狀果瓣。在自然界 中也發(fā)現(xiàn)了一些多室油菜突變體，其角果由多心皮雌蕊發(fā)育而成，角果內(nèi)被假隔膜分為 三室、四室或五室，外被3-5片殼狀果瓣。這種自發(fā)突變材料在白菜型油菜（Brassica rapa，AA，2n = 2x = 20)中較為常見，如印度黃籽沙遜多室油菜和西藏桑日白油菜 (Mohammad et al, 1942, Indian Journal of Genetics and Plant Breeding 2.112-127 ； 何余堂等，2003, Chinese Journal of Oil Crop Sciences 25. 1-4);在芥菜型油菜 (B. juncea, AABB, 2n = 4x = 36)中也同樣存在，如山西的三筒油菜、貴州的四輪油菜、青 海的多室油菜和四川的四棱油菜等（劉后利，2000, China Agricultural University Press)。已有的研究表明，角果多室性狀對油菜育種是一種有利突變：（1)多室材料具有 較多的每角果粒數(shù)，并導(dǎo)致其單株產(chǎn)量顯著高于相應(yīng)的兩室油菜，因此多室油菜的多粒特 性在油菜的高產(chǎn)育種中具有一定的應(yīng)用潛力（Varshney等，1987, Euphytica 36. 541-544 ; Katiyar 等，1998，Plant Breeding 117.398-399 ;朱彥濤等，2012,Chinese Journal of Oil Crop Sciences 34. 321-325) ; (2)多室角果的抗裂角性較強（Kadkol and Halloran, 1986, Can J Gene Cytol 28 (3) :365-373;朱彥濤等，2012, Chinese Journal of Oil Crop Sciences 34. 321-325)，可用于抗裂角的研究和育種。目前，一些研究者 通過種間雜交和人工選擇的方法將白菜型油菜中的多室性狀轉(zhuǎn)育到芥菜型和甘藍型油 菜（B. napus, AACC, 2n = 4x = 38)中，獲得了穩(wěn)定遺傳的多室材料，并實現(xiàn)了每角果粒 數(shù)和單株產(chǎn)量的顯著增加 （Katiyar et al·，1998, Plant Breeding 117. 398-399;代秉 勵等，2004，作物研究，18(1) :45-47 ;Choudhary and Solanki, 2007, Plant Breeding 126, 104-106)。因此，多室油菜作為一種新的種質(zhì)資源，闡明其形成的遺傳和分子機理不僅 可以豐富油菜花器官形態(tài)建成的理論，也有助于油菜高產(chǎn)新品種的培育。
[0003] 針對多室性狀形成的遺傳機制，研究者在不同類型油菜的多室材料中開展了 一些初步工作。一般認為，白菜型油菜中的多室/兩室相對性狀受到1對主效核基 因的控制，兩室性狀對多室性狀表現(xiàn)為完全顯性，且無細胞質(zhì)效應(yīng)的影響（Mohammad et al., 1942, Indian Journal of Genetics and Plant Breeding 2, 112-127 ； Varshney,1987Euphytica 36, 541-544;何余堂等，2003, Chinese Journal of Oil Crop Sciences 25, 1-4);而芥菜型油菜中的多室/兩室相對性狀受到I對主效核基因或2對 獨立遺傳的主效核基因 （Choudhary and Solanki, 2007, Plant Breeding 126, 104-106)的 控制，同樣兩室性狀對多室性狀表現(xiàn)為完全顯性，且無細胞質(zhì)效應(yīng)的影響。最近，Xiao等 (2013)和Xu等（2013)分別對芥菜型油菜中A7染色體上的多室基因開展了精細定位的 工作（Xiao et al·，2013, Molecular Breeding 32,373_383;Xu et al·，2014, Molecular Breeding 33,425-434) ;Paritosh等也將白菜型油菜中的多室基因定位于A4染色體上 (Paritosh et al·，2013, BMC Genomics 14, 463)，但是到目前為止油菜中還沒有多室基因 被分離克隆的研究報道。
[0004] 本發(fā)明所涉及的BrCLV3基因位于白菜型油菜A4染色體上，編碼一個與莖頂端分 生組織調(diào)控和多室角果形成的CLV3多肽信號分子，發(fā)明人利用圖位克隆、植物遺傳轉(zhuǎn)化以 及體外多肽處理相結(jié)合的方法分離克隆了該基因。BrCLV3基因?qū)τ谟筒水a(chǎn)量性狀的改良具 有巨大的應(yīng)用潛力和前景，為油菜產(chǎn)量育種提供新的基因資源。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明從白菜型油菜中分離克隆一個位于A4染色體上的控制角果多室性狀的基 因，該基因具有提高油菜產(chǎn)量的潛能， 申請人:將該基因命名為BrCLV3基因。
