樓來牛胚胎冷凍液、冷凍方法及解凍方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種用于樓來牛胚胎冷凍液、冷凍方法及解凍方法，屬生物工程及胚胎遺傳【技術(shù)領(lǐng)域】。樓來牛胚胎冷凍液包括乙二醇、蔗糖和DMS0?冷凍方法包括胚胎的獲取、冷凍預(yù)處理、胚胎裝管和胚胎冷凍。解凍方法是麥管在空氣中停留5-10s后，放入35-38°C水浴10-15s，將胚胎檢出移到WM1液滴中后，移入含相同溶液的另一孔液滴中，再分別移入WM2和含HM為800rt/孔的液滴中，每次停留時間均為5min;胚胎在培養(yǎng)液中洗滌三次后，在培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)觀察胚胎發(fā)育情況或者移植到已經(jīng)同期發(fā)情處理的受體母牛。本發(fā)明冷凍液、冷凍方法及解凍方法具有冷凍效果好，可操作性強(qiáng)、操作方便、利于推廣應(yīng)用。
【專利說明】樓來牛胚胎冷凍液、冷凍方法及解凍方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及生物工程及胚胎遺傳【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種用于樓來牛胚胎冷凍 液、冷凍方法及解凍方法。

【背景技術(shù)】
[0003] 胚胎冷凍保存技術(shù)是胚胎移植技術(shù)進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用和發(fā)展階段的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 該技術(shù)可以使胚胎移植不受時間、地域限制，簡化活畜運(yùn)輸和引種的費(fèi)用，防止疫病傳播 等。利用這項(xiàng)技術(shù)還可以建立良種家畜和瀕危動物胚胎庫，有效地保存各種優(yōu)良品種和瀕 危物種的遺傳資源。目前在胚胎冷凍保存研究中主要是尋求毒性低的抗凍保護(hù)劑、有效合 理、易于操作的方法以及胚胎對低溫敏感的決定性因素等方面進(jìn)行研究，并試圖從動物基 因型、胚胎細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等方面尋求突破點(diǎn)，提高胚胎冷凍的效果。
[0004] 在胚胎冷凍過程中，正確的操作方法、抗凍保護(hù)劑的選擇和合理搭配、嚴(yán)格的解凍 方法對減少由于冷凍給胚胎造成的損傷顯得尤為重要。國內(nèi)外對于操作的規(guī)范化、抗凍保 護(hù)劑的合理搭配等方面都進(jìn)行了研究，但如何合理的在保證正確的操作前提下，冷凍液中 加入冷凍保護(hù)劑的種類與冷凍程序都密切關(guān)系到胚胎冷凍、解凍后的存活率與其隨后的受 胎率。胚胎冷凍過程中，常用的冷凍保護(hù)劑是甘油、乙二醇和蔗糖。用上述三種冷凍保護(hù)劑 對牛體內(nèi)胚胎進(jìn)行冷凍，胚胎的冷凍效果不盡相同，解凍后的存活率及妊娠率受到不同程 度影響，這成為了限制牛胚胎移植技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展的一大難題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是解決胚胎冷凍效果不同的難題，提供一種冷凍效果好，方法簡便， 解凍后復(fù)蘇率高，易于樓來牛在生產(chǎn)應(yīng)用推廣，采用乙二醇、蔗糖、DMS0作為冷凍劑對樓來 牛體內(nèi)胚胎進(jìn)行冷凍保存，為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的技術(shù)方案是： 一種樓來牛胚胎冷凍液，冷凍液包括乙二醇、蔗糖和DMS0 ;所述的各組分重量份數(shù)為 乙二醇90-100、蔗糖45-60和DMS080-100 ;所述的冷凍液還包括TCM-HEPES ;配制時，將蔗 糖溶解于TCM-HEPES中。乙二醇、二甲亞砜是低分子中性物質(zhì)，屬滲透型抗凍劑，在溶液中 易結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，使溶液的粘性增加，從而弱化了水的結(jié)晶過程，起到保護(hù)作 用。而蔗糖屬非滲透型抗凍劑，能溶于水，但不能進(jìn)入細(xì)胞，它使溶液呈過冷狀態(tài)。
