一種冬蟲夏草菌菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種冬蟲夏草菌菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括冬蟲夏草菌液態(tài)發(fā)酵專用培養(yǎng)基的制備、菌絲體種源的優(yōu)選和將菌種接入到培養(yǎng)基中發(fā)酵等步驟；其中，菌絲體種源的優(yōu)選為將經(jīng)過10次以上人工傳代后的冬蟲夏草菌種菌絲體接種到人工固體培養(yǎng)基上，遴選出優(yōu)勢子實(shí)體，從子實(shí)體中分離出優(yōu)選的中華被毛孢菌種。本發(fā)明申請?zhí)峁┑囊环N冬蟲夏草菌菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)方法，其優(yōu)勢在于通過菌種遴選，得到具有種性優(yōu)勢的冬蟲夏草菌種。上述方法篩選效果良好，能夠有效解決種性衰退問題，同時(shí)，該方法還可以作為一種中國被毛孢菌種傳代保藏方法。
【專利說明】一種冬蟲夏草菌菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種冬蟲夏草菌的菌種培養(yǎng)方法，特別涉及一種冬蟲夏草菌菌絲體發(fā) 酵生產(chǎn)方法，本發(fā)明屬于醫(yī)藥和保健食品領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis (Berk. ) G. H. Sung et al.)在生 物分類學(xué)上屬于子囊菌門（Ascomycota)、肉座菌目（Hypocreales)、線蟲草科 (Ophiocordycipitaceae)、線蟲草屬（Ophiocordyceps)。冬蟲夏草系我國特產(chǎn)珍稀名貴中 藥材，是冬蟲夏草菌寄生于蝠蛾屬昆蟲幼蟲體內(nèi)形成的一種蟲菌復(fù)合體。冬蟲夏草的用藥 歷史始載于《本草綱目拾遺》，稱其有"補(bǔ)肺益腎、止血化痰之功效"，近代藥理和臨床研究表 明，冬蟲夏草對調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、治療慢性腎炎、慢性肝炎、慢性支氣管炎、高脂血癥和性 功能障礙等多種疾病有顯著療效，具有廣闊的市場前景。
[0003] 目前冬蟲夏草天然資源瀕于滅絕，被列為國家重點(diǎn)保護(hù)野生物種（II級）。資源 的稀少和需求的增長加劇了供不應(yīng)求的矛盾，致使價(jià)格陡長，近二十年來冬蟲夏草價(jià)格漲 幅為各種中藥材價(jià)格上漲幅度之冠，被人們稱為"軟黃金"。從上世紀(jì)八十年代以來，科學(xué)工 作者們試圖通過以下途徑解決冬蟲夏草資源匱乏的難題，以滿足人們對冬蟲夏草增長的需 要。一是冬蟲夏草偽無性型菌絲體的開發(fā)。迄今為止，從冬蟲夏草中分離出了包括中國被孢 霉、中國擬青霉、蝙蝠蛾擬青霉、蟲草頭飽霉、蝙蝠蛾被飽霉、蝙蝠蛾柱霉等雜菌，這些菌的 發(fā)酵產(chǎn)物的理化性質(zhì)和一些藥理功能和冬蟲夏草的功效近似，一些企業(yè)將上述菌種進(jìn)行大 規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)以作為冬蟲夏草的代用品，如天賜康膠囊、金水寶膠囊、至靈膠囊、寧心寶膠 囊等，但這些產(chǎn)品所使用的真菌在生物學(xué)和冬蟲夏草相差甚遠(yuǎn)，在臨床功效上相差更大，因 而難以替代天然冬蟲夏草，更不能作為真正的冬蟲夏草；二是開發(fā)其它蟲草代替冬蟲夏草， 如蛹蟲草，盡管該產(chǎn)品作為新資源獲得批準(zhǔn)上市，但其適應(yīng)癥與冬蟲夏草不一致，也不為消 費(fèi)者所接受；三是人工培育冬蟲夏草，培育在形態(tài)和有效成分與天然冬蟲夏草一致的人工 冬蟲夏草最為市場接受，此途徑是解決冬蟲夏草資源供不應(yīng)求的根本方法和手段，但由于 