一種白英愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明研究了一種白英愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，包括無菌葉片的獲得、愈傷組織的誘導(dǎo)、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)與增殖等步驟。本發(fā)明利用組培技術(shù)對(duì)白英進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，可以獲得大量白英愈傷組織及懸浮細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，遺傳性狀穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單且易控，可以在短期內(nèi)提供大量的制藥原料，并有效降低生產(chǎn)成本。
【專利說明】一種白英愈傷組織和懸淳細(xì)胞的快速繁殖方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及組培條件下白英懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，屬于植物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 白英，5b/a/w? //rate? 爺科，多年生草質(zhì)藤本，又名山甜菜、白草、白幕、 排風(fēng)、排風(fēng)草、天燈籠、和尚頭草。產(chǎn)于甘肅、陜西，山西、河南、山東、江蘇、浙江、安徽、江西、 福建、臺(tái)灣、廣東、廣西、湖南、湖北、四川、云南諸省。日本、朝鮮、中南半島也有分布。生于 海拔600-2800米的山谷草地或路旁、田邊。喜溫暖濕潤(rùn)的環(huán)境，耐旱、耐寒、怕水澇。對(duì)土 壤要求不嚴(yán)，但以土層深厚，疏松肥沃，富含有機(jī)質(zhì)的沙壤土為好。重粘土、鹽堿地、低洼地 不宜種植。莖及果實(shí)含有茄堿，果皮含有花色甙及其甙元。功效主治：清熱利濕，解毒消腫， 抗癌。全草：用于感冒發(fā)熱，黃疸性肝炎，膽囊炎，膽石病，癌癥，子宮糜爛，白帶，腎炎水腫； 外用治癰癤腫毒。根：用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。目前的繁殖方法為種子及分根繁殖，其組培快繁 技術(shù)尚無研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供白英細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的快速繁殖方法，細(xì)胞生長(zhǎng) 速度快，遺傳性狀穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單且易控，可以獲得大量白英愈傷組織及懸浮細(xì)胞，并有效 降低生產(chǎn)成本。
[0004] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用下列技術(shù)方案： 取白英幼嫩的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污漬，流水沖洗20min，超 凈工作臺(tái)上氯化萊處理8min，無菌水沖洗5-7遍，將滅菌處理過的白英葉片接入培養(yǎng)基配 方為SH+NAAO. 2mg/L+2iplmg/l+水解酪蛋白250mg/L誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培 養(yǎng)，附加蔗糖3%，瓊脂6g/L，PH5-6,暗室培養(yǎng)，繼代幾次后培養(yǎng)出來的松散的愈傷組織接 入液體培養(yǎng)基SH+2,4-D0. 2mg/L+KT0. 3mg/L+磷酸鈣，取單一，松散的愈傷組織接種到盛 有30mL培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，接種后進(jìn)行搖床水平振蕩培養(yǎng)，可變速率95r/min，溫度 30°C，振幅2-4cm附加蔗糖3%，PH6,光照30001x，培養(yǎng)溫度27°C，取懸浮培養(yǎng)出來的細(xì)胞接 種在1mm厚的薄層固體培養(yǎng)基上進(jìn)行平板培養(yǎng)，每個(gè)細(xì)胞團(tuán)均來自一個(gè)細(xì)胞，然后對(duì)這些 細(xì)胞株進(jìn)行鑒定檢測(cè)，篩選出次生代謝物含量高的細(xì)胞株進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)。
[0005] 采用本發(fā)明制備的白英懸浮細(xì)胞，生長(zhǎng)速度快，操作簡(jiǎn)單，能耗小，污染小。
[0006] 下面將結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不 局限于下列實(shí)施方式。

