一種赪桐懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明研究了一種赪桐懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，包括無菌葉片的獲得、愈傷組織的誘導(dǎo)、愈傷組織的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)等步驟。本發(fā)明方法可以獲得大量的赪桐愈傷組織及懸浮細(xì)胞，有助于赪桐資源的充分開發(fā)和利用，并且有利于赪桐懸浮細(xì)胞的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】 一種赫桐懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組培條件下赪桐懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，屬于植物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]赦桐，馬鞭草科，C/eroofefli/r應(yīng)japonicum) Sweet,又名:朱桐、紅頂風(fēng)、紅菱等，多年生落葉或常綠灌木，產(chǎn)江蘇、浙江南部、江西南部、湖南、福建、臺(tái)灣、廣東、廣西、四川、貴州、云南。印度東北、孟加拉、錫金、不丹、中南半島、馬來西亞、日本也有分布。赪桐原產(chǎn)于亞洲熱帶低海拔林緣或灌木叢中。其性喜高溫、濕潤(rùn)、半蔭蔽的氣候環(huán)境，喜土層深厚的酸性土壤，耐蔭蔽，耐瘠薄，忌干旱，忌澇，畏寒冷，生長(zhǎng)適溫為23?30°C。每年12月至翌年3月，南方旱季低溫，露天的植株落葉休眠，林下植株可常綠。4月始萌發(fā)。以根、葉、入藥。全年可采，洗凈切碎鮮用或曬干。根:祛風(fēng)利濕，散瘀消腫。用于風(fēng)濕骨痛，腰肌勞損，跌打損傷，肺結(jié)核咳嗽，咯血。葉:解毒排膿。外用治疔瘡癤腫，赪桐采用播種和扦插繁殖，組培方法研究目前尚處于起步階段，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)還無人研究，懸浮細(xì)胞具有操作簡(jiǎn)單可控，生產(chǎn)成本低，繁殖率高等優(yōu)點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供赪桐懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，可以獲得大量的赪桐愈傷組織及懸浮細(xì)胞，有助于赪桐資源的充分開發(fā)和利用，并且有利于赪桐懸浮細(xì)胞的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0004]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用下列技術(shù)方案:
選用赪桐幼嫩的葉片，用漂白粉浸泡三分鐘，自來水沖洗20分鐘，在超凈工作臺(tái)上用70%的乙醇消毒20s，0.1 %的升汞消毒10分鐘，無菌水沖洗5-6次，將葉片切成IcmXlcm的小塊，接種在MS+6-BA5mg/L+2，4-Dlmg/L的培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，每瓶接種3塊，附加蔗糖60g/l，瓊脂0.65%，培養(yǎng)條件光照12001x，光期8h，暗期16h，溫度22±2°C，濕度70%，將誘導(dǎo)出來的愈傷組織接入MS+NAA2mg/L+2，4-D4mg/L培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織增殖培養(yǎng)，附加蔗糖30g/l，瓊脂0.65%，培養(yǎng)條件光照25001x，光期12h，暗期12h，溫度25 ±2。。，濕度70%，繼代4-5次后，挑選嫩綠松散的愈傷組織接入到培養(yǎng)基改良MS+NAA0.3 mg/L+6-BA8mg/L+0.04%麥芽提取物中懸浮培養(yǎng)，采用旋轉(zhuǎn)通氣式培養(yǎng)，30天后，稱重，檢測(cè)增長(zhǎng)量。
[0005]采用本發(fā)明制備的赪桐懸浮細(xì)胞，生長(zhǎng)速度快，能耗小，污染小，可以短期內(nèi)獲得大量的次生代謝產(chǎn)物。
[0006]下面將結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于下列實(shí)施方式。

【具體實(shí)施方式】
[0007]實(shí)施例1 選用赪桐幼嫩的葉片，用漂白粉浸泡三分鐘，自來水沖洗20分鐘，在超凈工作臺(tái)上用70%的乙醇消毒20s，0.1 %的升汞消毒10分鐘，無菌水沖洗5-6次，將葉片切成IcmXlcm的小塊，接種在MS+6-BA5mg/L+2，4-Dlmg/L的培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，每瓶接種3塊，附加蔗糖60g/l，瓊脂0.65%，培養(yǎng)條件光照12001x，光期8h，暗期16h，溫度22±2°C，濕度70%，將誘導(dǎo)出來的愈傷組織接入MS+NAAlmg/L+2，4-D3mg/L培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織增殖培養(yǎng)，附加蔗糖30g/l，瓊脂0.65%，培養(yǎng)條件光照25001x，光期12h，暗期12h，溫度25 ±2。。，濕度70%，繼代4-5次后，挑選嫩綠松散的愈傷組織接入到培養(yǎng)基改良MS+NAA0.1 mg/L+6-BA8mg/L+0.04%麥芽提取物中懸浮培養(yǎng)，采用旋轉(zhuǎn)通氣式培養(yǎng)，30天后，稱重，檢測(cè)增長(zhǎng)量。
[0008]實(shí)施例2
選用赪桐幼嫩的葉片，用漂白粉浸泡三分鐘，自來水沖洗20分鐘，在超凈工作臺(tái)上用70%的乙醇消毒20s，0.1 %的升汞消毒10分鐘，無菌水沖洗5-6次，將葉片切成IcmXlcm的小塊，接種在MS+6-BA5mg/L+2，4-Dlmg/L的培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，每瓶接種3塊，附加蔗糖60g/l，瓊脂0.65%，培養(yǎng)條件光照12001x，光期8h，暗期16h，溫度22±2°C，濕度70%，將誘導(dǎo)出來的愈傷組織接入MS+NAA3mg/L+2，4-D5mg/L培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織增殖培養(yǎng)，附加蔗糖30g/l，瓊脂0.65%，培養(yǎng)條件光照25001x，光期12h，暗期12h，溫度25 ±2。。，濕度70%，繼代4-5次后，挑選嫩綠松散的愈傷組織接入到培養(yǎng)基改良MS+NAA0.5 mg/L+6-BA8mg/L+0.04%麥芽提取物中懸浮培養(yǎng)，采用旋轉(zhuǎn)通氣式培養(yǎng)，30天后，稱重，檢測(cè)增長(zhǎng)量。