[0006] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0007] 本發(fā)明利用白菜型油菜黃桿沙遜（B. rapa var. yellow sarson)多室突變體ml4 和白菜型油菜黃籽沙遜兩室野生型wt (見文獻：何余堂等.PCR步行法克隆油菜自交不親和 基因.中國油料作物學(xué)報，2005, 26(4) : 1-5)作為親本進行正反交，根據(jù)正反交Fl的角果 表型以及F2代多室角果的分離，確定該材料中多室性狀受一個隱性核基因控制。利用隨機 F2群體將該多室基因初步定位于A4染色體上。隨后從6771株F2中挑選出1704個具有多 室表型的單株，進行重組單株的篩選，最終將多室基因定位于分子標記DXP63和DXP94間的 38. 6kb的范圍內(nèi)。通過對該區(qū)間的基因進行預(yù)測，確定了其中一個編碼擬南芥CLV3多肽信 號的同源基因 Bra034340為候選基因，并將其命名為BrCLV3。該候選基因共編碼94個氨基 酸，具有N端的信號肽和C端保守的結(jié)構(gòu)域CLE motif。通過比較測序發(fā)現(xiàn)，相對于兩室材 料（包括wt和白菜Chiifu)的基因型，ml4多室突變體的基因型在CLE motif中存在一個 C/T的點突變，導(dǎo)致CLE motif的第9位脯氨酸突變成亮氨酸。為了驗證BrCLV3基因的功 能，一方面利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)分別將BrCLV3和Brclv3突變等位基因轉(zhuǎn)化擬南芥clv3-2突變 體，發(fā)現(xiàn)BrCLV3轉(zhuǎn)基因株系能夠恢復(fù)擬南芥clv3-2突變體的多室角果表型，而Brclv3突 變等位基因的轉(zhuǎn)基因家系不能恢復(fù)擬南芥clv3-2突變體的多室角果表型。另一方面，根據(jù) 兩種BrCLV3等位基因的CLE功能域分別合成多肽，對擬南芥和油菜幼苗進行處理，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)野生型BrCLV3多肽能夠顯著抑制植株的主根、根和莖的頂端分生組織的生長，而突變 型的BrCLV3^ 9多肽不能發(fā)揮這種抑制作用。
[0008] 申請人:通過圖位克隆獲得一個控制白菜型油菜多室性狀的基因 BrCLV3,它的核苷 酸序列如序列表SEQ ID NO: 1中1-3527位所示。
[0009] 上述控制白菜型油菜多室性狀的基因 BrCLV3,它的編碼蛋白質(zhì)具有N端的信號肽 和C端的保守結(jié)構(gòu)域CLE motif,其蛋白質(zhì)的序列如序列表SEQ ID NO :2所示。
[0010] 一種人工合成的控制白菜型油菜多室性狀的多肽，其蛋白質(zhì)的序列如序列表SEQ ID NO :2 所示。
[0011] 本發(fā)明的實施效果表明，上述序列表SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2所示的基因可 在油菜的多室角果性狀改良中的應(yīng)用。
[0012] 上述人工合成多肽也能應(yīng)用于油菜的多室角果性狀改良中。
[0013] 本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0014] (1)本發(fā)明首次在油菜中克隆了一個控制多室角果形成的基因。為油菜的高產(chǎn)育 種特別是為油菜的多室角果性狀的改良提供了新的基因資源，也為其它作物利用同源序列 法克隆相關(guān)基因提供了基因序列。
[0015] (2)本方面結(jié)合植物的遺傳轉(zhuǎn)化和體外多肽的處理方法，快速高效地實現(xiàn)多室基 因的功能驗證，為其它作物中克隆相關(guān)基因提供了技術(shù)借鑒。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 序列表SEQ ID NO :1是本發(fā)明分離克隆的BrCLV3基因組序列（其中包括BrCLV3 基因編碼序列），序列長度為3527bp ;編碼序列（CDS)分別為2297-2360bp ;2447-2493bp ; 672-2842bp ;起始密碼子是2297-2299bp ;終止密碼子是2843-2845bp。
[0017] 序列表SEQ ID NO :2是BrCLV3基因的蛋白質(zhì)的序列（也是本發(fā)明人工合成的特 異性多肽），編碼94個氨基酸。
[0018] 圖1.本發(fā)明的技術(shù)流程圖。