人工培育天然冬蟲夏草涉及學(xué)科多、研究周期長、部分關(guān)鍵技術(shù)有待完善并涉及《藥品注冊 管理辦法》局令第28號的申報(bào)難題，真正人工產(chǎn)業(yè)化培育的冬蟲夏草面市仍遙遙無期；四 是通過現(xiàn)代生物技術(shù)，利用冬蟲夏草菌種進(jìn)行菌絲體發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)冬蟲夏草菌的產(chǎn)業(yè)化，這是 目前解決冬蟲夏草資源匱乏最現(xiàn)實(shí)的方法和手段。
[0004] 冬蟲夏草為冬蟲夏草菌寄生于蝠蛾屬昆蟲體內(nèi)形成的菌蟲復(fù)合體，冬蟲夏草的主 要藥用活性成份源于冬蟲夏草菌的代謝產(chǎn)物?，F(xiàn)代藥物化學(xué)與藥理學(xué)研究表明冬蟲夏草菌 絲體與天然冬蟲夏草具有相近的化學(xué)成分，具有相似的藥理作用。因此，進(jìn)行冬蟲夏草菌的 液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)冬蟲夏草菌絲體以代替天然的冬蟲夏草，不僅可以緩解野生冬蟲夏草資 源的壓力，還可滿足人們對冬蟲夏草健康保健功能的需求。
[0005] 冬蟲夏草菌是一種嗜低溫型真菌，其生長溫度低于20°C。當(dāng)培養(yǎng)溫度為 20°C -22°C時(shí)，冬蟲夏草菌絲體生長極其緩慢且菌落形成??；當(dāng)培養(yǎng)溫度高于23°C時(shí)，菌絲 體幾乎不生長。同時(shí)，冬蟲夏草菌對培養(yǎng)基營養(yǎng)的要求亦較高，即使在最適培養(yǎng)溫度條件下 在普通真菌培養(yǎng)基上菌絲體生長也很緩慢，菌絲體得率低。按工廠化發(fā)酵模式生產(chǎn)冬蟲夏 草菌絲體由于發(fā)酵溫度低、生長緩慢、培養(yǎng)周期長，通常由于雜菌的染污而以失敗告終，發(fā) 酵成本高。目前，國內(nèi)已有多家單位進(jìn)行了冬蟲夏草菌的液態(tài)培養(yǎng)研究，但是其發(fā)酵菌絲體 產(chǎn)物經(jīng)分子生物學(xué)鑒定后均不是真正的冬蟲夏草菌。
[0006] 相對于動(dòng)物、植物而言，真菌容易變異和退化，在冬蟲夏草菌液態(tài)培養(yǎng)過程中，一 般采用斜面種到液體種的多級發(fā)酵培養(yǎng)模式，斜面菌種經(jīng)過反復(fù)轉(zhuǎn)管傳代，菌種退化較嚴(yán) 重（從最開始分離的母種轉(zhuǎn)管約15代就開始衰退），在斜面培養(yǎng)基上生長表現(xiàn)為菌絲體生 長緩慢、易老化自溶，經(jīng)制種后在液體培養(yǎng)基內(nèi)發(fā)酵菌絲體稀疏、菌球顆粒大表面極光滑， 菌球傳質(zhì)傳氧差，生物量得率低，有效成分含量低。造成此種現(xiàn)象的因素有很多，大體可分 為兩類：一是菌株由于生理功能基因的喪失導(dǎo)致自身的遺傳學(xué)特性發(fā)生改變造成菌種的衰 退；二是傳代次數(shù)、培養(yǎng)條件、環(huán)境因子等人為因素造成的菌種衰退。在培養(yǎng)過程中，菌種衰 退、絲狀菌絲體生長勢弱是制約冬蟲夏草菌發(fā)酵產(chǎn)業(yè)化的一大瓶頸。因此，在冬蟲夏草菌的 發(fā)酵生產(chǎn)過程中采取優(yōu)化的遴選措施恢復(fù)菌種的優(yōu)良特性，以解決冬蟲夏草菌發(fā)酵產(chǎn)業(yè)化 過程中的菌種衰退致生物量及有效成分含量低這一瓶頸問題，實(shí)現(xiàn)冬蟲夏草菌的可持續(xù)、 穩(wěn)定生產(chǎn)。
