一種高效解磷菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種自主篩選的高效解磷細菌及其菌劑的制備方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。該解磷細菌菌株被命名為Bacillus subtilis JT-1，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌，已經(jīng)于2014年8月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC M 2014367。該解磷菌能夠?qū)㈦y溶性無機磷轉(zhuǎn)化為可供植物直接吸收利用的優(yōu)質(zhì)磷素化合物，可提高土壤中難溶性磷的生物有效性和磷肥利用效率，節(jié)肥增產(chǎn)，且在培育和發(fā)揮土壤生態(tài)肥力、保持農(nóng)業(yè)生態(tài)平衡方面具有重要意義和應用價值。CCTCC M 20143672014.08.05
【專利說明】一種高效解磷菌及其應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種高效解磷菌及其應用。

【背景技術(shù)】
[0002] 磷是植物生長發(fā)育不可缺少的大量元素之一，是植物的重要組成成分，并以多種 方式參與植物體內(nèi)各種生理生化過程，對促進植物的生長發(fā)育和新陳代謝起著重要的作 用，但是土壤中的磷絕大部分不能被植物直接吸收。據(jù)調(diào)查，中國有74%的耕地土壤缺磷， 土壤中95%的磷為無效形式，植物很難吸收利用，其中難溶性有機磷一般占土壤全磷的 20% -50%，占難溶性土壤磷總量的10% -85%。施入的磷肥本季節(jié)利用效率為5% -25%， 大部分磷與土壤中的Ca2+、Fe3+、Al3+結(jié)合形成難溶性磷酸鹽。大量使用化肥明顯造成土壤 板結(jié)、土壤保水力下降、草地退化、荒漠化嚴重等不良后果。因此，提高磷的利用率一直是農(nóng) 學、土壤學、生態(tài)環(huán)境和微生物學研究者關(guān)注的熱點。
[0003] 解磷微生物是土壤中能夠?qū)o效磷轉(zhuǎn)化為植物可以吸收利用的有效磷的一類特 殊微生物功能群體，在自然及農(nóng)業(yè)生態(tài)的磷素生物地化循環(huán)中起到了關(guān)鍵作用。解磷細菌 是解磷微生物中重要的一類，通過活化土壤磷元素或影響植物根系分泌物的種類和數(shù)量， 增加植物根系對K、Ca、Mg、Fe、Zn等營養(yǎng)元素的吸收，從而促進植物的生長發(fā)育。解磷細菌 還通過分泌各種酶類或有機酸來活化土壤中的難溶態(tài)磷，并影響根際微生物的群落結(jié)構(gòu)。 大量研究表明，施用含有高效解磷細菌的微生物菌劑能顯著促進植物生長、改善植株根際 環(huán)境。因此，高效解磷微生物的篩選及其制備對于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有降解土壤難溶無機磷，為植物提供可 以直接吸收的優(yōu)質(zhì)磷素的一種高效解磷菌Bacillus subtilis JT-I。
[0005] 本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述高效解磷菌的應用。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -種高效解磷菌，其分類命名為Bacillus subtilis JT-1，保藏于中國典型培養(yǎng) 物保藏中心（簡稱CCTCC)，保藏地址：武漢武漢大學，郵編：430072。菌種保藏號為CCTCC M 2014367,保藏日期為2014年8月5日。是發(fā)明人于湖北省宜昌杉樹埡磷礦地區(qū)的磷礦 土樣中選育的菌株。
[0008] 菌株JT-I具有下述性質(zhì)：
[0009] 1、菌落形態(tài)學特征：
[0010] 在蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上30°c培養(yǎng)2?3天后顯微鏡觀察到營養(yǎng)細胞為單細胞，桿 狀，0. 5?3X0. 5?3μ--，有橢圓形芽孢。在上述培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)12h菌體可以大量生 長。菌落呈白色，圓形，表面光滑，粘狀，中間凸起。
[0011] 2、生理與生化特性：
[0012] (1)培養(yǎng)溫度：25?38°C，最適溫度為30-32°C ;
[0013] (2)在ρΗ5·0?9.0范圍內(nèi)生長；
[0014] (3)革蘭氏染色：陽性；
[0015] ⑷VP反應：陽性；
[0016] (5)淀粉水解試驗：陽性；
[0017] (6)硝酸鹽還原反應：陽性；
[0018] (7)檸檬酸利用：陽性；
[0019] (8)明膠液化：陽性；
[0020] (9)苯丙酸脫氨酶試驗：陰性；
[0021] (IO)ER.:陰性；
[0022] (11)脲酶試驗：陰性；
[0023] (12)丙酸鹽利用：陰性；
[0024] 3、1防rDNA序列分析：