[0019] 圖2.白菜型油菜黃桿沙遜（B. rapa var. yellow sarson)多室突變體ml4的顯微 觀察。圖中標記：圖2中A :不同發(fā)育時期的兩室親本wt和多室突變體ml4的雌蕊橫切片 (bar = 10 μ m)。圖2中B :不同發(fā)育時期wt和ml4的莖頂端分生組織（SAM)的觀察。從 左至右分別為胚胎時期SAM的微分干涉顯微鏡觀察（bar = 10 μ m)、IOd幼苗的SAM和主花 序SAM的縱切片（bar = 10 μ m)、主花序SAM的掃描電鏡照片（bar = 100 μ m)。
[0020] 圖3.隨機F2定位群體中單株多室角果比例的頻率分布。白菜型油菜黃籽沙遜 (B. rapa var. yellow sarson)兩室和白菜型油菜黃桿沙遜（B. rapa var. yellow sarson) 多室單株的分離比例符合3:1 ( x 2 = 2. 48, P>0. 05)。
[0021] 圖4.白菜型油菜多室基因 BrCLV3的初步定位于白菜型油菜A4染色體上。圖中 標記：圖譜左側(cè)數(shù)字代表標記間遺傳距離。
[0022] 圖5.白菜型油菜多室基因 BrCLV3的精細定位。標記之間的數(shù)字代表各標記與多 室基因間的重組單株數(shù)，黑點代表預(yù)測基因的位置。
[0023] 圖6. BrCLV3的基因結(jié)構(gòu)以及兩親本等位基因間的堿基變異。圖中標記：A，黑色方 塊表示基因編碼區(qū)、ATG和TAA分別標記起始密碼子和終止密碼子的位置。通過對兩個親 本的BrCLV3基因區(qū)域（包括基因編碼區(qū)、2. 3kb的啟動子區(qū)和2. 5kb的3,端側(cè)翼序列）進 行比較測序，發(fā)現(xiàn)它們間存在3個單核苷酸突變和一個ATAT的插入/缺失。B，BrCLV3氨 基酸序列比較。箭頭前面的為信號肽，下劃線為CLE motif，黑色背景標示脯氨酸/亮氨酸 變異。
[0024] 圖7.是本發(fā)明應(yīng)用的常用商業(yè)載體pMDC32結(jié)構(gòu)示意圖。
[0025] 圖8. 35S: :BrCLV3載體轉(zhuǎn)化擬南芥clv3_2突變體的轉(zhuǎn)基因植株表型。圖中標記： 圖8.中A，擬南芥Ler;圖8中B，突變體clv3-2;圖8.中C-E，苗期具有不同表型的轉(zhuǎn)基因 家系，包括能形成正常SAM的株系（圖8.中C)、SAM的缺失和葉片畸形的株系（圖8.中 AD)以及植株叢生的株系（圖8.中AE);圖8中F，Ler的花序；clv3-2突變體的花序；轉(zhuǎn)基 因株系；圖8中I，轉(zhuǎn)基因株系能產(chǎn)生兩室角果；圖8中J :轉(zhuǎn)基因植株的BrCLV3基因表達 量檢測，分別提取7個轉(zhuǎn)基因株系IOd幼苗的總RNA，18S rRNA為內(nèi)參基因。圖8中K，轉(zhuǎn)基 因家系、Ler和clv3-2突變體的角果心皮數(shù)目的統(tǒng)計。大寫字母代表0. Ol水平下的差異 顯著性。
[0026] 圖9.多肽處理對擬南芥和白菜型油菜的SAMs大小的影響。
[0027] 圖10.是本發(fā)明制備的重組遺傳表達載體35S:BrCLV3(全長12305bp)結(jié)構(gòu)示 意圖。其中BrCLV3為白菜型油菜多室基因的野生型等位基因，其序列如序列表SEQ ID NO :1所示。依據(jù)基因命名一般慣例，將白菜型油菜多室基因的兩種基因型分別命名為 BrCLV3(野生型基因型）和Brclv3(突變體基因型），其中BrCLV3為顯性等位基因型， Brclv3為隱性等位基因型。
[0028] 圖11是本發(fā)明制備的重組遺傳表達載體35S:Brclv3 (全長12305bp)結(jié)構(gòu)不意 圖。其中Brclv3為白菜型油菜多室基因的突變體等位基因，相比野生型基因型BrCLV3,其 序列在第三個外顯子的第116位的堿基C已替換成堿基T。

【具體實施方式】
[0029] 根據(jù)圖1所述的技術(shù)路線，以白菜型油菜黃籽沙遜多室突變體（B.rapa var. yellow sarson)的（文獻見后，本發(fā)明該突變體命名為ml4)和兩室野生型wt作為材料進 行突變表型的比較觀察，同時以它們?yōu)橛H本進行雜交和自交，獲得正反交Fl和F2群體，實 現(xiàn)多室性狀的遺傳分析。在此基礎(chǔ)上，利用隨機F2群體將多室基因初步定位于A4染色體 上。隨后擴大F2定位群體（6771株），利用新開發(fā)的SSR和SNP標記進行重組單株的篩選， 最終將多室基因定位于分子標記DXP63和DXP94間的38. 6kb的范圍內(nèi)。通過對該區(qū)間的 基因進行預(yù)測，確定了其中一個編碼擬南芥CLV3多肽信號分子的同源基因（基因登錄號 At2g27250)為候選基因，并將其命名為BrCLV3。該候選基因共編碼94個氨基酸，具有N端 的信號肽和C端保守的結(jié)構(gòu)域CLE motif。