[0007] 冬蟲夏草菌種遴選的原則是盡可能地獲得抗逆性強(qiáng)、遺傳特性優(yōu)良的菌種。在非 高原生境中能夠大規(guī)模地開展篩選試驗(yàn)，并通過無性繁殖的方式從子實(shí)體上分離獲得的冬 蟲夏草菌種，按本發(fā)明中提及的液態(tài)發(fā)酵專用培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法，冬蟲夏草菌體生物量得 率及腺苷含量均與母種試管菌種的相當(dāng)。
[0008] 目前，冬蟲夏草菌種的篩選技術(shù)（發(fā)明專利CN103404368A) -文中介紹了人工繁 育蟲草菌種的篩選培養(yǎng)方法，該發(fā)明的目的是解決蟲草人工栽培中菌種的可持續(xù)生產(chǎn)問 題，為冬蟲夏草藥材的規(guī)?；沙掷m(xù)化生產(chǎn)提供菌種保障。其特征在于利用蟲草菌種對蟲 草寄主進(jìn)行感染，感染后繼續(xù)培養(yǎng)1-2齡，投放到篩選基地，在野外經(jīng)過過渡期、鍛煉期后 采集有性孢子成熟的蟲草子實(shí)體，利用成熟的有性孢子進(jìn)行蟲草菌的種性篩選。與本發(fā)明 有質(zhì)的區(qū)別，具體區(qū)別在于：1.發(fā)明目的及原理不同。上述
【發(fā)明內(nèi)容】
是利用寄主昆蟲作為 篩選載體，涉及蟲草菌對寄主明蝠蛾昆蟲復(fù)雜的侵染過程，侵染成功后繼續(xù)培養(yǎng)，從蟲體上 長出能產(chǎn)成熟有性孢子的子座，利用成熟有性孢子通過有性繁殖的方式進(jìn)行蟲草菌的分 離、篩選。目的是為冬蟲夏草藥材人工規(guī)模化可持續(xù)性生產(chǎn)提供菌種保障。本發(fā)明是利用 冬蟲夏草無性型的液體菌種接種于篩選培養(yǎng)基上，在普通環(huán)境中利用人工氣候箱培養(yǎng)長出 子實(shí)體，利用子實(shí)體通過無性繁殖的方式進(jìn)行菌種篩選，目的是解決冬蟲夏草菌種在液態(tài) 發(fā)酵培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的菌種種性衰退問題。2.篩選周期不同。對上述
【發(fā)明內(nèi)容】
中的周期進(jìn) 行計(jì)算，從寄主昆蟲感染蟲草菌種后開始到有性孢子的成熟需3-5年，培養(yǎng)周期極長。本發(fā) 明的篩選周期為55-65天，操作簡便，可控，周期短。3.培養(yǎng)條件不同。上述
【發(fā)明內(nèi)容】
中必 須在青藏高原冬蟲夏草主產(chǎn)區(qū)進(jìn)行，利用當(dāng)?shù)靥厥獾牡乩憝h(huán)境，如溫度長年偏低、晝夜溫差 大、海拔高于2000m、空氣稀薄、含氧量低、氣壓低。而本發(fā)明中的方法對地理環(huán)境無特殊要 求，按本發(fā)明方法在具人工氣候箱的實(shí)驗(yàn)室均可培養(yǎng)出子實(shí)體。
[0009] 發(fā)明專利CN101695255B涉及一種用中華被毛孢培育冬蟲夏草子座的方法。其特 征在于取玉米渣、黃豆粉、小麥粒、谷粒、高粱粒、蠶蛹粉或粉碎的全雞蛋、牛肉胨用水浸泡； 將原生料浸泡和生長素混合過濾得濾液并在人工配制的培養(yǎng)基上，海拔1800米以上、晝 夜溫差> 15°C、無工業(yè)污染的環(huán)境中接上無性菌種被毛孢，批量產(chǎn)出長子囊果的子座。所 培育出的冬蟲夏草子座生物轉(zhuǎn)化率在40 %左右，含腺苷C1(lH13N504大于0. 02%，含蟲草素 C1(lH13N503大于0. 10%。與本發(fā)明質(zhì)的區(qū)別在于：1.原理及目的不同。上述
【發(fā)明內(nèi)容】
從其發(fā) 明內(nèi)容可以看出，目的是在人工配制的培養(yǎng)基上栽培出長子囊果的冬蟲夏草子座，屬有性 繁育范疇。而本發(fā)明是針對冬蟲夏草菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)過程中所遇到的種性衰退技術(shù)問題， 通過菌種的選育操作，使冬蟲夏草菌種保持母種的優(yōu)良特性屬無性繁育范疇。2.配方及培 養(yǎng)條件不同。上述