[0006] 所述的乙二醇 95-100、蔗糖 50-55 和 DMS085-95,所述的 TCM-HEPES 含 20%FCS，所 述的蔗糖濃度為25-30%。
[0007] 所述的乙二醇90-95、蔗糖45-60和DMS090-100,所述的蔗糖濃度為26-29%。
[0008] -種樓來牛胚胎冷凍方法，使用以上所述的乙二醇、蔗糖和DMS0冷凍，具體步驟 如下： (1)胚胎的獲取，取第5?8天桑椹胚和囊胚；放入盛有保存液的培養(yǎng)皿中；篩選出優(yōu) 秀胚胎和優(yōu)良胚胎； (2) 冷凍預(yù)處理，將篩選的胚胎在HM液洗滌2-5次后，移入至VS1液，停留l-3min后， 再移入VS2液中，備用；所述的HM液是含20%FCS的TCM-HEPES ;所述的VS1是80〇μ1 HM、 ΙΟΟμΙ EG 和 ΙΟΟμΙ DMSO ;所述的 VS2 是 60〇μ1 ΗΜ、20〇μ1 EG 和 20(^DMS0 ; (3) 胚胎裝管，麥管先吸入2P1VS1液后，吸入空氣泡，然后吸入步驟（2)中含有胚胎的 VS2液后，繼續(xù)吸入空氣泡，最后以VS1液封存； (4) 胚胎冷凍，將步驟（3)裝管的胚胎進(jìn)行冷凍，在液氮面停留30-50S后浸入到液氮中 冷凍。
[0009] 所述的胚胎取自第6-8天桑椹胚和囊胚，所述的保存液是VS1和VS2,所述的培養(yǎng) 皿直徑為35mm。
[0010] 所述的胚胎在HM液中洗滌2-3次，移入VS1液，停留時間l-2min。
[0011] 一種樓來牛胚胎解凍方法，將以上冷凍的胚胎進(jìn)行解凍，將麥管從液氮中取出， 在空氣中停留5-10s后，放入35-38°C水浴10-15s，將胚胎檢出移到麗1液滴中后，移入 含相同溶液的另一孔液滴中，再分別移入麗2和含HM為80〇μ1 /孔的液滴中，每次停留 時間均為5min ;胚胎在培養(yǎng)液中洗滌三次后，在培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)觀察胚胎發(fā)育情況或者 移植到已經(jīng)同期發(fā)情處理的受體母牛；所述的麗1是ΗΜ80〇μ1和SM40(^1 ;所述的麗2是 ΗΜ800μ1+5Μ200μ1 ;所述的 SM 液是含 28. 5% 蔗糖（W/V) TCM-HEPES。
[0012] 所述的培養(yǎng)液是WM1、WM2和ΗΜ，在空氣中停留5-8s，放入35-36°C水浴10-12s。
[0013] 本發(fā)明的有益效果在于：冷凍效果比常用甘油、乙二醇和蔗糖提高10-20%，使用 該試劑解凍后解凍后可獲得90%以上復(fù)蘇率及85%以上的孵化率，胚胎移植妊娠率達(dá)到55% 以上。使用該方法操作簡便，易于在生產(chǎn)中應(yīng)用推廣的胚胎冷凍保存方法，可操作性強(qiáng)、操 作方便、利于推廣應(yīng)用。

【具體實(shí)施方式】
[0014] 一種樓來牛胚胎冷凍液，冷凍液包括乙二醇、蔗糖和DMS0 ;所述的各組分重量份 數(shù)為乙二醇90-100、蔗糖45-60和DMS080-100 ;所述的冷凍液還包括TCM-HEPES ;配制時， 將蔗糖溶解于TCM-HEPES中。
[0015] 所述的乙二醇 95-100、蔗糖 50-55 和 DMS085-95,所述的 TCM-HEPES 含 20%FCS，所 述的蔗糖濃度為25-30%。
[0016] 所述的乙二醇90-95、蔗糖45-60和DMS090-100,所述的蔗糖濃度為26-29%。
