一種羽葉三七達瑪烯二醇合酶基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種羽葉三七達瑪烯二醇合酶基因及其應(yīng)用，本專利首次利用第二代SolexaHiSeq2000進行羽葉三七根莖轉(zhuǎn)錄組測序及 Denovo 拼接。分析找到羽葉三七中編碼達瑪烯二醇合成酶（DS）的候選基因并進行體外克隆，最終獲得了羽葉三七達瑪烯二醇合酶基因，其序列為SEQIDNO.1所示。將該基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入羽葉三七，可獲得高達瑪烷皂苷含量的的轉(zhuǎn)基因植株，為達瑪烷型皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)支撐。
【專利說明】—種羽葉三七達瑪烯二醇合酶基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，主要涉及羽葉三七中達瑪烯二醇合成酶(Dammarened1l synthase, DS)基因的克隆和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]羽葉三七(Panaxjaponicus.C.A.Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) C.Y.Wu etΚ.Μ.Feng)屬于五加科人參屬(Panax L.)植物,是傳統(tǒng)的名貴藥材之一,具有較高的藥用價值，如清熱解毒、順氣健胃、活血祛疲、滋補強壯等作用，其主要有效成分為皂苷類化合物，其中以齊墩果烷型五環(huán)三萜類皂苷為主，同時含有少量達瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷。
[0003]羽葉三七是中國藥典收載品種。具有廣闊的應(yīng)用前景和可觀的經(jīng)濟價值，目前中國羽葉三七的野生資源近于瀕危，通過研究羽葉三七中活性成分三萜皂苷類化合物的生物合成途徑及其調(diào)控的分子機制，找出其中的關(guān)鍵酶，實現(xiàn)其基因的定位、克隆及高效表達，在分子水平上對三萜皂苷生物合成進行人工調(diào)控，進一步實現(xiàn)三萜皂苷類化合物的規(guī)模生產(chǎn)，以提供醫(yī)藥市場的需求。
[0004]羽葉三七中的達瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷化合物來自于異戊二烯途徑。2，3-氧化角鯊烯的環(huán)化是三萜皂苷合成下游途徑中的關(guān)鍵步驟，這一步由達瑪烯二醇合成酶(DS)催化產(chǎn)生原人參二醇，以該化合物為基礎(chǔ)在下游最終合成各種達瑪烷型皂苷。因此，該反應(yīng)步驟是三萜皂苷生物合成的重要調(diào)控位點。
[0005]迄今為止，關(guān)于羽葉三七活性成分代謝途徑的生物合成研究尚屬空白，羽葉三七中達瑪烯二醇合成酶(DS)基因的克隆研究也未見相關(guān)報道。本專利首次利用第二代Solexa HiSeq2000進行羽葉三七根莖轉(zhuǎn)錄組測序及De novo拼接。分析找到羽葉三七中編碼達瑪烯二醇合成酶(DS)的候選基因并進行體外克隆、表達驗證，羽葉三七中的達瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷化合物來自于異戊二烯途徑。2，3-氧化角鯊烯的環(huán)化是三萜皂苷合成下游途徑中的關(guān)鍵步驟，這一步由達瑪烯二醇合成酶(DS)催化產(chǎn)生原人參二醇，以該化合物為基礎(chǔ)在下游最終合成各種達瑪烷型皂苷。因此，該反應(yīng)步驟是三萜皂苷生物合成的重要調(diào)控位點，為進一步了解該酶在羽葉三七植物體內(nèi)基因表達、功能與作用機制奠定了研究基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種羽葉三七達瑪烯二醇合酶(DS)基因，其序列為SEQ IDN0.1所示。該基因編碼的達瑪烯二醇合酶在達瑪烷型皂苷化合物合成途徑中起關(guān)鍵性作用。
[0007]本發(fā)明第二個目的是提供一種羽葉三七達瑪烯二醇合酶基因編碼的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID N0.2所示。
[0008]本發(fā)明的最后一個目的在于提供羽葉三七達瑪烯二醇合酶基因在提高人參屬植物達瑪烷型皂苷化合物含量中的應(yīng)用，特別是在提高羽葉三七達瑪烷型皂苷化合物含量中的應(yīng)用。