【發(fā)明內(nèi)容】
中提到的配方及比例與本發(fā)明中的配方及比例均有質(zhì)的區(qū)別， 研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草菌在不同培養(yǎng)基上生長情況迥異，不同碳源、氮源、維生素含量、微量元 素配比及碳氮比均可影響子實(shí)體原基的形成及是否長出子實(shí)體。本發(fā)明無需特殊地理?xiàng)l 件，在普通實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行，上述
【發(fā)明內(nèi)容】
特征在于在海拔1800m以上，晝夜溫差大于等于 15°C，無工業(yè)污染的青藏高原冬蟲夏草主產(chǎn)區(qū)環(huán)境中進(jìn)行。
[0010] 綜上所述，發(fā)明專利CN103404368A、CN101695255B與本發(fā)明相比，從發(fā)明原理、 目的、繁育方式、用途、培養(yǎng)基質(zhì)的選擇、成分配比、技術(shù)范疇及培養(yǎng)條件等均不同。與以上 兩個(gè)發(fā)明專利相比，本發(fā)明對冬蟲夏草菌種進(jìn)行遴選具有操作簡便、不受地域限制，污染率 低，成功率高，周期短等優(yōu)點(diǎn)，遴選后分離的菌種再用于液態(tài)發(fā)酵，菌體生物量及腺苷含量 與母種的相近，解決了冬蟲夏草菌液態(tài)發(fā)酵過程中的菌種種性衰退問題，保證了菌體生物 量及有效成分含量，適用于冬蟲夏草菌工業(yè)化可持續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)，且本發(fā)明對降低冬蟲夏草 菌絲體粉成本，推動(dòng)菌絲體粉真正走向廣大消費(fèi)者具有重要的價(jià)值和意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 冬蟲夏草菌種在多次傳代轉(zhuǎn)管培養(yǎng)及液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)過程中，菌種出現(xiàn)衰退，嚴(yán)重 影響冬蟲夏草菌體生物量及腺苷含量的表達(dá)。因此，本發(fā)明提供一種冬蟲夏草菌的發(fā)酵生 產(chǎn)方法。
[0012] 本發(fā)明的冬蟲夏草菌種篩選方法包括如下步驟：
[0013] 將未羽化的蠶蛹或柞蠶蛹用組織勻漿機(jī)處理5-10min，若有未打碎的蛹皮則棄去 蛹皮，所得組織液即為蠶蛹或柞蠶蛹組織液。
[0014] 固體基質(zhì)的制備（原料份數(shù)為重量份數(shù)）：稱取大米10-40份，玉米粉10-30份， 小麥15-35份，高粱10-30份，燕麥粉5-15份，麩皮5-15份。
[0015] 營養(yǎng)液的制備：葡萄糖10-30g/L，蔗糖10-20g/L，蛋白胨10-20g/L，酵母膏 5-20g/L，復(fù)合氨基酸粉5-20g/L，磷酸二氫鉀0· 1-0. 5g/L，磷酸氫二鉀0· 1-0. 5g/L，硫酸鎂 0· 1-0. 5g/L，維生素 & 5mg_50mg/L，維生素 B2 5mg_50mg/L，維生素 B6 10mg_50mg/L，蠶蛹 或柞蠶蛹組織液50-150g/L。
[0016] 冬蟲夏草菌遴選培養(yǎng)基的制備：將固體基質(zhì)與營養(yǎng)液按重量比例1:1. 4-1. 8配制 即可。
[0017] 用罐頭玻璃瓶盛裝以上篩選培養(yǎng)基，用封口膜封口、121°C滅菌30min，冷卻至室 溫，接冬蟲夏草菌液體菌種，每100克篩選培養(yǎng)基接入冬蟲夏草液體菌種的量為10-30ml， 菌種均勻分布在培養(yǎng)基表面。所述液體菌種是通過無菌操作將純培養(yǎng)的冬蟲夏草菌接入搖 瓶后通過搖瓶液體培養(yǎng)10-18天所得；所述罐頭玻璃瓶高X直徑=12cmX 10cm ;所述封口 膜為15cmX 15cm，中央為直徑2cm的圓形、孔徑0. 2 μ m透氣型濾網(wǎng)，每瓶裝固體基質(zhì)80克。