[0025] 測得16S rDNA大部分序列1418bp，如SEQ ID No :1所示。將所測序列從GeneBank 數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)種進行比較，構(gòu)建16S rDNA全序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明：菌 株與枯草芽孢桿菌達到100%同源。所以認定本發(fā)明使用的是枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)，具體為枯草芽抱桿菌 Bacillus subtilis JT-1。
[0026] 上述高效解磷菌在土壤解磷中的應用。
[0027] 上述高效解磷菌可與有機肥混合使用，也可以單獨使用，改善根際微生物環(huán)境，促 進植物生長，減少化肥用量。
[0028] 將高效解磷菌按如下方法制備成菌劑用于土壤的解磷：
[0029] 將斜面保存的解磷菌活化,接種于活化培養(yǎng)基上,培養(yǎng)18?24h ;挑取活化培養(yǎng)基 上的菌種，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30?35°C,培養(yǎng)12?24h，得發(fā)酵液用于土壤的解磷，或者 將發(fā)酵液進行干燥處理得到干燥物用于土壤的解磷。
[0030] 其中，所述的活化培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：碳源IO-IOOg/ L，氮源 l_40g/L，無機鹽 0· 01-50g/L，溶劑為水，pH5. 0 ?9. 0。
[0031] 其中，所述的碳源為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、檸檬酸、甘油、 淀粉和糖蜜中的任意一種或幾種的組合；所述的氮源為酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉 米漿、豆餅粉、棉籽餅粉、尿素、(NH 4) 2S04、NH4C1、(NH4)2HPOjP NH4NO3中的任意一種或幾種的 組合；所述的無機鹽為硫酸鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽、磷酸氫二鹽和鹽酸鹽中的一種或幾種 的組合。
[0032] 上述高效解磷菌制備成顆粒劑、粉劑、溶液、懸浮液或棒劑用于土壤解磷。
[0033] 本發(fā)明的高效解磷菌在30°C，150rpm條件下振蕩培養(yǎng)7d，可將5. Og/L Ca3(PO4)2 解磷，水溶性磷含量為682. 43-725. 28mg/L。
[0034] 有益效果：本發(fā)明的高效解磷菌及其制備得到的菌劑具有以下優(yōu)點：
[0035] 1.本發(fā)明從土壤中篩選出具有降解難溶性無機磷（如Ca2+、Fe2+、Fe 3+、Al3+等離 子結(jié)合形成難溶性磷酸鹽）的解磷菌Bacillus subtilis JT-1，并以解磷菌Bacillus subtilis JT-I為菌種發(fā)酵培養(yǎng)制備得到解磷菌劑，該解磷菌及其菌劑能夠?qū)㈦y溶性無機 磷轉(zhuǎn)化為可供植物直接吸收利用的優(yōu)質(zhì)磷素化合物，可提高土壤中難溶性磷的生物有效性 和磷肥利用效率，節(jié)肥增產(chǎn)，而且可改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤有機質(zhì)含量，對充分發(fā)揮土壤 生態(tài)肥力、保持農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的平衡等均具有極其重要意義和應用價值。
[0036] 2.本發(fā)明提供的解磷菌及其菌劑，不僅能增加土壤中的有效磷，而且能促進植物 對其他營養(yǎng)元素的吸收，解磷菌可以吸附植物根系周圍的鋅、銅、鈣等營養(yǎng)元素，改善植物 營養(yǎng)；而且還可分泌生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，促進根系生長；并且解磷菌接種后，在植物根際大量生 長繁殖，在一段時間內(nèi)成為植物根際的優(yōu)勢菌，從而可抑制或減少病原微生物的繁殖機會， 提高植物的抗病能力。
[0037] 3.本發(fā)明提供的解磷菌劑可將土壤中難溶性無機磷降解為植物可以利用的可溶 性無機磷，向土壤中直接釋放優(yōu)質(zhì)磷肥料，故不存在生產(chǎn)過程中向環(huán)境排放污染物，解磷微 生物是一種真正意義上的環(huán)保型肥料；且本發(fā)明提供的解磷菌劑的制備方法，生產(chǎn)工藝簡 單，生產(chǎn)效率高，能實現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)，具有良好的經(jīng)濟效應和社會效應。

【具體實施方式】
[0038] 下面結(jié)合具體實施例進一步闡明本發(fā)明，應理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價形 式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。
[0039] 實施例1 :
[0040] 按如下步驟制備本發(fā)明所述解磷菌劑：
[0041] 將4°C斜面保存的解磷菌Bacillus subtilis JT-I活化，接種于爺形培養(yǎng)瓶培養(yǎng) 基（即活化培養(yǎng)基）上，培養(yǎng)18-24h。將長好的菌種轉(zhuǎn)移至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30-35°C，培養(yǎng) 12-24h，得發(fā)酵液或發(fā)酵液干燥物，菌劑中的菌體數(shù)量可達到I X 101(l-9 X 1012CFU/g。
