一種包括有疫霉誘導(dǎo)性基因啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，提供一種包括有疫霉誘導(dǎo)性基因啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體及該疫霉誘導(dǎo)性基因啟動(dòng)子和重組表達(dá)載體的應(yīng)用。本發(fā)明將大豆GmaKSTI36基因的啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體PMDC162中，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)和大豆根毛穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)啟動(dòng)子的病原菌誘導(dǎo)表達(dá)特性進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GmaKSTI36基因的啟動(dòng)子在兩種不同的表達(dá)植物系統(tǒng)中，均能在疫霉的誘導(dǎo)下快速、高效的驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的上調(diào)誘導(dǎo)表達(dá)。由此可見(jiàn)，大豆的GmaKSTI36基因的啟動(dòng)子是病原誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，為植物抗疫霉基因工程提供有價(jià)值的病原<誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。
【專利說(shuō)明】一種包括有疫霉誘導(dǎo)性基因啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種包括有疫霉誘導(dǎo)性基因啟動(dòng)子的重組表達(dá)載 體及該疫霉誘導(dǎo)性基因啟動(dòng)子和重組表達(dá)載體的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 有效控制植物病害一直是植物病理學(xué)研究的核心問(wèn)題。長(zhǎng)期以來(lái)，使用化學(xué)農(nóng)藥 是病害控制的主要技術(shù)，但在實(shí)際應(yīng)用中面臨的問(wèn)題是：一方面缺少有效的藥劑，另一方面 在用藥的過(guò)程中伴隨的藥害，環(huán)境污染等問(wèn)題。后來(lái)又提出抗病育種策略，但因其周期長(zhǎng)， 成本高，規(guī)模大，精準(zhǔn)度低等一系列的問(wèn)題，很難進(jìn)行推廣應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)和生物技 術(shù)的發(fā)展，進(jìn)一步提出了抗病基因工程的策略，但伴隨的問(wèn)題是：當(dāng)組成性表達(dá)一個(gè)防衛(wèi)反 應(yīng)相關(guān)基因時(shí)，很難控制基因表達(dá)的精準(zhǔn)度，往往會(huì)影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。而病原誘導(dǎo) 性啟動(dòng)子可能為解決這一問(wèn)題提供新的希望，因?yàn)椴≡T導(dǎo)性啟動(dòng)子能在時(shí)空上精準(zhǔn)的調(diào) 控基因在病原侵染點(diǎn)特異表達(dá)。
[0003] 大豆是世界上最重要的油料經(jīng)濟(jì)作物，也是最大的食用油和食用蛋白的來(lái)源。由 大豆疫霉（Phytophthora sojae)引起的大豆根、莖、苗和種子的腐爛病是一種重要的大豆 病害，該病害在世界范圍內(nèi)的大豆種植區(qū)幾乎都可以檢測(cè)到，它嚴(yán)重影響著大豆的產(chǎn)量和 質(zhì)量，每年都造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。大豆疫霉屬于卵菌，為土傳病害，很多控制真菌的常用 方法對(duì)此病害的控制效果都不明顯。目前控制大豆疫霉病害的主要方法是選育抗病品種， 但在生產(chǎn)上持續(xù)種植具有單一抗性的品種，其抗性會(huì)隨著大豆疫霉菌的快速變異而喪失。 利用多基因控制的水平抗性也是生產(chǎn)上的一種常用策略，這種抗性雖然是可遺傳的，但是 由于參與抗性的基因較多，常規(guī)育種的方法很難將其聚合到一個(gè)品種上。因此利用抗病轉(zhuǎn) 基因工程策略，在大豆中篩選出疫霉誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，將為大豆抗疫霉根腐病育種提供有價(jià) 值的啟動(dòng)子。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)大豆疫霉控制方法復(fù)雜、控制效果不明顯，而 新型的抗病基因工程技術(shù)中缺少可用的病原誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的問(wèn)題，提供一個(gè)疫霉菌誘導(dǎo)性 啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子來(lái)源于大豆胰蛋白酶抑制子GmaKSTI36基因，將該啟動(dòng)子構(gòu)建在植物表 達(dá)載體PMDC162中，能在疫霉的誘導(dǎo)下特異的驅(qū)動(dòng)下游⑶S報(bào)告基因的上調(diào)表達(dá)。