[0009]為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施:
[0010]一種羽葉三七達瑪烯二醇合酶基因(Dammarened1l synthase,以下簡稱DS基因)，其制備方法如下:
[0011]以羽葉三七的CDNA鏈為模板，以正向引物Pl:5’ -ATGTGGAAGCTGAAGGTTGCTCAAG-3’，反向引物 P2:5’ -TTAAATTTTGAGCTGCTGGTGGT-3’，進行 PCR 擴增。擴增體系如下:1Xbuffer 2.5ul, dNTP I ul，引物 Pl 和 P2 各 lul，Taq 酶 0.5 ul，模版 lul，其余用水補足，總體積共25ul。反應(yīng)條件:30個反應(yīng)循環(huán)，94°C變性lmin，42°C退火2min，75°C延伸3min,最后 75°C延伸 lOmin。
[0012]最終獲得了 DS基因，其序列為SEQ ID N0.1所示，編碼的蛋白質(zhì)為SEQ ID N0.2所示。
[0013]一種羽葉三七達瑪烯二醇合成酶(DS)基因在提高羽葉三七達瑪烷型皂苷化合物含量中的應(yīng)用，其應(yīng)用過程如下:
[0014]將羽葉三七達瑪烯二醇合成酶蛋白質(zhì)(SEQ ID N0.2所示)對應(yīng)的DS基因(優(yōu)選SE Q ID N0.1所示)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入羽葉三七，可獲得高達瑪烷皂苷含量的的轉(zhuǎn)基因植株。
[0015]本發(fā)明的所要保護的內(nèi)容還包括:
[0016]編碼SEQ ID N0.2所示氨基酸的核苷酸序列；優(yōu)選SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列
[0017]含有本發(fā)明的羽葉三七達瑪烯二醇合酶(DS)基因全序列或其ORF序列的重組載體，如原核類載體，真核類表達載體及RNAi載體均屬于本發(fā)明的保護范圍，所述原核類載體包括但不限于pT7-Blue ;所述真核類表達載體包括但不限于pYES2、pBI 121，pRS314。
[0018]含有本發(fā)明的羽葉三七達瑪烯二醇合酶(DS)基因全序列或其ORF序列宿主細胞，如含有上述的重組載體的宿主細胞也屬于本發(fā)明的保護范圍，包括但不限于E.col1、煙草、擬南芥、酵母宿主菌GIL77、大腸桿菌、羽葉三七等活體材料。
[0019]本發(fā)明的羽葉三七達瑪烯二醇合酶(DS)基因的應(yīng)用，包括用所述的重組載體，如植物表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞；或者用所述的發(fā)根細胞再生植株；或者用所述的羽葉三七達瑪烯二醇合酶(DS)基因全序列或其ORF序列轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因生物體。
[0020]利用本發(fā)明的羽葉三七達瑪烯二醇合酶(DS)，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與羽葉三七達瑪烯二醇合酶(DS)發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0022]本發(fā)明所提供的羽葉三七達瑪烯二醇合酶(DS)基因是首次從羽葉三七中克隆制備的，利用本發(fā)明的技術(shù)可以對羽葉三七等含有同類化合物的藥用植物進行基因工程改造，通過轉(zhuǎn)基因來提高植物體內(nèi)的達瑪烷皂苷化合物的含量。羽葉三七達瑪烯二醇合成酶(DS)基因可參與羽葉三七達瑪烷型皂苷化合物的生物合成，因此本申請為羽葉三七達瑪烷型皂苷化合物生物合成的進一步研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。
[0023]進一步添加其產(chǎn)業(yè)上的積極效果，本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了達瑪烷型皂苷化合物含量增加的高產(chǎn)株，為達瑪烷型皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)支撐。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為羽葉三七RNA電泳圖。
[0025]圖2為DS功能域預(yù)測分析示意圖。
[0026]圖3為DS系統(tǒng)進化樹。
