一種蘇云金芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶的突變酶制備及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種蘇云金芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶Chi9602的突變酶制備及其應用，步驟為：對幾丁質(zhì)酶Chi9602基因進行同源建模和分子對接，選取突變位點；采用重疊延伸PCR進行定點突變，獲得突變酶基因chiw50a；突變酶基因回收后，經(jīng)Bgl II和Pst I雙酶切，連接到表達載體pTrcHis B上，構(gòu)建質(zhì)粒pMB581；將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主細胞中，經(jīng)IPTG誘導表達、親和層析純化制備突變酶ChiW50A。該突變酶較原始酶的酶比活提高了62.3％達到了83.46U/mg，最適pH為7.0，且在pH 9.0仍然具有高酶比活(54.69U/mg)，可用于生物防治植物病蟲害，具有明顯的抗真菌和殺蟲增效作用。
【專利說明】一種蘇云金芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶的突變酶制備及其應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種蘇云金芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶突變酶的制備 及其生防應用。該突變酶是一種來源于蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)的幾 丁質(zhì)酶Chi9602經(jīng)過基因定點突變、重組載體構(gòu)建、載體原核表達和純化后制備的。

【背景技術(shù)】
[0002] 幾丁質(zhì)（chitin)廣泛存在于甲殼類動物的外殼、昆蟲的甲殼、線蟲及其卵和 真菌的胞壁中。其蘊藏量在地球上的天然高分子中占第二位，估計每年自然界生物的 合成量可達1X10 11噸，僅次于纖維素（微生物幾丁質(zhì)酶研究進展，安徽農(nóng)業(yè)科學[J] (2010)38(22) :11685-11688)。
[0003] 幾丁質(zhì)酶是可以降解幾丁質(zhì)的糖基水解酶，被廣泛地發(fā)現(xiàn)于細菌、植物和動物 (From bacteria to human:A journey into the world of chitinases. Biotechnology Advances (2013) 31:1786 - 1795)。大多數(shù)的幾丁質(zhì)酶屬于糖基水解酶18和19家族。其中 糖基水解酶18家族的幾丁質(zhì)酶具有典型的TIM-桶狀（（β α ) 8桶）結(jié)構(gòu)和"DXDXE"模序。 模序中的谷氨酸殘基（Ε)能促使幾丁質(zhì)中的β (1-4)糖苷鍵斷裂，并將其水解成單個Ν-乙 醜葡萄糖胺（Structure of the D142N mutant of the family 18 chitinase Chi B from Serratia marcescens and its complex with allosamidin. Biochimica et Biophysica Acta(2004) 1696:103 - 111)。
[0004] 幾丁質(zhì)酶可以通過水解真菌細胞壁的幾丁質(zhì)可有效的抑制真菌的生長。因此它 可以應用于防治真菌病害。幾丁質(zhì)是昆蟲中腸圍食膜的主要結(jié)構(gòu)成分。它是昆蟲抵御藥 物的屏障，但是被幾丁質(zhì)酶破壞后，殺蟲劑能更有效發(fā)揮作用（Chitinases in biological control.Birkhauser Verlag Basel/Switzerland(1999)pp. 171-184)。同時幾丁質(zhì)也是線 蟲及其卵的組成成分。因此，幾丁質(zhì)酶在生物防治病害真菌和植物害蟲具有重要的用途。