【具體實(shí)施方式】 [0007] 實(shí)施例1 取白英幼嫩的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污漬，流水沖洗20min，超 凈工作臺(tái)上氯化萊處理8min，無菌水沖洗5-7遍，將滅菌處理過的白英葉片接入培養(yǎng)基配 方為SH+NAAO. 2mg/L+2iplmg/l+水解酪蛋白250mg/L誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培 養(yǎng)，附加蔗糖3%，瓊脂6g/L，PH5-6,暗室培養(yǎng)，繼代幾次后培養(yǎng)出來的松散的愈傷組織接 入液體培養(yǎng)基SH+2,4-D0. lmg/L+KTO. 2mg/L+磷酸鈣，取單一，松散的愈傷組織接種到盛 有30mL培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，接種后進(jìn)行搖床水平振蕩培養(yǎng)，可變速率95r/min，溫度 30°C，振幅2-4cm附加蔗糖3%，PH6,光照30001x，培養(yǎng)溫度27°C，取懸浮培養(yǎng)出來的細(xì)胞接 種在1mm厚的薄層固體培養(yǎng)基上進(jìn)行平板培養(yǎng)，每個(gè)細(xì)胞團(tuán)均來自一個(gè)細(xì)胞，然后對(duì)這些 細(xì)胞株進(jìn)行鑒定檢測(cè)，篩選出次生代謝物含量高的細(xì)胞株進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)。
[0008] 實(shí)施例2 取白英幼嫩的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污漬，流水沖洗20min，超 凈工作臺(tái)上氯化萊處理8min，無菌水沖洗5-7遍，將滅菌處理過的白英葉片接入培養(yǎng)基配 方為SH+NAAO. 2mg/L+2iplmg/l+水解酪蛋白250mg/L誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培 養(yǎng)，附加蔗糖3%，瓊脂6g/L，PH5-6,暗室培養(yǎng)，繼代幾次后培養(yǎng)出來的松散的愈傷組織接 入液體培養(yǎng)基SH+2,4-D0. 2mg/L+KT0. 4mg/L+磷酸鈣，取單一，松散的愈傷組織接種到盛 有30mL培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，接種后進(jìn)行搖床水平振蕩培養(yǎng)，可變速率95r/min，溫度 30°C，振幅2-4cm附加蔗糖3%，PH6,光照30001x，培養(yǎng)溫度27°C，取懸浮培養(yǎng)出來的細(xì)胞接 種在1mm厚的薄層固體培養(yǎng)基上進(jìn)行平板培養(yǎng)，每個(gè)細(xì)胞團(tuán)均來自一個(gè)細(xì)胞，然后對(duì)這些 細(xì)胞株進(jìn)行鑒定檢測(cè)，篩選出次生代謝物含量高的細(xì)胞株進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)。
[0009] 實(shí)施例3 取白英幼嫩的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污漬，流水沖洗20min，超 凈工作臺(tái)上氯化萊處理8min，無菌水沖洗5-7遍，將滅菌處理過的白英葉片接入培養(yǎng)基配 方為SH+NAAO. 2mg/L+2iplmg/l+水解酪蛋白250mg/L誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培 養(yǎng)，附加蔗糖3%，瓊脂6g/L，PH5-6,暗室培養(yǎng)，繼代幾次后培養(yǎng)出來的松散的愈傷組織接 入液體培養(yǎng)基SH+2,4-D0. 2mg/L+KT0. 2mg/L+磷酸鈣，取單一，松散的愈傷組織接種到盛 有30mL培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，接種后進(jìn)行搖床水平振蕩培養(yǎng)，可變速率95r/min，溫度 30°C，振幅2-4cm附加蔗糖3%，PH6,光照30001x，培養(yǎng)溫度27°C，取懸浮培養(yǎng)出來的細(xì)胞接 種在1mm厚的薄層固體培養(yǎng)基上進(jìn)行平板培養(yǎng)，每個(gè)細(xì)胞團(tuán)均來自一個(gè)細(xì)胞，然后對(duì)這些 細(xì)胞株進(jìn)行鑒定檢測(cè)，篩選出次生代謝物含量高的細(xì)胞株進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)。