[0009]實(shí)施例3
選用赪桐幼嫩的葉片，用漂白粉浸泡三分鐘，自來水沖洗20分鐘，在超凈工作臺(tái)上用70%的乙醇消毒20s，0.1 %的升汞消毒10分鐘，無菌水沖洗5-6次，將葉片切成IcmXlcm的小塊，接種在MS+6-BA5mg/L+2，4-Dlmg/L的培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，每瓶接種3塊，附加蔗糖60g/l，瓊脂0.65%，培養(yǎng)條件光照12001x，光期8h，暗期16h，溫度22±2°C，濕度70%，將誘導(dǎo)出來的愈傷組織接入MS+NAA2mg/L+2，4-D4mg/L培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織增殖培養(yǎng)，附加蔗糖30g/l，瓊脂0.65%，培養(yǎng)條件光照25001x，光期12h，暗期12h，溫度25 ±2。。，濕度70%，繼代4-5次后，挑選嫩綠松散的愈傷組織接入到培養(yǎng)基改良MS+NAA0.1 mg/L+6-BA8mg/L+0.04%麥芽提取物中懸浮培養(yǎng)，采用旋轉(zhuǎn)通氣式培養(yǎng)，30天后，稱重，檢測(cè)增長(zhǎng)量。
[0010]實(shí)施例4
選用赪桐幼嫩的葉片，用漂白粉浸泡三分鐘，自來水沖洗20分鐘，在超凈工作臺(tái)上用70%的乙醇消毒20s，0.1 %的升汞消毒10分鐘，無菌水沖洗5-6次，將葉片切成IcmXlcm的小塊，接種在MS+6-BA5mg/L+2，4-Dlmg/L的培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，每瓶接種3塊，附加蔗糖60g/l，瓊脂0.65%，培養(yǎng)條件光照12001x，光期8h，暗期16h，溫度22±2°C，濕度70%，將誘導(dǎo)出來的愈傷組織接入MS+NAA2mg/L+2，4-D4mg/L培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織增殖培養(yǎng)，附加蔗糖30g/l，瓊脂0.65%，培養(yǎng)條件光照25001x，光期12h，暗期12h，溫度25 ±2。。，濕度70%，繼代4-5次后，挑選嫩綠松散的愈傷組織接入到培養(yǎng)基改良MS+NAA0.5 mg/L+6-BA8mg/L+0.04%麥芽提取物中懸浮培養(yǎng)，采用旋轉(zhuǎn)通氣式培養(yǎng)，30天后，稱重，檢測(cè)增長(zhǎng)量。
【權(quán)利要求】
1.一種赪桐懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征是:赪桐的葉片經(jīng)消毒處理，接種在MS+6-BA5mg/L+2，4_D lmg/L的培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，將誘導(dǎo)出來的愈傷組織接入MS+NAAl-3mg/L+2,4-D3-5mg/L培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織增殖培養(yǎng)，繼代4_5次后，挑選嫩綠松散的愈傷組織接入到培養(yǎng)基改良MS+NAA0.1-0.5mg/L+6-BA8mg/L+0.04%麥芽提取物中懸浮培養(yǎng)，采用旋轉(zhuǎn)通氣式培養(yǎng)，30天后，稱重，檢測(cè)增長(zhǎng)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種赪桐懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征是:所述的消毒處理為:選用赪桐幼嫩的葉片，用漂白粉浸泡三分鐘，自來水沖洗20分鐘，在超凈工作臺(tái)上用70%的乙醇消毒20s, 0.1 %的升萊消毒10分鐘,無菌水沖洗5-6次,將葉片切成IcmX Icm的小塊，每瓶接種3塊。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種赪桐懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征是:誘導(dǎo)愈傷組織附加蔗糖60g/l，瓊脂0.65%，培養(yǎng)條件光照12001x，光期8h，暗期16h，溫度22±2°C，濕度 70%ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種赪桐懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征是:愈傷組織增殖中附加蔗糖30g/l，瓊脂0.65%，培養(yǎng)條件光照25001x，光期12h，暗期12h，溫度25±2°C，濕度70%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種赪桐懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征是:懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中改良MS為MS培養(yǎng)基中除硝酸銨外其他物質(zhì)均減為原來的3/4。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種赪桐懸浮細(xì)胞的快速繁殖方法，其特征是: 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基中附加了加入了麥芽提取物，可以促進(jìn)懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)，又可以緩沖PH值的變化。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104255481SQ201410463254
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】楊存 申請(qǐng)人:南京通澤農(nóng)業(yè)科技有限公司