[0017] 一種樓來牛胚胎冷凍方法，使用以上所述的乙二醇、蔗糖和DMS0冷凍，具體步驟 如下： (1) 胚胎的獲取，取第5?8天桑椹胚和囊胚；放入盛有保存液的培養(yǎng)皿中；篩選出優(yōu) 秀胚胎和優(yōu)良胚胎； (2) 冷凍預(yù)處理，將篩選的胚胎在HM液洗滌2-5次后，移入至VS1液，停留l-3min后， 再移入VS2液中，備用；所述的HM液是含20%FCS的TCM-HEPES ;所述的VS1是80〇μ1 HM、 10〇μ1 EG 和 10〇μ1 DMS0 ;所述的 VS2 是 60〇μ1 ΗΜ、20〇μ1 EG 和 20(^DMS0 ; (3) 胚胎裝管，麥管先吸入2P1VS1液后，吸入空氣泡，然后吸入步驟（2)中含有胚胎的 VS2液后，繼續(xù)吸入空氣泡，最后以VS1液封存； (4)胚胎冷凍，將步驟（3)裝管的胚胎進(jìn)行冷凍，在液氮面停留30-50s后浸入到液氮中 冷凍。
[0018] 所述的胚胎取自第6-8天桑椹胚和囊胚，所述的保存液是VS1和VS2,所述的培養(yǎng) 皿直徑為35mm。
[0019] 所述的胚胎在HM液中洗滌2-3次，移入VS1液，停留時間l-2min。
[0020] -種樓來牛胚胎解凍方法，將以上冷凍的胚胎進(jìn)行解凍，將麥管從液氮中取出， 在空氣中停留5-10s后，放入35-38°C水浴10-15s，將胚胎檢出移到麗1液滴中后，移入 含相同溶液的另一孔液滴中，再分別移入麗2和含HM為80〇μ1 /孔的液滴中，每次停留 時間均為5min ;胚胎在培養(yǎng)液中洗滌三次后，在培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)觀察胚胎發(fā)育情況或者 移植到已經(jīng)同期發(fā)情處理的受體母牛；所述的麗1是ΗΜ80〇μ1和SM40(^1 ;所述的麗2是 ΗΜ800μ1+5Μ200μ1 ;所述的 SM 液是含 28. 5% 蔗糖（W/V)TCM-HEPES。
[0021] 所述的培養(yǎng)液是WM1、WM2和HM，在空氣中停留5-8s，放入35-36°C水浴10-12s。
[0022] 實(shí)施例1 1、胚胎的獲取 用非手術(shù)法對經(jīng)超數(shù)排卵處理的供體牛進(jìn)行沖胚，首先將供體牛固定在保定架內(nèi)，在 供體牛薦尾結(jié)合部硬鞘膜外腔內(nèi)注射5%鹽酸利多卡因(按牛的體重合理注射)麻醉后，進(jìn)行 沖胚(從子宮采集6?8天的桑椹胚或早期囊胚)。把盛有沖卵回收液的集卵杯放在體視顯 微鏡下，由低倍到高倍，仔細(xì)觀察，檢出胚胎放入盛有保存液的Φ 35毫米培養(yǎng)皿中。
[0023] 體視顯微鏡下進(jìn)行質(zhì)量鑒定，嚴(yán)格按照胚胎質(zhì)量鑒定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定。將優(yōu)秀、良好 級胚胎進(jìn)行冷凍。
[0024] 2、胚胎預(yù)處理 將胚胎在HM液洗滌2次后，移入至VS1液中，停留lmin后再移入VS2液中，所述的HM 液是含 20%FCS 的 TCM-HEPES ;所述的 VS1 是 80〇μ1 ΗΜ、10〇μ1 EG 和 10〇μ1 DMS0 ;所述的 VS2 是 60〇μ1 SM、20〇μ1 EG 和 20(^DMS0;所述的 SM 液是含 28·5%蔗糖（W/V)TCM-HEPES;。
[0025] 3、胚胎裝管， 麥管先吸入1_5P1VS1液后，吸入空氣泡，然后吸入步驟2中含有胚胎的VS2液后，繼續(xù) 吸入空氣泡，最后以VS1液封存。
[0026] 4、胚胎冷凍 胚胎裝管結(jié)束，立即浸入到液氮中冷凍，胚胎凍前停留在VS2液中的時間控制在30sec 內(nèi)。
[0027] 5、胚胎的解凍 胚胎解凍時，將麥管從液氮中取出，在空氣中停留5sec，然后放入35°C水浴lOsec，隨 即將胚胎放入培養(yǎng)液中，胚胎在培養(yǎng)液中洗滌三次后，在培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)觀察胚胎發(fā)育 情況或者移植到已經(jīng)同期發(fā)情處理的受體母牛。