[0005] 作為一種重要的生物防治資源，蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis簡稱 BT)制劑，已成功用于多種害蟲的生物防治，例如：殺棉鈴蟲和殺線蟲等。并且在減少化學 殺蟲劑的污染和在植物保護中起到了重要作用。由于幾丁質(zhì)酶在BT的分布有所差異。因 此研究BT幾丁質(zhì)酶可以擴大BT制劑的使用范圍，且能進一步提高其殺蟲活性（蘇云金芽 孢桿菌幾丁質(zhì)酶的研究進展，微生物學通報[J] (2007)34(1): 143-147)。實際應用中，由于 昆蟲中腸道存在堿性環(huán)境，所以擁有堿性幾丁質(zhì)酶活性的BT幾丁質(zhì)酶將具有更高效的殺 蟲活性。
[0006] 許多關(guān)于細菌幾丁質(zhì)酶的研究表明，定點突變改變氨基酸殘基能導致酶的性質(zhì)的 改變。運用基因工程和蛋白質(zhì)工程的方法對細菌幾丁質(zhì)酶進行定向進化，可以得到幾丁質(zhì) 酶比活提高的突變酶。該突變酶制劑比原始酶更加適合用于殺蟲和抗真菌等多效生防應 用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于運用基因工程和蛋白質(zhì)工程的方法對細菌幾丁質(zhì)酶進行定向 進化，提出一種蘇云金芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶突變酶，其氨基酸序列SEQ ID NO. 1如下：
[0008] Mamrsqkftllllslllf lplf ltnfitpnlaladspkqsqkivgyfpsagvygrnyqvadidasklthl nyafadic wngkhgnpsthpdnpnkqtwnckesgvplqnkevpngtlvlgepwadvtksypgsgttwedcdkyarc gnfgel krlkakyphlktiisvggwtwsnrfsdmaadektrkvfaestvaflraygfdgvdldweypgvetipggs yrpedkqn ftlllqdvrnalnkagaedgkqylltiasgasqryadhtelkkisqildwisimtydfhggweatsnh naalykdpndpa antnfyvdgainvytnegvpvdklvlgvpfygrgwkscgkenngqyqpckpgsdgklaskgtwd dystgdtgvyd ygdlaanyvnkngfvrywndtakvpylynattgtfisyddnesmkyktdyiktkglsgamfwelsg dcrtspkyscs gpklldtlvkellggpinqkdtepptnvknivvtnknsnsvqlnwtastdnvgvteyeitageek wstttnsitiknlkp nteykfsiiakdaagnksqptaltvktdeanttppdgngtatfsvtsnwgsgynfsiiikn ngtnpiknwklefdysgnlt qvwdskissktnnhyvitnagwngeippggsitiggagtgnpaellnavisen
[0009] 其特征在于理論分子量為74. 45 kDa，屬于糖基水解酶第18家族，由幾丁質(zhì)酶催 化域 CCD(__Asp452)、類纖連蛋白III型域 Fn3D(eln5Q4_Asn558)和幾丁質(zhì)酶結(jié)合域 CBD(Thrf82_Asn646)三 部分構(gòu)成。保守序列為"DGVDLDWE"。N末端結(jié)構(gòu)域中含有一個由34個氨基酸殘基組成的 信號肽序列 SP(Metl-Ala34) °
[0010] 本發(fā)明同時提供了一種蘇云金芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶突變酶的基因序列SEQ ID N0. 2 如下：
[0011] atggctatgaggtctcaaaaattcacactgctattactatccctactacttttcttacctctttttctc acaaattttattactc caaatctcgcattagcagattcaccaaagcaaagtcaaaaaattgttgggtactttcctt cggcgggcgtttacggacgtaatt atcaagttgctgacattgatgcatcaaaacttactcaccttaactatgcttt cgcggatatttgttggaatggaaaacatggaaa cccttctactcatcctgataatccaaataaacaaacgtggaac