[0010] 實(shí)施例4 取白英幼嫩的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污漬，流水沖洗20min，超 凈工作臺(tái)上氯化萊處理8min，無菌水沖洗5-7遍，將滅菌處理過的白英葉片接入培養(yǎng)基配 方為SH+NAAO. 2mg/L+2iplmg/l+水解酪蛋白250mg/L誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培 養(yǎng)，附加蔗糖3%，瓊脂6g/L，PH5-6,暗室培養(yǎng)，繼代幾次后培養(yǎng)出來的松散的愈傷組織接 入液體培養(yǎng)基SH+2,4-D0. lmg/L+KTO. 4mg/L+磷酸鈣，取單一，松散的愈傷組織接種到盛 有30mL培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，接種后進(jìn)行搖床水平振蕩培養(yǎng)，可變速率95r/min，溫度 30°C，振幅2-4cm附加蔗糖3%，PH6,光照30001x，培養(yǎng)溫度27°C，取懸浮培養(yǎng)出來的細(xì)胞接 種在1mm厚的薄層固體培養(yǎng)基上進(jìn)行平板培養(yǎng)，每個(gè)細(xì)胞團(tuán)均來自一個(gè)細(xì)胞，然后對(duì)這些 細(xì)胞株進(jìn)行鑒定檢測(cè)，篩選出次生代謝物含量高的細(xì)胞株進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)。
【權(quán)利要求】
1. 一種白英愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，包括無菌葉片的獲得、愈傷組織的 誘導(dǎo)、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)與增殖等，主要步驟如下： (1) 取白英幼嫩葉片，按照常規(guī)的消毒方法對(duì)其進(jìn)行滅菌處理； (2) 將步驟（1)滅菌處理過的白英葉片接入培養(yǎng)基配方為SH+NAAO. 2mg/L+2iplmg/l+ 水解酪蛋白250mg/L誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，附加蔗糖3%，瓊脂6g/L，PH5-6， 暗室培養(yǎng)； (3) 取步驟（2)繼代幾次后培養(yǎng)出來的松散的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基SH+2， 4-D0. 1-0. 2mg/L+KT0. 2-0. 4mg/L+磷酸鈣，進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，附加蔗糖3%，PH6,光照 30001x，培養(yǎng)溫度27°C ; (4) 取步驟（3)懸浮培養(yǎng)出來的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，檢測(cè)。
2. 按照權(quán)利要求1所述的一種白英愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征在 于：步驟（1)中所述白英無菌葉片的獲得為：取白英幼嫩的葉片，先在漂白粉中浸泡3min， 毛刷去除表面污漬，流水沖洗20min，超凈工作臺(tái)上氯化萊處理8min，無菌水沖洗5-7遍。
3. 按照權(quán)利要求1所述的一種白英愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征在 于：步驟（2)中所述愈傷組織的誘導(dǎo)采用的是暗室培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中附加水解酪蛋白，可 以促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)。
4. 按照權(quán)利要求1所述的一種白英愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征在 于：步驟（3)所述的白英懸浮細(xì)胞按照下述方法得到：取誘導(dǎo)出來的愈傷組織繼代4-5次 后，取單一，松散的愈傷組織接種到盛有30mL培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，接種后進(jìn)行搖床水 平振蕩培養(yǎng)，可變速率95r/min，溫度30°C，振幅2-4cm。
5. 按照權(quán)利要求1所述的一種白英愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征在 于：步驟（3)中在培養(yǎng)基中加入了固體緩沖物質(zhì)磷酸鈣可以緩沖懸浮培養(yǎng)中PH值的變化。
6. 按照權(quán)利要求1所述的一種白英愈傷組織和懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征在 于：步驟（4)中取懸浮培養(yǎng)出來的細(xì)胞接種在1mm厚的薄層固體培養(yǎng)基上進(jìn)行平板培養(yǎng)，每 個(gè)細(xì)胞團(tuán)均來自一個(gè)細(xì)胞，然后對(duì)這些細(xì)胞株進(jìn)行鑒定檢測(cè)，篩選出次生代謝物含量高的 細(xì)胞株進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104186326SQ201410462939
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】楊存 申請(qǐng)人:南京通澤農(nóng)業(yè)科技有限公司