【權(quán)利要求】
1. 一種樓來牛胚胎冷凍液，其特征在于，冷凍液包括乙二醇、蔗糖和DMSO ;所述的各組 分重量份數(shù)為乙二醇90-100、蔗糖45-60和DMS080-100 ;所述的冷凍液還包括TCM-HEPES ; 配制時，將蔗糖溶解于TCM-HEPES中。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樓來牛胚胎冷凍液，其特征在于，所述的乙二醇95-100、蔗糖 50-55和DMS085-95,所述的TCM-HEPES含20%FCS，所述的蔗糖濃度為25-30%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的樓來牛胚胎冷凍液，其特征在于，所述的乙二醇90-95、蔗糖 45-60和DMS090-100,所述的蔗糖濃度為26-29%。
4. 一種樓來牛胚胎冷凍方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1所述的乙二醇、蔗糖和DMS0 冷凍，具體步驟如下： (1) 胚胎的獲取，取第5?8天桑椹胚和囊胚；放入盛有保存液的培養(yǎng)皿中；篩選出優(yōu) 秀胚胎和優(yōu)良胚胎； (2) 冷凍預(yù)處理，將篩選的胚胎在HM液洗滌2-5次后，移入至VS1液，停留l-3min后， 再移入VS2液中，備用；所述的HM液是含20%FCS的TCM-HEPES ;所述的VS1是80〇μ1 HM、 10〇μ1 EG 和 10〇μ1 DMSO ;所述的 VS2 是 60〇μ1 ΗΜ、20〇μ1 EG 和 20(^DMS0 ; (3) 胚胎裝管，麥管先吸入2P1VS1液后，吸入空氣泡，然后吸入步驟（2)中含有胚胎的 VS2液后，繼續(xù)吸入空氣泡，最后以VS1液封存； (4) 胚胎冷凍，將步驟（3)裝管的胚胎進(jìn)行冷凍，在液氮面停留30-50S后浸入到液氮中 冷凍。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的樓來牛胚胎冷凍方法，其特征在于，所述的胚胎取自第6-8天 桑椹胚和囊胚，所述的保存液是VS1和VS2,所述的培養(yǎng)皿直徑為35mm。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的樓來牛胚胎冷凍方法，其特征在于，所述的胚胎在HM液中洗 滌2-3次，移入VS1液，停留時間l-2min。
7. -種樓來牛胚胎解凍方法，其特征在于，將權(quán)利要求4冷凍的胚胎進(jìn)行解凍，將麥管 從液氮中取出，在空氣中停留5-10s后，放入35-38°C水浴10-15s，將胚胎檢出移到麗1液 滴中后，移入含相同溶液的另一孔液滴中，再分別移入WM2和含HM為80〇μ1 /孔的液滴中， 每次停留時間均為5min ;胚胎在培養(yǎng)液中洗滌三次后，在培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)觀察胚胎發(fā)育 情況或者移植到已經(jīng)同期發(fā)情處理的受體母牛；所述的麗1是ΗΜ80〇μ1和SM40(^1 ;所述的 WM2 是 ΗΜ800μ1+3Μ200μ1 ;所述的 SM 液是含 28. 5% 蔗糖（W/V) TCM-HEPES。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的樓來牛胚胎解凍方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)液是WM1、WM2 和HM，在空氣中停留5-8s，放入35-36°C水浴10-12s。
【文檔編號】A01N1/02GK104206376SQ201410471039
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】蔣和生 申請人:南寧培元基因科技有限公司