tgtaaagaatctggtgtaccattgcaaaataaagaggttcc taatggtactctcgtactcggggaaccatgggctg atgttaccaaatcgtatcctggctcagggacaacttgggaagattgc gataaatatgcccgttgcggaaatttcgg ggaactaaaacgattaaaagctaaatatcctcacttaaaaacaattatttccgttg gtggctggacttggtctaac cgcttttctgatatggccgctgatgaaaaaacaagaaaagtatttgctgaatctacagtagcttt tcttcgcgcat atgggtttgatggcgtagatttagactgggaatatccgggcgttgaaacgattcctggtggtagttatcgtcct ga agacaaacaaaatttcactctccttcttcaagacgtccgaaatgctttgaataaagcaggtgctgaagatggcaaac aata tttactaacaatcgcttcaggtgcaagccaacgctacgctgatcatacagaactaaagaaaatttctcaaat actcgattggat tagtattatgacatatgatttccacggcggatgggaagctacttctaatcataatgcagctcta tataaggatccaaatgatcca gcagcaaatacgaatttttacgtagatggtgctataaatgtttatacaaatgaag gtgttccagtcgataaactagtattaggcg tacccttttacggacgtggctggaaaagttgtggcaaagaaaataa cggacaatatcaaccttgcaaaccaggtagtgatgg gaaacttgcttctaaaggtacttgggatgattactctacc ggtgacacaggtgtctatgattacggtgatttagcagccaattac gttaataaaaatggttttgtacgctactgga atgacacagctaaagtaccttacttatataatgcaactacaggcacatttattag ctacgatgacaatgaatctat gaaatacaaaacagactatataaagacgaaaggtttaagtggagcaatgttttgggaactaa gcggagattgccgt acaagtccaaaatatagttgcagtggtccaaaattacttgatacgctagtaaaagaattacttggtgga cctatta atcaaaaagatactgagccaccaacgaatgttaaaaacattgtagttacgaataaaaattcaaactcagttcaatta a actggactgcatctactgataacgtaggagttacggaatatgaaattactgctggagaagagaaatggagtacaa caacaa atagcattacaattaaaaacttaaaacctaatacggaatacaaattttcaataattgccaaagatgctgc tggaaataaatcaca acctaccgctcttactgtcaaaacggatgaagctaatacgacacctcctgatggaaatggt actgctacattttcagtcacttc gaattggggcagcggttataacttctcgattataatcaaaaataatggaacga accctattaaaaattggaaattagaatttgat tatagcggcaatttaacacaagtttgggattctaaaattagtag taaaacaaataatcattatgtaattacgaacgcaggatgg aatggtgaaattcctcctggtggatctattacaatt ggcggtgcaggaacaggtaatcctgccgaacttttaaatgccgtcatt agcgaaaactag
[0012] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，制備蘇云金芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶（Chi9602)的突變酶的制備 步驟為：