[0005] 本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
[0006] 1.本發(fā)明提供一種包括有疫霉誘導(dǎo)性基因啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載 體包括疫霉誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，并包括由該啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的報(bào)告基因；其中，疫霉誘導(dǎo)性啟動(dòng) 子位于大豆胰蛋白酶抑制子GmaKSTI36基因，GenBank:XM_003546586. 2的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) ATG至上游1，500bp的區(qū)域。
[0007] 該啟動(dòng)子區(qū)主要包含三類順式作用元件：第一類是基礎(chǔ)表達(dá)元件包括14個(gè) CAAT-box，一個(gè)TAAT-box ;第二類是病原誘導(dǎo)性順式作用元件，如有約20個(gè)GT-I元件，約5 個(gè)W-box, 3個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因結(jié)合元件；第三類是物理因素或激素誘導(dǎo)反應(yīng)順式作用元件,如 包含1個(gè)赤霉素反應(yīng)元件GARE，1個(gè)赤霉素反應(yīng)核心元件MYB，一個(gè)乙烯誘導(dǎo)反應(yīng)元件LEC， 5個(gè)細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)反應(yīng)元件ARR1，2個(gè)脫落酸反應(yīng)元件RY repeat, 1個(gè)脫落酸或脅迫反應(yīng) 元件E-box，一個(gè)暗誘導(dǎo)反應(yīng)元件ACGT等。該啟動(dòng)子能夠在疫霉菌侵染初期，快速的驅(qū)動(dòng)其 下游基因的上調(diào)表達(dá)。
[0008] 2.上述1提供的重組表達(dá)載體，其中，所述報(bào)告基因?yàn)棰荢報(bào)告基因，疫霉誘導(dǎo)性 啟動(dòng)子在GUS報(bào)告基因的上游，可以在疫霉菌的誘導(dǎo)下驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的表達(dá)。
[0009] 選擇GUS報(bào)告基因與疫霉誘導(dǎo)性啟動(dòng)子結(jié)合，利于檢測(cè)疫霉誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的這種 病原菌誘導(dǎo)表達(dá)特征；當(dāng)然，如果采用任何生物【技術(shù)領(lǐng)域】可用的報(bào)告基因與該疫霉誘導(dǎo)性 啟動(dòng)子結(jié)合，能達(dá)到同樣的目的，均可，比如綠色熒光蛋白GFP等。
[0010] 3.上述1或2提供的重組表達(dá)載體，其特征在于：該重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為 植物表達(dá)載體PMDC162。
[0011] 出發(fā)載體采用植物表達(dá)載體并不是唯一，本發(fā)明列舉出的植物表達(dá)載體PMDC162 只是一種更適合用于本發(fā)明提供的目的基因的轉(zhuǎn)化。
[0012] 4.本發(fā)明還提供疫霉誘導(dǎo)性基因啟動(dòng)子在構(gòu)建含有疫霉誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的重組表 達(dá)載體上的應(yīng)用。
[0013] 5.本發(fā)明還提供疫霉誘導(dǎo)性基因啟動(dòng)子在構(gòu)建具有疫霉菌誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植 物中的應(yīng)用。
[0014] 6.上述5提供的大豆胰蛋白酶抑制子GmaKSTI36基因的啟動(dòng)子在構(gòu)建具有疫霉菌 誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，其中，該轉(zhuǎn)基因植物為煙草或大豆。
[0015] 7.本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞，其包括上述1-3任一項(xiàng)所述重組表達(dá)載體。
[0016] 8.本發(fā)明還提供上述1-3任一項(xiàng)提供的重組表達(dá)載體在構(gòu)建具有疫霉菌誘導(dǎo)表 達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0017] 9.本發(fā)明還提供上述8提供的重組表達(dá)載體在構(gòu)建具有疫霉菌誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)基 因植物中的應(yīng)用，其中，該轉(zhuǎn)基因植物為煙草或大豆。
[0018] 10.本發(fā)明還提供上述7提供的宿主細(xì)胞在構(gòu)建具有疫霉菌誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙 草或轉(zhuǎn)基因大豆中的應(yīng)用。
[0019] 有益效果：