[0018] 將接種后的玻璃瓶置于人工氣候箱中，適宜溫度為15_20°C，空氣相對濕度為 50% -75%，避光培養(yǎng)25-30天。
[0019] 待菌絲布滿整個(gè)培養(yǎng)基平面后，給予光照刺激，每天白天光照時(shí)間不低于10小 時(shí)，光照強(qiáng)度為150-500LX，溫度12-18°C，白晝培養(yǎng)溫度溫差不低于3°C，空氣相對濕度 50% -75%。菌絲經(jīng)光處理后產(chǎn)生橘黃色色素，在培養(yǎng)基表面形成菌蕾，繼續(xù)培養(yǎng)菌蕾生長 成子實(shí)體。
[0020] 用鑷子從子實(shí)體根部鑷取冬蟲夏草子實(shí)體，對新鮮的子實(shí)體進(jìn)行組織分離，即可 獲得篩選冬蟲夏草菌種。所述冬蟲夏草子實(shí)體近圓柱形、灰褐色、基部略粗1. 5-5mm，長約 L 5_6cm〇
[0021] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是利用本發(fā)明遴選的菌種可持續(xù)地提供一種冬蟲夏草菌的 液態(tài)培養(yǎng)方法，其中還涉及一種冬蟲夏草菌液態(tài)發(fā)酵專用培養(yǎng)基。
[0022] 本發(fā)明提供的冬蟲夏草菌液態(tài)培養(yǎng)方法包括如下步驟：
[0023] 冬蟲夏草菌液態(tài)發(fā)酵專用培養(yǎng)基包括：單糖或雙糖1-30克，復(fù)合氮源1-200克，復(fù) 合氨基酸0-10克，蛋白胨0-30克，魚粉0-20克，酵母粉0-20克，維生素B1 10-80mg、維生 素B2 10-80mg、磷酸氫二鉀0-1克、磷酸二氫鉀0-1克、硫酸鎂0-1克，動(dòng)物油0-5克，用水 定容至1000ml。
[0024] 上述單糖或雙糖是葡萄糖、蔗糖；上述復(fù)合氮源為玉米、豆粉、麥麩、蠶蛹粉、柞蠶 蛹、純牛奶或燕麥粉；上述復(fù)合氨基酸是谷氨酸、甘氨酸；上述動(dòng)物油為黃粉蟲蟲油或蠶蛹 油。所述冬蟲夏草菌液態(tài)發(fā)酵專用培養(yǎng)基優(yōu)選配方是：葡萄糖5-30克，復(fù)合氮源50-200 克，谷氨酸0-5克，甘氨酸0-5克，蛋白胨5-30克，魚粉5-20克，酵母粉5-20克，維生素B1 10-50mg、維生素B2 10-50mg、磷酸氫二鉀0-0. 5克、磷酸二氫鉀0-0. 5克、硫酸鎂0-0. 5克， 黃粉蟲蟲油0-4克，用水定容至1000ml。
[0025] 所述冬蟲夏草菌液態(tài)發(fā)酵專用培養(yǎng)基特別優(yōu)選配方是：葡萄糖15-30克，復(fù)合氮 源80-200克，谷氨酸1-5克，甘氨酸1-5克，蛋白胨15-30克，魚粉10-20克，酵母粉10-20 克，維生素B1 20-50mg、維生素B2 20-50mg、磷酸氫二鉀0. 2-0. 5克、磷酸二氫鉀0. 2-0. 5 克、硫酸鎂〇. 1-0. 3克，黃粉蟲蟲油2-4克，用水定容至1000ml。
[0026] 將上述按重量配比的復(fù)合氮源加水蒸煮兩次，每次20分鐘，紗布過濾后取上清液 至容器內(nèi)，再添加其它成分，加熱溶解后，分裝至三角錐形瓶中，塞上棉花塞后121°C、高壓 蒸汽滅菌30min即可。
[0027] 液體種子的制備：將步驟（5)滅好菌的液體培養(yǎng)基在超凈工作臺(tái)內(nèi)接入長X寬= 200mmX 20mm的玻璃試管斜面冬蟲夏草菌種，置于搖床上培養(yǎng)。所述裝液量為三角錐形瓶容 量的1/10-3/5、初始pH值5-7. 5、培養(yǎng)溫度10°C -20°C、轉(zhuǎn)速120-200rpm、避光培養(yǎng)12-16 天即可獲得處于快速生長期的液體種子。