[0013] (1)對幾丁質(zhì)酶Chi9602基因進行同源建模和分子對接，選取50位色氨酸作為突 變位點。
[0014] (2)采用重疊延伸PCR進行定點突變，突變反應分為兩步。第一步，擴增突變位點 兩端的基因序列，得到相互之間有重疊片段的兩組PCR產(chǎn)物；第二步，將兩組PCR產(chǎn)物作為 模板進行下一輪PCR擴增，得到需要的目的片段。所述的目的片段不包含N端信號肽序列。 設(shè)計四條引物如下所示：
[0015] 引物 P1 :5' -CAGAGATCTGATTCACCAAAGCAAAGT-3'
[0016] Bgl II
[0017] 引物 P2 :5' -CAGCTGCAGCTAGTTTTCGCTAATGACG-3'
[0018] Pst I
[0019] 引物 P3 :5' -TGGGTACTTTCCTTCGGCGGGCGTTTACGGACGTAA-3'
[0020] 引物 P4 :5, -GCCGAAGGAAAGTACCCAACAATTTTTTGACTTTGC-3'
[0021] 以 Bacillus thuringiensis subsp. tenebronis 9602 菌株的總 DNA 為 PCR模板， 使用引物P1和P2完成第一輪PCR反應。將擴增得到的chi9602片段用Bgl II和Pst I 進行雙酶切后，連接到同樣用Bgl II和Pst I雙酶切回收后的表達載體pTrcHis B上。將 此質(zhì)粒命名為PMB332。
[0022] 以含有chi9602片段的pMB332為模板，采用重疊延伸PCR技術(shù)第一輪PCR反應。 完成第50位氨基酸的定點突變，獲得幾丁質(zhì)酶突變酶基因 W50A。所述的重疊延伸PCR技 術(shù)如圖1所示。所獲得突變序列回收后，使用Bglll和PstI進行雙酶切后，連接到同樣用 Bgl II和Pst I雙酶切回收后的表達載體pTrcHis B上。將此質(zhì)粒命名為pMB581。
[0023] (3)對質(zhì)粒序列進行測序后，與chi9602基因進行比較。pMB581質(zhì)粒為含有突變 酶基因的原核表達重組載體，其突變酶命名為ChiW50A，其氨基酸序列SEQ ID NO. 1所示。
[0024] (4)用包含上述突變酶基因的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，制備重組菌株，其中重組載 體中原核表達載體為PTrcHis B，宿主細胞為大腸桿菌Escherichia coli T0P10。
[0025] (5)培養(yǎng)重組菌株，誘導突變酶ChiW50A表達。
[0026] (6)將表達后的突變酶ChiW50A回收并采用親和層析純化制備突變酶ChiW50A。
[0027] 經(jīng)測試，本發(fā)明的突變酶ChiW50A的生物活性明顯高于幾丁質(zhì)酶Chi9602,見附圖 3。該突變酶ChiW50A較原始酶Chi9602比活提高了 62. 3%。
[0028] 將本發(fā)明的突變酶ChiW50A用于植物的生物防治病蟲害上，具有明顯的增效作 用。
[0029] 采用對峙法測定突變酶ChiW50A對水稻紋枯病菌生長的抑制實驗，結(jié)果說明其對 水稻紋枯病菌生長具有明顯的抑制作用，見附圖4。
[0030] 將含有突變酶ChiW50A的YBT-1520孢晶混合物用于殺棉鈴蟲具有增效作用，見實 施表1。
[0031] 將含有突變酶ChiW50A的YBT-020孢晶混合物用于殺線蟲具有增效作用。見附圖 5 〇
[0032] 本發(fā)明具有明顯的效果。本發(fā)明突變酶ChiW50A比原始酶Chi9602的生物活性有 很大的提高，用在生物防治病蟲害上，具有很好的增效作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1重疊延伸PCR示意圖。
[0034] 圖2幾丁質(zhì)酶基因 Chi9602的定點突變、原核表達載體的構(gòu)建和表達轉(zhuǎn)化。
[0035] (a) pTrcHi sB ; (b) PCR 產(chǎn)物瓊脂糖電泳；（c)重組質(zhì)粒 pMB581 ;