[0020] 1.發(fā)明人通過(guò)大量試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于大豆的胰蛋白酶抑制子GmaKSTI36基因的啟 動(dòng)子受大豆疫霉菌的誘導(dǎo)，能特異驅(qū)動(dòng)下游基因的快速上調(diào)表達(dá)。因此，該基因啟動(dòng)子在大 豆抗疫霉基因工程中具有較強(qiáng)的應(yīng)用潛力。
[0021] 2.由于病原菌侵染速度非常快，如果能夠使受侵染植物快速啟動(dòng)其防衛(wèi)相關(guān)基因 的表達(dá)，對(duì)提高其抗病性是至關(guān)重要。本發(fā)明通過(guò)試驗(yàn)，證明用大豆疫霉游動(dòng)孢子沾根接種 的方法，處理7d(day)左右的大豆苗根部，可以在接種后的0.5h和2h檢測(cè)大該基因的快 速、高強(qiáng)度的表達(dá)，并且其表達(dá)強(qiáng)度強(qiáng)于已報(bào)道的病原誘導(dǎo)性基因 PRla。說(shuō)明大豆胰蛋白酶 抑制子GmaKSTI36基因是一個(gè)在疫霉侵染早期快速上調(diào)表達(dá)的基因。
[0022] 3.提前在煙草或大豆根毛中表達(dá)如下重組質(zhì)粒：組成型啟動(dòng)子CaMV35S融合 ⑶S報(bào)告基因的35S:⑶S重組質(zhì)粒，由大豆的GmaKSTI36基因啟動(dòng)子融合⑶S報(bào)告基因的 GmaKSTI36:⑶S重組質(zhì)粒，以及由組成型啟動(dòng)子CaMV35S中的-46?+8區(qū)域的35S小啟動(dòng) 子35S min融合⑶S報(bào)告基因的35S min:⑶S重組質(zhì)粒。72h后分別接種煙草疫霉或大豆 疫霉，可以在侵染后0. 5h驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因快速上調(diào)表達(dá)，2h后其驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的誘導(dǎo)上調(diào)表 達(dá)水平達(dá)到CaMV35S組成型強(qiáng)啟動(dòng)子的水平。說(shuō)明GmaKSTI36基因的啟動(dòng)子是病原誘導(dǎo)性 啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子能在煙草瞬時(shí)表達(dá)和大豆根毛穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)中分別表達(dá)，在疫霉誘導(dǎo)下 快速驅(qū)動(dòng)下游GUS報(bào)告基因的上調(diào)表達(dá)，為植物抗疫霉基因工程提供有價(jià)值的病原誘導(dǎo)性 啟動(dòng)子，其成為植物抗疫霉基因工程的候選材料，進(jìn)一步可為生產(chǎn)上提供有持久抗病潛力 的育種材料。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖lGmaKSTI36基因啟動(dòng)子序列以及其主要包含的已知功能順式元件
[0024] 圖中標(biāo)注+1位點(diǎn)的腺嘌呤A堿基為GmaKSTI36基因的起始位點(diǎn)。圖中灰色加重 顯示的堿基為啟動(dòng)子所包含的主要順式元件，對(duì)應(yīng)每個(gè)元件堿基序列的下部注明了該元件 的名稱。
[0025] 圖2構(gòu)建疫霉誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的重組植物表達(dá)載體pMDC162示意圖
[0026] 圖3GmaKSTI36基因是疫霉誘導(dǎo)早期快速上調(diào)表達(dá)的基因
[0027] A.GmaKSTI36基因在三個(gè)不同大豆品種中的基因芯片EST結(jié)果；B. GmaPRla基因在 三個(gè)不同大豆品種中的基因芯片EST結(jié)果；C. GmaKSTI36基因和GmaPRla基因的疫霉誘導(dǎo) 表達(dá)水平的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)的驗(yàn)證結(jié)果。
[0028] 圖4GmaKSTI36基因的啟動(dòng)子在煙草瞬時(shí)表達(dá)體系中的疫霉誘導(dǎo)表達(dá)
[0029] A. GmaKSTI36基因啟動(dòng)子，以及陽(yáng)性對(duì)照CaMV 35S強(qiáng)啟動(dòng)子、陰性對(duì)照35S min小 啟動(dòng)子分別在煙草上表達(dá)3d后，用辣椒疫霉P.c35游動(dòng)孢子（105/個(gè)）接種，并在接種后 的0,0. 5和2h檢測(cè)⑶S報(bào)告基因的酶活性。
[0030] B. GmaKSTI36基因啟動(dòng)子，以及陽(yáng)性對(duì)照CaMV 35S強(qiáng)啟動(dòng)子、陰性對(duì)照35S min小 啟動(dòng)子分別在煙草上表達(dá)3d后，用辣椒疫霉P.c35游動(dòng)孢子（105/個(gè)）接種，并在接種后 的0,0. 5和2h用化學(xué)組織染色的方法檢測(cè)GUS報(bào)告基因的活性。
[0031] C.GmaKSTI36基因啟動(dòng)子，在煙草上表達(dá)3d后，用辣椒疫霉P. c35游動(dòng)孢子（105/ 個(gè)）接種，并在接種后的〇, 〇. 5和2h用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)GUS報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄水 平的表達(dá)。