[0027]采用鄰接法構(gòu)建PpgDS系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0028]圖4為酶活力檢測示意圖。
[0029]HPLC檢測酶促產(chǎn)物，圖A酶產(chǎn)物被HPLC檢測分析，檢測紫外波長為202nm ;B圖為達瑪烯二醇HPLC分析圖。

【具體實施方式】
[0030]本發(fā)明所述方案如未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案，所用試劑如未特別說明，均購自生化商店。
[0031]實施例1
[0032]羽葉三七根莖轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析
[0033]1、樣品采集
[0034]四年生羽葉三七(Panax japonicus.C.A.Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) C.Y.Wuet Κ.M.Feng)采自湖北恩施。分別取根莖、葉、花，果實置液氮中速凍后，在_80°C冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0035]2、羽葉三七總RNA的分離和檢測
[0036]對_80°C保存的各類樣本于液氮中充分研磨，然后采用優(yōu)化的Trizol法對樣本進行總RNA的提取，全過程保證在低溫條件下進行，加入一定濃度的PVP溶液(聚乙烯吡咯烷酮)，并適當加大β -巰基乙醇的濃度，離心去除PVP和β -巰基乙醇后，采用高濃度NaAc溶液析出RNA，DNase去除殘留DNA完成RNA的純化。用1.0%瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性(圖1)，用Nanodrop2000核酸定量儀測定A260、A280比值和濃度，RNA樣本置于_80°C冰箱備用。
[0037]3、轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)
[0038]用oligo(dT)的磁珠從總 RNA 中富集 mRNA,接加入 fragmentat1n buffer 將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板,用六堿基隨機引物(random hexamers)合成第一條cDNA鏈,然后加入緩沖液、dNTPs> RNase H和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈,在經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并被EB緩沖液洗脫之后進行末端修復(fù)、加poly (A)并連接測序接頭，瓊脂糖凝膠電泳分離并選擇片段大小，PCR擴增構(gòu)建測序文庫，利用第二代SolexaHiSeq2000進行RNA測序，及De novo拼接。
[0039]4、候選基因初步篩
[0040]通過GO注釋，Blast比對分析以及MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)等軟件分析初步找到羽葉三七中編碼達瑪烯二醇合酶的候選基因。
[0041]實施例2:
[0042]羽葉三七達瑪烯二醇合酶基因的克隆:
[0043]利用正向引物Pl:5’ -ATGTGGAAGCTGAAGGTTGC-3’，反向引物 P2:5’ -TTAAATTTTGAGCTGCTGGTGG-3’，以羽葉三七根莖cDNA文庫為模板擴增候選基因全長序列進行P CR擴增。擴增體系如下:10 Xbuffer 2.5ul, dNTP I ul，引物 Pl 和 P2 各 lul，Taq 酶 0.5ul，模版lul，其余用水補足，總體積共25ul。反應(yīng)條件:30個反應(yīng)循環(huán)，94°C變性lmin，42°C退火2min，75°C延伸 3min。最后 75°C延伸 1min0
[0044]克隆候選基因全長序列后，鏈接到克隆載體pT7_Blue上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞E.coli DH5a中，步驟如下:
[0045]a)從_80°C超低溫冰箱中取100 μ L感受態(tài)細胞懸液，解凍后置于冰上；
[0046]b)加入5 μ L連接產(chǎn)物，用移液器輕輕吹打混勻，冰上放置30min ；
[0047]c) 42°C熱激90s，迅速置冰上5min ；