[0028] 液體種子制備最優(yōu)條件是：所述的長X寬=200mmX 20mm的玻璃試管斜面冬蟲夏 草菌種使用量為4-7支/400ml液體培養(yǎng)基；裝液量為三角錐形瓶容量的1/5-3/5 ;初始pH 值為5. 5-6. 5 ;培養(yǎng)溫度優(yōu)選為15-19°C ;轉(zhuǎn)速優(yōu)選為180rpm。
[0029] 冬蟲夏草菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)：按初始pH5-7下、接種量5% -25%將冬蟲夏草菌液體 菌種接入冬蟲夏草菌專用培養(yǎng)基。適宜溫度15_18°C、轉(zhuǎn)速150-200rpm、裝液量1/5-3/5、避 光振蕩培養(yǎng)8-12天達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)即可獲得冬蟲夏草菌絲體。
[0030] 冬蟲夏草菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)選條件是：初始pH值5. 5-7,接種量10-20%、培養(yǎng)溫 度16-18°C、轉(zhuǎn)速170-190rpm、搖瓶裝液量為1/5-2/5 ;所述發(fā)酵終點(diǎn)的判斷為還原糖含量 低于1. 5%、氨態(tài)氮低于200 μ g/ml ;
[0031] 冬蟲夏草菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)最優(yōu)選條件是：初始pH值5. 5-6. 5,接種量10-20%、培 養(yǎng)溫度16-18°C、轉(zhuǎn)速180rpm、搖瓶裝液量為2/5 ;振蕩培養(yǎng)8-12天，發(fā)酵終點(diǎn)的判斷為還 原糖含量低于1. 5%、氨態(tài)氮低于200 μ g/ml ;
[0032] 上述液態(tài)培養(yǎng)方法可根據(jù)液體培養(yǎng)基量（體積）的10倍進(jìn)行逐級放大，達(dá)到所需 要的菌絲體量為止。
[0033] 本發(fā)明的技術(shù)效果是：本發(fā)明申請?zhí)峁┑囊环N冬蟲夏草菌菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)方法， 其優(yōu)勢在于通過菌種遴選，得到具有種性優(yōu)勢的冬蟲夏草菌種。上述方法篩選效果良好，能 夠有效解決種性衰退問題，同時(shí)，該方法還可以作為一種中國被毛孢菌種傳代保藏方法。

【具體實(shí)施方式】：
[0034] 實(shí)施例1 :冬蟲夏草菌絲體液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)
[0035] 所用材料及說明：冬蟲夏草新分離菌株（母種）經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為冬蟲夏草菌， 編號為DC-0 ;以此母種為出發(fā)菌株傳代培養(yǎng)分別得到第10代菌株（編號為DC-10)、第15 代菌株（編號為DC-15)、第20代菌株（編號為DC-20)、第30代菌株（編號為DC-30);
[0036] 蠶蛹或柞蠶蛹：市售新鮮活體蠶蛹或柞蠶蛹，用于組織液的制備。
[0037] 冬蟲夏草菌篩選培養(yǎng)基的制備：固體基質(zhì)（大米10-40份，玉米粉10-30份，小麥 15-35份，高粱10-30份，燕麥粉5-15份，麩皮5-15份）與營養(yǎng)液（柞蠶蛹組織液50-150g/ L，葡萄糖10_30g/L，蔗糖10-20g/L，蛋白胨10-20g/L，酵母膏5-20g/L，復(fù)合氨基酸粉 5-20g/L，磷酸二氫鉀 0. 1-0. 5g/L，磷酸氫二鉀 0. 1-0. 5g/L，硫酸鎂 0. 1-0. 5g/L，維生素 131511^-5〇11^凡，維生素132511^-5〇11^/1，維生素13 61〇11^-5〇11^/1)按照1:1.6的比例配制。