[0036] (d) pMB581 雙酶切驗證；（e)大腸桿菌 T0P10 ; (f) SDS-PAGE (泳道 Ml:核酸 Maker 1 ;泳道M2:核酸Maker 2 ;泳道M3:蛋白Maker 3 ;泳道1:PCR產(chǎn)物；泳道2:Bgl II單酶切； 泳道3:Pst I單酶切；泳道4:Bgl II/Pst I雙酶切；泳道5:MB581;泳道6:MB581+IPTG;泳 道7:Ni柱純化的突變酶ChiW50A)
[0037] 圖3幾丁質(zhì)酶Chi9602和突變酶ChiW50A酶學性質(zhì)。
[0038] (a)不同溫度對純化的幾丁質(zhì)酶Chi9602和突變酶ChiW50A酶比活的影響。
[0039] (b)不同pH對純化的幾丁質(zhì)酶Chi9602和突變酶ChiW50A酶比活的影響。
[0040] 圖4純化的突變酶ChiW50A抑制水稻紋枯病菌生長。
[0041] (a) PBS 對照；（b) 2. 5 μ g 的突變酶 ChiW50A ;
[0042] (c) 5· 0 μ g 突變酶 ChiW50A ; (d) 7· 5 μ g 突變酶 ChiW50A。
[0043] 圖5YBT-020胞晶混合物和制備的突變酶W50A復配殺L4期秀麗隱桿線蟲N2增效 作用。

【具體實施方式】
[0044] 下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明做詳細具體的說明，但是本發(fā)明的保護范圍不限于以 下實例。
[0045] 本實例中Bacillus thuringiensis subsp. tenebronis 9602菌株、原核表達載體 pTrcHis B和大腸桿菌Escherichia coli T0P10來自于華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物重點實驗 室。限制性內(nèi)切酶和連接酶來自于Invitrogen公司。幾丁質(zhì)來源于Sigma公司，其他均為 國產(chǎn)分析級試劑。
[0046] 本實例中LB培養(yǎng)基配方如下：10. Og/L蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L氯化鈉 ，pH 7. 2-7. 4。配制固體LB培養(yǎng)基時向上述配方中加入2%的瓊脂粉。
[0047] PDA培養(yǎng)基配方如下：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L。自然pH。
[0048] PM液體培養(yǎng)基配方如下：葡萄糖10g，胰蛋白胨10g，酵母粉2g，KH2P04lg， K2HP04lg, MgS04 · 7H20 0. 02g, FeS04 · 7H20 0. 02g, ZnS04 · 7H20 0. 02g, MnS04 · 7H20 0. 02g, 用蒸饋水定容至1L。氯化鈉3. 0g,蛋白胨2. 5g,瓊脂粉17g,用蒸饋水定容至975mL,高壓滅 菌，待其溫度降到55°C時，加入lmL lMCaCl2，lmL 1M MgS04，lmL Smg.mL-1膽固醇（用無水 乙醇溶解），25mL 1M磷酸鉀緩沖液（KH2P04108 . 3g，K2HP0435. 6g，用蒸餾水定容至1L。
[0049] 緩沖液 I :0· 5M NaH2P0419ml、0. 5M Na2P0481ml、NaCl 29. 3g，加水定容至 1L。
[0050] 緩沖液 II :0· 5M NaH2P0419ml、0. 5M Na2HP0481ml、NaCl 29. 3g 和咪唑 34g，定容至 lL〇
[0051] PBS緩沖液：8g氯化鈉，0. 2g氯化鉀，1. 44g磷酸氫二鈉，0. 24g磷酸二氫鉀，蒸餾 水定容至1L。
[0052] 蘇云金芽孢桿菌YBT-1520胞晶混合物的制備方法：YBT-1520接種于PM液體培養(yǎng) 基28°C 200rpm搖床培養(yǎng)3天，8000rpm離心收集，冷凍干燥制成YBT-1520胞晶混合物。
[0053] 蘇云金芽孢桿菌YBT-020胞晶混合物的制備方法：YBT-020接種于PM液體培養(yǎng)基 28°C 200rpm搖床培養(yǎng)3天，8000rpm離心收集，冷凍干燥制成YBT-020胞晶混合物。
[0054] 上述的蘇云金芽孢桿菌YBT-1520是華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室分離對 棉鈴蟲、小菜蛾等鱗翅目昆蟲具有高毒的菌株。