[0042] 所述茄形培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：葡萄糖10g/L， (NH 4) 2S040. 5g/L，NaClO. 3g/L，MnSO4 · 4Η200· 03g/L，KH2P04lg/L，pH 為 6. 0-8. 0。
[0043] 以上所述的生產(chǎn)罐的發(fā)酵培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為0. 6-0. 8vvm，攪拌速度 為 180_200rpm。
[0044] 實施例2 :菌株的解磷能力測定。
[0045] 在500mL三角瓶中分別加入IOOmL無機磷液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分為葡萄糖IOg/ L, (NH4) 2S04lg/L, MgSO4 · 7H200. 3g/L, NaClO. 3g/L, FeSO4 · 7H200. 03g/L, MnSO4 · 4H200. 03g/ L，Ca3 (PO4) 25. Og/L。再接種ImL菌懸液，同時做不接種對照（培養(yǎng)基中加入ImL無菌水）， 所有處理進行3次重復。在30°C，150rpm分別振蕩培養(yǎng)7d，將培養(yǎng)液在6000rpm下離心 20min，通過鑰銻抗比色法測定解磷量（水溶性磷含量）為682. 43-725. 28mg/L，解磷率為 68. 2% -72. 5%。解磷菌JT-I具有較高的解磷能力。
[0046] 實施例3 :解磷菌劑可以提高農(nóng)作物產(chǎn)量。
[0047] 解磷菌劑的發(fā)酵制備基本同實施例1。
[0048] 以小區(qū)水稻為實驗對象，試驗設(shè)2個處理，不加解磷菌劑（Tl)和施加解磷菌劑 (T2)菌劑用量為30kg/hm 2,每個處理3次重復，小區(qū)長8m，寬3m，小區(qū)面積24m2,小區(qū)四周 設(shè)置保護行，2個處理除施加解磷菌劑不同外，其余施肥、澆水等管理措施均相同。
[0049] 表1.各處理對水稻的產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的影響
[0050]

【權(quán)利要求】
1. 一種高效解磷菌，其分類命名為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)，菌株號為 JT-1，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏號為CCTCC Μ 2014367,保藏日期為2014 年8月5日。
2. 權(quán)利要求1所述的高效解磷菌在土壤解磷中的應用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，將高效解磷菌按如下方法制備成菌劑用 于土壤的解磷： 將斜面保存的解磷菌活化，接種于活化培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18?24h ;挑取活化培養(yǎng)基上的 菌種，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30?35°C,培養(yǎng)12?24h，得發(fā)酵液用于土壤的解磷，或者將發(fā) 酵液進行干燥處理得到干燥物用于土壤的解磷。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，所述的活化培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，所述的 發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：碳源l〇-l〇〇g/L，氮源l-40g/L，無機鹽0. 01-50g/L，溶劑為水，pH5. 0? 9. 0 〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于，所述的碳源為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、 乳糖、木糖、果糖、乳酸、檸檬酸、甘油、淀粉和糖蜜中的任意一種或幾種的組合；所述的氮 源為酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、棉籽餅粉、尿素、（NH 4)2S04、NH4C1、 (冊14)2即04和ΝΗ4Ν03中的任意一種或幾種的組合；所述的無 機鹽為硫酸鹽、磷酸鹽、磷酸二 氫鹽、磷酸氫二鹽和鹽酸鹽中的一種或幾種的組合。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，高效解磷菌制備成顆粒劑、粉劑、溶液、懸 浮液或棒劑用于土壤解磷。
7. 權(quán)利要求1所述的高效解磷菌在促進植物生長、減少化肥用量中的應用。
【文檔編號】C05F11/08GK104263679SQ201410445552
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月3日
【發(fā)明者】徐虹, 馮小海, 殷文鋒, 許宗奇, 李莎 申請人:南京聚肽高科農(nóng)業(yè)有限公司