[0038] 冬蟲夏草菌液態(tài)發(fā)酵專用培養(yǎng)基：葡萄糖15-30克，復(fù)合氮源80-200克，谷氨 酸1-5克，甘氨酸1-5克，蛋白胨15-30克，魚粉10-20克，酵母粉10-20克，維生素B1 20-50mg、維生素B2 20-50mg、磷酸氫二鉀0. 2-0. 5克、磷酸二氫鉀0. 2-0. 5克、硫酸鎂 0. 1-0. 3克，黃粉蟲蟲油2-4克，用水定容至1000ml。
[0039] 玻璃罐頭瓶：玻璃瓶高X直徑=12cmX 10cm ;所述封口膜為15cmX 15cm，中央為 0. 2μηι的透氣型濾芯，直徑為2cm的圓形濾芯，每瓶裝固體基質(zhì)80克。
[0040] 封口膜：長X寬=15cmX 15cm，中央為直徑為2cm、圓形、孔徑為0.2 μ m透氣型濾 網(wǎng)。
[0041] 冬蟲夏草菌液態(tài)發(fā)酵專用培養(yǎng)基：葡萄糖20克，蠶蛹粉30克，豆粉30克，玉米30 克，谷氨酸2克，甘氨酸2克，蛋白胨15克，魚粉10克，酵母粉15克，維生素B1 20mg、維生 素B2 20mg、磷酸氫二鉀0. 4克、磷酸二氫鉀0. 4克、硫酸鎂0. 2克，黃粉蟲蟲油3克，用水定 容至 1000ml。
[0042] 冬蟲夏草菌液態(tài)發(fā)酵專用培養(yǎng)基的配制：蠶蛹粉、豆粉、玉米放入蒸煮鍋內(nèi)加水蒸 煮兩次，每次20分鐘，紗布過濾后取上清液至容器內(nèi)，再添加其它營養(yǎng)成分，加熱溶解后， 補(bǔ)水至1000ml即可。
[0043] 1、不同傳代次數(shù)菌株評比
[0044] 起始pH5. 5-6. 5,按接種量10 %將冬蟲夏草菌種接于培養(yǎng)基中，搖瓶裝液量為容 積的2/5。然后在培養(yǎng)溫度16°C，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，避光培養(yǎng)8-12天（至培養(yǎng)液中還原糖 含量低于1. 5%、氨態(tài)氮低于200 μ g/ml時(shí)），即得冬蟲夏草菌絲體。對不同傳代次數(shù)的冬 蟲夏草菌株進(jìn)行了發(fā)酵試驗(yàn)，每組三個(gè)平行，以菌絲體生物量及腺苷含量為考察指標(biāo)。
[0045] 表1不同代數(shù)菌株評比試驗(yàn)
[0046]

【權(quán)利要求】
1. 一種冬蟲夏草菌菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括冬蟲夏草菌液態(tài)發(fā)酵專用培養(yǎng)基的制 備、菌絲體種源的優(yōu)選和將菌種接入到培養(yǎng)基中發(fā)酵等步驟；其特征在于：菌絲體種源的 優(yōu)選為將經(jīng)過10次以上人工傳代后的冬蟲夏草菌種菌絲體接種到人工固體培養(yǎng)基上，遴 選出優(yōu)勢子實(shí)體，從子實(shí)體中分離出優(yōu)選的中華被毛孢菌種。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冬蟲夏草菌菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于：所述的 菌絲體種源的優(yōu)選包括以下步驟： 1) 將蠶蛹或柞蠶蛹用組織勻漿機(jī)處理5-10min，篩除未打碎的蛹皮，所得組織液即為蠶 蛹或柞蠶蛹組織液； 2) 固體基質(zhì)的制備：稱取大米10-40份，玉米粉10-30份，小麥15-35份，高粱10-30 份，燕麥粉5-15份，麩皮5-15份；營養(yǎng)液的制備：葡萄糖10-30g/L，蔗糖10-20 g/L，蛋白 胨10-20 g/L，酵母膏5-20 g/L，復(fù)合氨基酸粉5-20 g/L，磷酸二氫鉀0.1-0. 