[0032] 圖5GmaKSTI36基因的啟動(dòng)子在大豆根毛穩(wěn)定表達(dá)體系中的疫霉誘導(dǎo)表達(dá)
[0033] A.GmaKSTI36基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化大豆子葉，誘導(dǎo)產(chǎn)生根毛狀組織后，用大豆疫霉 P. 6497游動(dòng)孢子（105/個(gè)）接種，并在接種后的0,0. 5和2h檢測(cè)⑶S報(bào)告基因的酶活性。
[0034] B. GmaKSTI36基因啟動(dòng)子，以及陽(yáng)性對(duì)照CaMV 35S強(qiáng)啟動(dòng)子、陰性對(duì)照35S min小 啟動(dòng)子分別轉(zhuǎn)化大豆子葉，誘導(dǎo)產(chǎn)生根毛狀組織后，用大豆疫霉P6497游動(dòng)孢子（105/個(gè)） 接種，并在接種后的〇,〇. 5和2h用化學(xué)組織染色的方法檢測(cè)GUS報(bào)告基因的活性。
[0035] C.GmaKSTI36基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化大豆子葉，誘導(dǎo)產(chǎn)生根毛狀組織后，用大豆疫霉 P6497游動(dòng)孢子（105/個(gè)）接種，并在接種后的0,0. 5和2h用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢 測(cè)⑶S報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。

【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照本領(lǐng)域的公知手段。
[0037] 實(shí)施例1
[0038] 大豆的GmaKSTI36基因是一個(gè)在疫霉侵染早期快速上調(diào)表達(dá)的基因
[0039] 1.芯片數(shù)據(jù)的篩選
[0040] 根據(jù)三個(gè)不同的大豆品種：V710370, Williams，Sloan(該三個(gè)大豆品種由南京農(nóng) 業(yè)大學(xué)大豆疫霉與植物互作實(shí)驗(yàn)室保存）受大豆疫霉侵染過(guò)程全基因表達(dá)譜的芯片數(shù)據(jù) 文獻(xiàn)（Zhou L, Mideros SX, Bao L, et al. Infection and genotype remodel the entire soybean transcriptome [J] · BMC Genomics, 2009, 10 (I) : 49-59.)，該文獻(xiàn)分析了不同大豆 品種在疫霉侵染后的基因表達(dá)情況，結(jié)果表明幾乎所有大豆基因的表達(dá)都受到疫霉侵染不 同程度地調(diào)節(jié)。我們依據(jù)該文獻(xiàn)的基因芯片數(shù)據(jù)，首先篩選差異上調(diào)表達(dá)的芯片基因。三 個(gè)大豆品種的數(shù)據(jù)單獨(dú)分析：根據(jù)接種Id的數(shù)據(jù)即侵染Id處理（疫霉侵染）與對(duì)照（未 侵染）的比值來(lái)篩選。具體采用如下用兩種方法篩選，其一 ：SAM(Significance Analysis of Microarrays)方法，設(shè)置 Fold change>1.5SFDR(False discovery rate)〈0· 05,結(jié)果 Williams品種篩選出148個(gè)差異上調(diào)表達(dá)的芯片基因，V710370品種84個(gè)，Sloan品種55 個(gè)。其二：T-test方法，設(shè)置Fold change>1.5且T-test〈0. 05,結(jié)果與上面SAM得到的結(jié) 果一致。分別篩選出三個(gè)品種的差異芯片基因后，合并起來(lái)去除冗余后，最后得到198個(gè)芯 片基因在至少一個(gè)品種里上調(diào)表達(dá)。接著把這198個(gè)芯片基因 blast比對(duì)大豆基因，得到 180個(gè)大豆基因。進(jìn)一步在180個(gè)基因中篩選42個(gè)基因是綜合以下兩個(gè)條件：第一、至少在 兩個(gè)大豆品種里的表達(dá)量>1. 5倍；至少在一個(gè)大豆品種里的表達(dá)量>2倍；第二、芯片基因 與對(duì)應(yīng)大豆基因 overlap的序列在大豆基因組里是唯一的，沒(méi)有其他同源序列。共篩選到 42個(gè)差異上調(diào)表達(dá)的基因。進(jìn)一步用熒光定量PCR的方法驗(yàn)證這42個(gè)基因的疫霉誘導(dǎo)表 達(dá)情況，初步獲得8個(gè)疫霉誘導(dǎo)表達(dá)基因。本發(fā)明所涉及到的大豆GmaKSTI36基因及其啟 動(dòng)子是其中的一個(gè)，該啟動(dòng)子位于GmaKSTI36轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)ATG的A堿基至上游的1，500bp 區(qū)段。對(duì)三個(gè)大豆品種V710370, Williams，Sloan經(jīng)基因芯片技術(shù)檢測(cè)GmaKSTI36基因的 EST結(jié)果見(jiàn)圖3-A，結(jié)果表明該基因在大豆疫霉侵染后的3d在三個(gè)品種中分別上調(diào)表達(dá)約 104、53、113倍，在侵染后的5(1分別上調(diào)表達(dá)約198、99、171倍。而已報(bào)道的病原誘導(dǎo)性基 因 GmaPRla基因的EST對(duì)應(yīng)的結(jié)果見(jiàn)圖3-B，結(jié)果表明該基因在在三個(gè)大豆品種中在大豆疫 霉侵染后的3d分別上調(diào)表達(dá)約19、80、75倍，在侵染后的5d分別上調(diào)表達(dá)約71、167、263 倍。