[0055] 上述的蘇云金芽孢桿菌YBT-020是華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室分離對 線蟲具有高毒的菌株。
[0056] 本實例中未作詳細說明的分子實驗方法，參照《分子實驗指南》第三版，或者參照 試劑盒說明書進行。
[0057] 實施例1制備定點突變方法如下：
[0058] 用獲取的 Bacillus thuringiensis subsp. tenebronis 9602 菌株幾 丁質(zhì)酶 Chi9602基因進行同源建模和分子對接，并將突變位點設(shè)計為50位色氨酸替換為丙氨酸。 涉及引物如下所示：
[0059] 引物 P1 :5' -CAGAGATCTGATTCACCAAAGCAAAGT-3'
[0060] Bgl II
[0061] 引物 P2 :5' -CAGCTGCAGCTAGTTTTCGCTAATGACG-3'
[0062] Pst I
[0063] 引物 P3 :5, -TGGGTACTTTCCTTCGGCGGGCGTTTACGGACGTAA-3'
[0064] 引物 P4 :5, -GCCGAAGGAAAGTACCCAACAATTTTTTGACTTTGC-3'
[0065] 以 Bacillus thuringiensis subsp. tenebronis 9602 菌株的總 DNA 為模板，使用 引物P1和P2,完成PCR反應。此PCR反應具體條件如下：
[0066] lOxPCRbuITcr 5 μΙ_ 25 mM Mg2- 5 μ? 上下游引物（1〇μΜ) ^ 1 μ? 10 mM dNTPs 2'uL 質(zhì)粒 0.5 μι Γα^?ΝΑ 1 μ? 去離子水 加至50 pL
[0067] 循環(huán)體系如下：
[0068] 9￡?，5 min； 94 C； 1 min； 55 C, 40 see： 72'C, 90 see； ^72'C , 10 min 30個循環(huán)
[0069] 將擴增得到的chi9602片段用Bgl II和Pst I進行雙酶切后，連接到同樣用Bgl II和Pst I雙酶切回收后的表達載體pTreHis B上。將此質(zhì)粒命名為PMB332。
[0070] 以含有chi9602片段的pMB332為模板，采用重疊延伸PCR技術(shù)完成第50位氨基 酸的定點突變，獲得幾丁質(zhì)酶突變酶基因。幾丁質(zhì)酶突變酶基因序列如SEQ ID N0. 2所示。 所述的重疊延伸PCR技術(shù)如圖1所示。所獲得突變序列回收后，使用Bgl II和Pst I進行 雙酶切后，連接到用Bgl II和Pst I雙酶切回收后的表達載體pTreHis B上。將此質(zhì)粒命 名為PMB581。并對序列進行測序后，與chi9602基因進行比較。pMB581質(zhì)粒為含有突變酶 基因的原核表達載體，其表達的突變酶命名為ChiW50A，氨基酸序列SEQ ID NO. 1所示。
[0071] 將含有突變酶ChiW50A基因的原核表達載體PMB581使用轉(zhuǎn)化至宿主細胞大腸桿 菌 Escherichia coli T0P10 中。獲得重組菌株 MB581
[0072] 挑取重組菌單菌落接種于5ml LB培養(yǎng)基中（含氨芐抗生素），37°C，155rpm/min 搖床培養(yǎng)過夜。按1 %的接種量轉(zhuǎn)接入200ml LB培養(yǎng)基中（含氨芐抗生素），37°C，155rpm/ min搖床培養(yǎng)1. 5h左右至菌液稀薄，加入200 μ 1 IPTG，37°C，155rpm/min誘導培養(yǎng)6h。
[0073] 幾丁質(zhì)酶突變酶ChiW50A的親和層析純化：4°C，6000rpm/min離心5min收集菌 體，用20ml PBS(pH7.4)懸浮菌體，分裝到50ml的離心管中。壓力破碎細胞后12000rpm/ min離心20min，上清液備用。取2ml Ni柱用緩沖液I潤洗三次，加入細胞破碎離心上清 液，4°C結(jié)合30min。結(jié)合液加入過濾柱中，用含咪唑10mM的緩沖液II洗脫雜蛋白。用含濃 度咪唑250mM/L的緩沖液II洗脫目的蛋白。
[0074] 蘇云金芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶Chi9602基因成功通過重疊延伸PCR進行定點突變、原 核表達載體的構(gòu)建以及表達及純化。獲得與理論分子量大小相符的74. 5kDa表達產(chǎn)物，即 突變酶ChiW50A。結(jié)果見附圖2。