通過對ml4和wt的比較測序，同時結(jié)合已發(fā)表的 白菜Chiifu (兩室表型）基因組序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多室突變體相對于兩室材料，它們的BrCLV3 基因型僅在CLE motif中存在一個C/T的點突變，導(dǎo)致CLE motif的第9位脯氨酸突變成 亮氨酸。為了驗證BrCLV3基因的功能，一方面利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)分別將BrCLV3和Brclv3突 變等位基因轉(zhuǎn)化擬南芥clv3-2突變體，發(fā)現(xiàn)BrCLV3的轉(zhuǎn)基因株系能夠恢復(fù)擬南芥clv3-2 突變體的多室角果表型，而Brclv3突變等位基因的轉(zhuǎn)基因家系不能恢復(fù)擬南芥clv3-2突 變體的多室角果表型。另一方面，根據(jù)兩種BrCLV3等位基因的CLE功能域分別合成多肽， 對擬南芥和油菜幼苗進行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型BrCLV3多肽能夠顯著抑制植株的主根、根 和莖的頂端分生組織的生長，而突變型的BrCLV3^ 9多肽不能發(fā)揮這種抑制作用。
[0030] 以下實施例進一步定義本發(fā)明，并描述了 BrCLV3基因的分離克隆及功能驗證。
[0031] 實施例1 :多室突變材料的表型觀察和多室基因的遺傳分析
[0032] 1.多室突變體的角果相關(guān)性狀觀察
[0033] 以白菜型油菜黃籽沙遜的多室突變體（拉丁文命名：B. rapa var. yellow sarson ; 參見文獻 I :G.P.KADK0LAN D G.M.HALL0RAN 等，Inheritance of siliqua strength in Brassica campestris L.I. Studies of Fz and backcross populations, CAN. J. GENET. CYT0L. VOL. 28, 1986 ;P365-373 和文獻 2 :S.K.VARSHNEY 等，INHERITANCE OF SILIQUA CHARACTERS IN INDIAN COLZA I. LOCULE NUMBER AND SILIQUA POSITION，Euphytica 36 (1987) 541-544,本發(fā)明將該突變體命名為ml4,本發(fā)明命名的該突變體的材料與文獻I 和2報道的用拉丁文命名的生物材料為同一個生物材料；或參見劉后利著，《油菜的遺傳 育種學(xué)》，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，北京，2000版）以及白菜型油菜黃籽沙遜兩室野生型材料 wt(wt是本發(fā)明對該材料的命名）作為材料進行突變表型的比較觀察，統(tǒng)計它們的單株多 室角果比例、角果長度、每角果粒數(shù)和百粒重等性狀。性狀的測定方法如下：單株多室角果 比例是在角果成熟時收獲全株角果，統(tǒng)計多室角果所占比例；在每個植株上隨機取30個 角果測量角果長度和每角果粒數(shù)；成熟的油菜籽粒自然干燥4周以上，從每個單株中隨機 選取100粒飽滿籽粒進行稱重，重復(fù)測定3次，取其平均數(shù)為該單株的百粒重。根據(jù)性狀考 察結(jié)果可知（表1)，多室突變體（ml4)相對于兩室親本（Wt)，角果長度極顯著變短，每角果 粒數(shù)極顯著增加，百粒重?zé)o顯著差異。
[0034] 表1白菜型油菜多室和兩室親本及其正反交Fl的性狀表現(xiàn)
[0035]

【權(quán)利要求】
1. 一種分離的控制白菜型油菜多室性狀的基因 BrCLV3,它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1 中 1-3527 位所示。
2. -種分離的控制白菜型油菜多室性狀的基因 BrCLV3,它的編碼蛋白質(zhì)具有N端的信 號肽和C端的保守結(jié)構(gòu)域CLE motif，其蛋白質(zhì)的序列如序列表SEQ ID NO :2所示。
3. -種人工合成的控制白菜型油菜多室性狀的多肽，其蛋白質(zhì)的序列如序列表SEQ ID NO :2所示。
4. 權(quán)利要求1或2所述的基因在油菜的多室角果性狀改良中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求3所述的多肽在油菜的多室角果性狀改良中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01H5/00GK104263736SQ201410424079
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月26日
【發(fā)明者】范楚川, 周永明, 武語笛, 楊慶勇 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)