[0041] 2.用大豆疫霉處理大豆根部
[0042] 將參試的大豆=Williams種子播種在蛭石培養(yǎng)基中，在25°C，16/8h光周期的溫室 中培養(yǎng)。待大豆生長(zhǎng)至兩片真葉完全展開(kāi)后，輕輕將豆苗從蛭石中拔出，用清水沖洗根部的 蛭石，小心盡量不要弄傷根部。將新鮮的大豆根浸泡在大豆疫霉菌游動(dòng)孢子懸浮液，濃度為 IO5個(gè)/ml中，以清水浸泡作為對(duì)照，分別在接種后的0h，0. 5h，a取樣，迅速用濾紙吸干水 分并剪下根部，保存在液氮中待用。
[0043] 3.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(qRT-PCR)
[0044] 將有大豆疫霉菌孢子處理后的大豆根部材料，置研缽中加液氮研磨成粉末，力口 入試劑盒 RNeasy kit (Tiangen)的相應(yīng)試劑，提取總 RNA。用 iScript cDNA Synthesis kit (TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，并定量到 IOOng μ Γ1。用 SYBR master mix (TaKaRa)試劑盒，在 ABI 7500Real_time PCR system熒光定量?jī)x上采用SYBR green I熒光染料法進(jìn)行qRT-PCR 分析，采用相對(duì)定量AAet法分析基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。
[0045] 其中，檢測(cè)大豆GmaKSTI36基因表達(dá)量的引物：上游引物Gmg2-QF :序列如SEQ ID NO. 1所示；下游引物Gmg2-QR :序列如SEQ ID NO. 2所示
[0046] 檢測(cè)大豆GmaPRla基因表達(dá)量的引物：上游引物Gmg3-QF :序列如SEQ ID NO. 3所 示；下游引物Gmg3-QR :序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0047] 以大豆的 ACT2〇 (Genbank accession no. XMJW353I5I8. 1)作為內(nèi)參基因，其引 物：上游引物ACT20-QF :序列如SEQ ID NO. 7所示；下游引物ACT20-QR :序列如SEQ ID NO. 7 所示。
[0048] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如3-C所示表明，大豆的GmaKSTI36基因在疫霉的侵染過(guò)程中，與Oh未 接種相比，能在接種后的0. 5h上調(diào)表達(dá)74倍左右，在接種后的2h上調(diào)表達(dá)81倍左右；而已 報(bào)道的病原誘導(dǎo)性基因 GmaPRla，分別在接種后的0. 5和2h上調(diào)表達(dá)23和28倍左右。由此 可見(jiàn)，大見(jiàn)的GmaKSTI36基因的疫霉誘導(dǎo)表達(dá)能力強(qiáng)于已報(bào)道的病原誘導(dǎo)性基因 GmaPRla。 說(shuō)明來(lái)源于大豆的GmaKSTI36基因是一個(gè)在大豆疫霉侵染早期高效表達(dá)的基因，即疫霉誘 導(dǎo)性基因。
[0049] 實(shí)施例2大豆GmaKSTI36基因的啟動(dòng)子是病原誘導(dǎo)性啟動(dòng)子
[0050] 1.啟動(dòng)子的克隆與載體構(gòu)建
[0051] 根據(jù) Chai C, Lin Y, Shen D, et al. Identification and Functional Characteri-zation of the Soybean GmaPPOI2 Promoter Conferring Phytophthora sojae In-duced Expression[J]· Plos One, 2013, 8(6) :1_6.文章中構(gòu)建啟動(dòng)子融合 GUS 報(bào)告基因的植物表達(dá)載體方法分別獲得由組成型啟動(dòng)子CaMV35S融合GUS報(bào)告基因的 35S:⑶S重組質(zhì)粒，由大豆的GmaKSTI36基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)ATG上游1，500bp的啟動(dòng)子區(qū) 即疫霉誘導(dǎo)性啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因的GmaKSTI36:GUS重組質(zhì)粒，以及由組成型啟動(dòng)子 CaMV35S中的-46?+8區(qū)域的35S小啟動(dòng)子35S min融合⑶S報(bào)告基因的35S min:⑶S重 組質(zhì)粒，構(gòu)建以上重組質(zhì)粒用到的植物表達(dá)載體是PMDC162。載體的構(gòu)建模式圖如圖2所 示，圖中的"啟動(dòng)子構(gòu)入?yún)^(qū)"是分別把大豆的GmaKSTI36基因啟動(dòng)子，組成型CaMV35S啟動(dòng) 子，以及組成型CaMV35S啟動(dòng)子中的-46?+8區(qū)域分別經(jīng)KpnI和BgLII雙酶切后插入到 該區(qū)，形成相應(yīng)啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因的重組植物表達(dá)載體。