[0075] 幾丁質(zhì)酶Chi9602和突變酶ChiW50A的酶性質(zhì)分析。
[0076] 幾丁質(zhì)酶酶比活測定：1. 5mL離心管中加入500μ L的幾丁質(zhì)酶溶液，再加入 200 μ L2. 5 %的膠體幾丁質(zhì)溶液，PBS (ρΗ7. 4)補足至lmL，空白對照用500 μ LPBS (ρΗ7. 4)代 替純化的幾丁質(zhì)酶溶液。37°C水浴反應lh，冷卻后，12000rpm/min離心5min，取上lmL清加 入lmL DNS，沸水浴lOmin，冷卻后測定535nm處的吸光值。一個單位的酶活定義為37°C下 lh產(chǎn)生1 μ mol NAG的酶量。
[0077] 幾丁質(zhì)酶穩(wěn)定性測試：分別在不同的反應體系條件下，（pH為3、4、5、6、7、8和9 ; 溫度為 25°C、30°C、35°C、37°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、70°C和 80°C )測定幾丁質(zhì)酶酶 比活。
[0078] 同樣對突變酶ChiW50A進行測試，測試結(jié)果見附圖3。從圖中看出幾丁質(zhì)酶 Chi9602突變酶ChiW50A最適反應溫度為37°C。幾丁質(zhì)酶Chi9602突變酶ChiW50A最適反 應口!1為7.0。該突變酶〇1丨15(^較原始酶〇1丨9602比活提高了62.3%。在？!19.0時，仍 然具有高的酶比活（54. 69U/mg)。將在昆蟲腸道堿性環(huán)境中具有良好降解幾丁質(zhì)的作用。 [0079] 所述的2. 5%膠體幾丁質(zhì)溶液的配制方法如下：2克幾丁質(zhì)（粉末）用預冷的濃 鹽酸45mL溶解，在磁力攪拌器上攪拌好，此時成黃色。攪拌2h后，放入冰箱4攝氏度，靜置 24h。將鹽酸混合液加入到300mL的50%的酒精（預冷好的），攪拌2h，此時為不透明的乳 白色溶液，4000轉(zhuǎn)離心20分鐘，看到乳白色沉淀，用蒸餾水反復洗pH至6. 5左右，或在離心 管中加水，攪拌，離心。最后加入40mL蒸餾水115°C，15min高壓滅菌后保存。
[0080] 所述的DNS溶液的配制：稱取6. 3g 3, 5-二硝基水楊酸，溶于262ml 2mol/L的 NaOH溶液，再將此溶液與500ml含有182g酒石酸鉀鈉的熱水混合，加入5g重蒸酚和5g亞 硫酸鈉，充分攪拌，待冷卻后定容至1L。
[0081] 采用對峙法測定突變酶ChiW50A對水稻紋枯病菌生長的抑制實驗如下：
[0082] 取直徑為5mm的水稻紋枯病菌菌塊接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA)平板中 央，28°C培養(yǎng)2天后，在距離菌絲邊緣2cm處放置滅過菌的濾紙片，將制備的突變酶ChiW50A 和PBS對照分別滴在四周的濾紙片上，其中（a) PBS對照；(b) 2. 5 μ g的突變酶ChiW50A ; (c) 5. 0 μ g突變酶ChiW50A ; (d) 7. 5 μ g突變酶ChiW50A。28°C繼續(xù)培養(yǎng)1天后，觀察突變酶 ChiW50A對水稻紋枯病菌菌絲生長的抑制情況。見附圖4。從圖中看出幾丁質(zhì)酶Chi9602 突變酶ChiW50A對水稻紋枯病菌在PDA平板上生長有明顯的抑制作用。
[0083] 突變酶ChiW50A與YBT-1520胞晶混合物復配殺棉鈴蟲二齡幼蟲生測實驗
[0084] 如下：
[0085] 稱取2g YBT-1520胞晶混合物，加入制備突變酶ChiW50A，用10mM的PBS懸浮，使 突變酶ChiW50A終濃度為35 μ g/mL，樣品總體積為20mL。對照加入BSA，其濃度為35 μ g/ mL;空白只含有YBT-1520,樣品體積為20mL。送樣測定。見附表1。結(jié)果顯示：突變酶 ChiW50A與YBT-1520孢晶混合物以2000:1復配時，YBT-1520殺棉鈴蟲二齡幼蟲的效價提 高了 1145個單位，達到了 4211個單位。
[0086] 表 1
[0087]

【權(quán)利要求】