5 g/L，磷酸氫 二鉀0.1-〇.5區(qū)/1^，硫酸鎂0.1-〇.5區(qū)/1^，維生素131511^-5〇11^/1^維生素13 2511^-5〇11^/1^維 生素B6 10mg-50mg/L，蠶蛹或柞蠶蛹組織液50-150g/L ;冬蟲夏草菌篩選培養(yǎng)基的制備：將 固體基質(zhì)與營養(yǎng)液按重量比例1:1. 4-1. 8配制即可； 3) 用罐頭玻璃瓶盛裝以上篩選培養(yǎng)基，用封口膜封口，121°C滅菌30min，冷卻至室溫， 接冬蟲夏草菌液體菌種，每100克篩選培養(yǎng)基接入冬蟲夏草液體菌種的量為10_30ml，菌種 均勻分布在培養(yǎng)基表面； 4) 將接種后的玻璃瓶置于人工氣候箱中，適宜溫度為15-20°C，空氣相對濕度為 50%-75%，避光培養(yǎng)25-30天； 5) 待菌絲布滿整個(gè)培養(yǎng)基平面后，光照刺激，每天白天光照時(shí)間不低于10小時(shí)，溫度 12-18°C，白晝培養(yǎng)溫度溫差不低于3°C，空氣相對濕度50%-75% ; 菌絲經(jīng)光處理后產(chǎn)生橘黃色色素，在培養(yǎng)基表面形成菌蕾，繼續(xù)培養(yǎng)菌蕾生長成子實(shí) 體； 6) 選擇生長為旺盛的子實(shí)體，用鑷子從子實(shí)體根部鑷取冬蟲夏草子實(shí)體，對新鮮的子 實(shí)體進(jìn)行組織分離，獲得優(yōu)勢冬蟲夏草菌種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種冬蟲夏草菌菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于所述的蠶 蛹或柞蠶蛹為未羽化、體色金黃未黑變的蛹。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種冬蟲夏草菌菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于所述的大 米、玉米粉、小麥、高粱、燕麥粉、麩皮均為無污染、無變質(zhì)霉變的原料。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種冬蟲夏草菌菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于所述的罐 頭玻璃瓶高X直徑=12cmX 10cm，每瓶中裝固體基質(zhì)80克。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種冬蟲夏草菌菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于所述的液 體菌種是通過無菌操作將純培養(yǎng)的冬蟲夏草菌接入搖瓶后通過搖瓶液體培養(yǎng)10-18天所 得。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種冬蟲夏草菌菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于所述的封 口膜為15cmX 15cm，中央為直徑2cm的圓形、孔徑0. 2Mm透氣型濾網(wǎng)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的一種冬蟲夏草菌菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于人 工氣候箱光照強(qiáng)度為150LX-500LX。
【文檔編號】A01G1/04GK104145719SQ201410449700
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月4日
【發(fā)明者】賀宗毅, 陳仕江, 賀元川, 張德利, 魯增輝, 李卿 申請人:重慶市中藥研究院