[0052] 2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的本氏煙瞬時(shí)表達(dá)與接種
[0053] 將35S:⑶S、GmaKSTI36:⑶S和35S min:⑶S重組質(zhì)粒的植物表達(dá)載體pMDC162通 過(guò)電轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌（Biovector)菌株（該菌株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆疫霉與 植物互作實(shí)驗(yàn)室保存）中，將農(nóng)桿菌的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子于3ml添加卡那霉素（50μ g/ml)的LB培 養(yǎng)液中，220rpm，28-30°C培養(yǎng)48h，4000rpm離心4min，收集菌體，用IOmM MgCl2重懸，重復(fù) 三次后，用IOmM MgCl2定容至0D600 = 0.4-0. 6。取生長(zhǎng)6-8周的煙草，從上數(shù)第三至第六 片完全展開(kāi)的真葉被用于滲透接種農(nóng)桿菌。用針頭在煙草下表皮造成一小傷口，用ImL無(wú) 針頭的注射器將30-50μ1農(nóng)桿菌懸液滲透到本氏煙葉片中。注射后72h接種。剪下注射 的煙草葉片，浸泡在辣椒疫霉孢子懸浮液中，孢子濃度為IO 5個(gè)/mL，分別在接種后0,0. 5和 2h分別取樣，迅速用液氮凍存，以備檢測(cè)⑶S酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次設(shè)三個(gè)生物學(xué)重 復(fù)，用于檢測(cè)煙草瞬時(shí)表達(dá)體系中的疫霉誘導(dǎo)表達(dá)的報(bào)告基因 GUS活性。
[0054] 3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆根毛轉(zhuǎn)化與接種
[0055] 大豆根毛轉(zhuǎn)化主要參考Savka(Savka MA, Ravillion B, Noel GR, et al. Induction of Hairy Roots on Cultivated Soybean Genotypes and Their Use to Propagate the Soybean Cyst Nematode [J] · Phytopathology, 1990, 80 (5) : 503-508.)報(bào)道的方法：將作為 陽(yáng)性對(duì)照的35S:⑶S、GmaKSTI36:⑶S和作為陰性對(duì)照的35S min:⑶S重組質(zhì)粒的植物表達(dá) 載體PMDC162通過(guò)電轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)K599 (該菌株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆疫霉與植物互 作實(shí)驗(yàn)室保存）桿菌中，挑取轉(zhuǎn)化的單克隆，在含有卡那霉素（50 μ g ml/1)的液體LB培養(yǎng) 基中，28°C震蕩培養(yǎng)48h，3000r/min離心IOmin收集菌體，用IOmM MgCL2重懸浮，稀釋至終 濃度0D_為0. 5-0. 6備用。將無(wú)菌大豆種子種在1/2MS培養(yǎng)基（正常的MS培養(yǎng)基中所有 添加元素減半后配置的培養(yǎng)基）中，在25°C，16/8h光暗交替培養(yǎng)室中生長(zhǎng)5-6d，在超凈臺(tái) 上剪下大豆子葉，用無(wú)菌手術(shù)刀在每個(gè)子葉的背面挖洞，然后擺放在含有頭孢和羧芐霉素 (各250 μ g ml/1)的Whiter培養(yǎng)基上，將稀釋好的菌液滴在挖好的洞里，放置在25°C黑暗 條件下的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)18-20d。待根毛長(zhǎng)出4-8cm長(zhǎng)時(shí)，剪下根毛浸泡在大豆疫霉游動(dòng)孢 子懸浮液（1〇 5個(gè)/mL)中。分別在接種后011，0.511，211取樣，用于檢測(cè)大豆根毛穩(wěn)定表達(dá)體 系中報(bào)告基因 GUS活性。
[0056] 4.⑶S活性分析
[0057] 4. 1⑶S化學(xué)組織染色
[0058] 參照 Jefferson 等方法（Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW. GUS fusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants [J]. EMBO J, 1987, 6(13) :3901-3907.)測(cè)定煙草葉片和根毛中的⑶S報(bào)告基 因的表達(dá)。將需要染色的葉片（來(lái)源于實(shí)例2的方法2的樣品材料）或根毛（來(lái)源于實(shí)例 2的方法3中取到的樣品材料）浸泡在⑶S染液（50mmol Γ1磷酸鈉緩沖液pH 7. 0, IOmol T1EDTAammol Ll-GluhO.l% Triton X-100，10mmol Ρβ-巰基乙醇）中，置于 37°C溫 育12h，75%乙醇沖洗兩次，再用95%乙醇脫色，直至底色完全消失。分別在煙草上表達(dá)3天 后，用辣椒疫霉P. c35游動(dòng)孢子（105/個(gè)）接種，并在接種后的0,0. 5和2h用化學(xué)組織染色 的方法檢測(cè)GUS報(bào)告基因的活性。