1. 一種蘇云金芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶Chi9602的突變酶W50A，其特征在于：所述的突變酶 的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述突變酶理論分子量為74. 45kDa，屬于糖基水解酶第 18家族，由幾丁質(zhì)酶催化域CCD (Lys42-Asp452)、 類纖連蛋白III型域Fn3D (Gln504-Asn558) 和幾丁質(zhì)酶結(jié) 合域CBD (Thr582_Asn646) 三部分構(gòu)成；保守序列為"DGVDLDWE"，N末端結(jié)構(gòu)域中含有一個由34個 氨基酸殘基組成的信號肽序列 SP(Metl-Ala34) °
2. -種蘇云金芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶Chi9602的突變酶W50A，其特征在于：所述的編碼基 因序列chiw50a如SEQ ID NO. 2所示；所述的突變酶基因長度為2031bp。
3. -種蘇云金芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶Chi9602的突變酶W50A的制備方法，其特征在于采用 以下步驟： (1) 對幾丁質(zhì)酶Chi9602基因序列進行同源建模和分子對接，選取50位色氨酸作為突 變位點； (2) 采用重疊延伸PCR進行定點突變，突變反應分為兩步。第一步，擴增突變位點兩端 的基因序列，得到相互之間有重疊片段的兩組PCR產(chǎn)物；第二步，將兩組PCR產(chǎn)物作為模板 進行下一輪PCR擴增，得到需要的目的片段，所述的目的片段不包含N端信號肽序列；設(shè)計 四條引物如下所示： 引物 P1 :5' -CAGAGATCTGATTCACCAAAGCAAAGT-3' Bgl II 引物 P2 :5' -CAGCTGCAGCTAGTTTTCGCTAATGACG-3' Pst I 引物 P3 :5' -TGGGTACTTTCCTTCGGCGGGCGTTTACGGACGTAA-3' 引物 P4 :5' -GCCGAAGGAAAGTACCCAACAATTTTTTGACTTTGC-3' 以 Bacillus thuringiensis subsp.tenebronis 9602 菌株的總 DNA 為 PCR模板，使用 引物P1和P2完成第一輪PCR反應，將擴增得到的chi9602片段用Bgl II和Pst I進行雙 酶切后，連接到同樣用Bgl II和Pst I雙酶切回收后的表達載體pTrcHis B上。將此質(zhì)粒 命名為PMB332 ; 以含有chi9602片段的pMB332為模板，采用重疊延伸PCR技術(shù)第一輪PCR反應，完成第 50位氨基酸的定點突變，獲得幾丁質(zhì)酶突變酶基因 W50A ;所獲得突變序列回收后，使用Bgl II和Pst I進行雙酶切，連接到同樣用Bgl II和Pst I雙酶切回收后的表達載體pTrcHis B上，將此質(zhì)粒命名為pMB581 ; (3) 對質(zhì)粒序列進行測序后，與chi9602基因進行比較，pMB581質(zhì)粒為含有突變酶基因 的原核表達重組載體，其突變酶命名為ChiW50A，其氨基酸序列SEQ ID NO. 1所示； (4) 用包含上述突變酶基因的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，制備重組菌株，其中重組載體中 原核表達載體為pTrcHis B，宿主細胞為大腸桿菌Escherichia coli T0P10; (5) 培養(yǎng)重組菌株，誘導突變酶ChiW50A表達； (6) 將表達后的突變酶ChiW50A回收并采用親和層析純化制備突變酶ChiW50A。
4. 一種蘇云金芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶Chi9602的突變酶W50A的用途，應用于植物的生物防 治病蟲害，其特征在于：（1)對于水稻紋枯病菌具有明顯抑制作用；（2)與蘇云金芽孢桿菌 YBT-1520孢晶混合物復配殺棉鈴蟲具有增效作用；（3)與蘇云金芽孢桿菌YBT-020孢晶混 合物復配殺線蟲具有明顯增效作用。
【文檔編號】A01P5/00GK104232607SQ201410441598
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】倪紅, 孫孝文, 李林, 曾思泉 申請人:湖北大學