圖4-B顯示的是三個(gè)重組質(zhì)粒瞬時(shí)表達(dá)煙草的化學(xué)組織 染色結(jié)果表明：與陰性對(duì)照（35Smin)相比，GmaKSTI36啟動(dòng)子能在瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的煙草葉片上 驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)，并且在疫霉接種過(guò)程中其誘導(dǎo)表達(dá)水平不斷提高，表現(xiàn)為染色的藍(lán) 色深度與Oh相比在逐漸加深；在2h的表達(dá)能力幾乎能達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照（35S)組成性啟動(dòng)子 的水平，表現(xiàn)為這兩個(gè)點(diǎn)染色的藍(lán)色深度幾乎相同。圖5-B顯示的是三個(gè)重組質(zhì)粒穩(wěn)定表 達(dá)大豆根毛的化學(xué)組織染色結(jié)果表明：GmaKSTI36基因啟動(dòng)子能在轉(zhuǎn)基因大豆根毛中，在 疫霉的誘導(dǎo)下持續(xù)的驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的表達(dá)，并且隨著疫霉接種誘導(dǎo)的時(shí)間增長(zhǎng)而活性 提高。在2h GUS染色的強(qiáng)度幾乎接近了陽(yáng)性對(duì)照（35S)的強(qiáng)度，而在陰性對(duì)照（35S min) 中沒(méi)有顏色變化。
[0059] 4. 2⑶S酶活檢測(cè)
[0060] 將需要測(cè)定GUS酶活性的材料：葉片（來(lái)源于實(shí)例2的方法2的樣品材料）或根毛 (來(lái)源于實(shí)例2的方法3中取到的樣品材料）各約IOOmg置研缽中加液氮研磨成粉末加入 提取緩沖液 500 μ I (50mM NaH2PO4, pH 7. 0, IOmM EDTA, 0· 1% Triton X-100, 0· I (w/v)十二 烷基磺酸鈉，ΙΟπιΜβ-巰基乙醇），4°C離心，上清為⑶S蛋白提取液。用BSA法測(cè)定蛋白濃 度。取出部分加⑶S反應(yīng)底物4-MUG，于37°C反應(yīng)30min，在激發(fā)光365nm發(fā)射光455nm的 條件下進(jìn)行熒光測(cè)定，3次生物學(xué)重復(fù)，最終以單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的相對(duì)變化量來(lái)計(jì)算GUS報(bào) 告基因的酶活性值。圖4-A顯示的是三個(gè)重組質(zhì)粒瞬時(shí)表達(dá)煙草檢測(cè)GUS報(bào)告基因酶活的 結(jié)果表明，與未接種的樣品相比，GmaKSTI36啟動(dòng)子能在接種后的0. 5h驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因上調(diào) 表達(dá)5. 7倍，在接種后的2h驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因上調(diào)表達(dá)9. 9倍。在陰性對(duì)照樣品中幾乎檢測(cè)不 到GUS酶的活性，在陽(yáng)性對(duì)照樣品中，組成性表達(dá)的35S啟動(dòng)子能持續(xù)驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的高水 平表達(dá)。圖5-A顯示的是GmaKSTI36:⑶S重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化大豆根毛檢測(cè)⑶S報(bào)告基因酶 活的結(jié)果表明：疫霉接種后的0. 5h和2h，GmaKSTI36基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的酶活 性與Oh相比，分別提高到5. 7倍和10. 4倍。
[0061] 4. 3⑶S基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)
[0062] 以實(shí)施例2方法2和實(shí)施例2方法3獲得的材料為對(duì)象，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的方法檢測(cè)以檢測(cè)GUS報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，其具體實(shí)施方法同實(shí)施例1中的方法3。
[0063] 用本氏煙的EFla(Genbank accession no. AF120093. 1)作為煙草的內(nèi)參基因，其 引物：上游引物EFla-QF:序列如SEQ ID NO. 5所示；下游引物EFla-QR:序列如SEQ ID NO. 6 所示。
[0064] 用大豆的ACT20 (Genbank accession ηο· ΧΜ_003531518· 1)作為大豆內(nèi)參基因，其 弓丨物為：上游引物ACT20-QF:序列如SEQ ID NO. 7所示；下游引物ACT20-QR:序列如SEQ ID NO. 8所示。
[0065] 檢測(cè)⑶S轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)用到的引物：上游引物mGUS-QF :序列如SEQ ID NO. 9所示； 下游引物mGUS-QR :序列如SEQ ID NO. 10所示。
[0066] 圖4-C顯示的是GmaKSTI36:⑶S重組質(zhì)粒瞬時(shí)表達(dá)煙草檢測(cè)⑶S報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄水 平的表達(dá)，結(jié)果表明：GmaKSTI36基因啟動(dòng)子在疫霉接種后的0. 5h能夠驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因 在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)表達(dá)3. 4倍，接種后的2h上調(diào)表達(dá)6. 2倍。圖5-C顯示的是GmaKSTI36:⑶S 重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化大豆根毛檢測(cè)GUS報(bào)告轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，結(jié)果表明：在疫霉接種后的 0. 5h和2h，GmaKSTI36基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)能力分別提高3. 0倍和6. 8倍。
[0067] 用兩種植物表達(dá)系統(tǒng)，三種不同的檢測(cè)GUS報(bào)告基因活性的方法，最終驗(yàn)證了大 豆的GmaKSTI36基因的啟動(dòng)子能在疫霉誘導(dǎo)早期快速驅(qū)動(dòng)其下游報(bào)告基因上調(diào)表達(dá)。由此 可見(jiàn)，GmaKSTI36基因的啟動(dòng)子是病原誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。本研究中所用到的引物見(jiàn)表1。
[0068] 表1本研究中所用到的熒光定量引物
[0069]

【權(quán)利要求】
1. 一種包括有疫霉誘導(dǎo)性基因啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體，其特征在于：該重組表達(dá)載體 包括疫霉誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，并包括由該啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的報(bào)告基因；其中，疫霉誘導(dǎo)性啟動(dòng)子 位于大豆胰蛋白酶抑制子GmaKSTI36基因 GenBank:XM_003546586. 2的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)ATG 至上游1，500bp的區(qū)域。
2. 權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體，其特征在于：所述報(bào)告基因?yàn)镚US報(bào)告基因，疫霉 誘導(dǎo)性啟動(dòng)子在GUS報(bào)告基因的上游，可以在疫霉菌的誘導(dǎo)下驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的表達(dá)。
3. 權(quán)利要求1或2所述的重組表達(dá)載體，其特征在于：該重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為 植物表達(dá)載體PMDC162。
4. 疫霉誘導(dǎo)性基因啟動(dòng)子在構(gòu)建含有疫霉誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體上的應(yīng)用。
5. 疫霉誘導(dǎo)性基因啟動(dòng)子在構(gòu)建具有疫霉菌誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求5所述的大豆胰蛋白酶抑制子GmaKSTI36基因的啟動(dòng)子在構(gòu)建具有疫霉菌 誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，其特征在于：該轉(zhuǎn)基因植物為煙草或大豆。
7. -種宿主細(xì)胞，其特征在于：包括權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述重組表達(dá)載體。
8. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)載體在構(gòu)建具有疫霉菌誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植 物中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求8所述的重組表達(dá)載體在構(gòu)建具有疫霉菌誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng) 用，其特征在于：該轉(zhuǎn)基因植物為煙草或大豆。
10. 權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞在構(gòu)建具有疫霉菌誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草或轉(zhuǎn)基因大 豆中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104212831SQ201410469888
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】竇道龍, 柴春月, 曾文韜 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)