[0048]d)向EP管中加入ImL LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，37°C 200rpm 45min ；
[0049]e)搖菌后取100 μ L菌液涂布于含抗生素的平板上，37°C培養(yǎng)箱過夜；
[0050]f)挑取單菌落于4mL含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 200rpm振蕩培樣過夜選取陽性克隆送樣測序。
[0051]至此獲得了羽葉三七達瑪烯二醇合酶基因，其序列為SEQ ID N0.1所示。
[0052]實施例3:
[0053]DS基因的生物信息學分析
[0054]本發(fā)明獲得的羽葉三七達瑪烯二醇合酶(DS)基因全長為2310bp，其序列為SEQID N0.1所示，其中開放讀碼框位于I?2310bp，編碼的蛋白質(zhì)序列為SEQ ID N0.2所示。將拼接分析好的達瑪烯二醇合酶全長序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast，該基因具有典型的IS0PREN_C2_like superfamily 結(jié)構(gòu)域，如圖 2。
[0055]實施例4:
[0056]DS基因功能的研究
[0057]1、表達載體的構(gòu)建
[0058]以羽葉三七DS cDNA為模版，利用正向引物Pl: 5’ -GGTACCATGTGGAAGCTGAAGGTTGC-3’ ；反向引物 P2:5’ -CTCGAGTTAAATTTTGAGCTGCTGGTGG-3’ 進行 PCR 反應(yīng)，取 5ul 擴增產(chǎn)物凝膠電泳，半小時后照相，觀察膠圖，擴增片段為2322bp。以KpnI和XhoI酶切擴增產(chǎn)物2小時，利用回收試劑盒(Takara公司，中國)純化酶切產(chǎn)物。同時利用Kp nl和XhoI酶在37°C下酶切pRS314載體2小時，再進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察膠圖，并利用試劑盒回收大小約4761bp的片段。
[0059]二者經(jīng)連接酶在16°C連接過夜。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，在含有氨芐霉素的LB平板上篩選重組子。含DS克隆的pRS314質(zhì)粒經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切電泳鑒定和DNA序列分析，保存且有正確目標的重組質(zhì)粒PRS314-DS用于表達轉(zhuǎn)化。該表達載體命名為 pRS314-DS。
[0060]2、蛋白的誘導(dǎo)表達
[0061]以PRS314-DS質(zhì)粒轉(zhuǎn)化部分酶解酵母宿主菌AB1380，培養(yǎng)5天后篩選陽性酵母于2ml含2%葡萄糖的USM培養(yǎng)基上，4_5天后挑取單克隆2ml USM液體培養(yǎng)基中，30°C劇烈震蕩培養(yǎng)過夜。5000rpm離心培養(yǎng)5min，棄上清，以含2%葡萄糖的USM液體培養(yǎng)基稀釋20倍，30°C劇烈震蕩培養(yǎng)24h。提取培養(yǎng)細胞總蛋白。選取高表達轉(zhuǎn)化子以50ml含2%葡萄糖的USM液體培養(yǎng)基30°C劇烈震蕩培養(yǎng)20h后，接種到IL不含葡萄糖的USM液體培養(yǎng)基30°C劇烈震蕩培養(yǎng)40h，回收菌體，分離微粒體，純化蛋白。
[0062]3、酶促反應(yīng)鑒定
[0063]體外酶促反應(yīng)以2，3-氧鯊烯(50 umolL—1)作為反應(yīng)底物，向體系中加TritonX-100 (I mg mF1), 10 mmol L-1 Tris (pH6.0), 0.2 mmol L-1 EDTA, 2ug 純化蛋白。25°C條件下劇烈搖晃30min，后加入Iml 40% KOH終止酶促反應(yīng)。
[0064]HPLC分析其酶促產(chǎn)物。色譜柱為硅膠柱(4.6 mmX250 mm);流動相為磷酸鹽緩沖液(50 mM, pH 4.5)和乙腈(90:10, v/v),流速 I mL/min ;檢測波長為 220 nm ;柱溫 40。。。
[0065]將酶促產(chǎn)物與標準品對比，如圖4所示，經(jīng)HPLC檢測，兩種物質(zhì)波峰完全一致，則可證明，酶促產(chǎn)物為達瑪烯二醇。
[0066]實施例5:
[0067]DS在羽葉三七中進行真核表達及轉(zhuǎn)基因羽葉三七發(fā)根中達瑪烷型皂苷化合物含量的測定
[0068]轉(zhuǎn)基因用的受體材料羽葉三七(Panax japonicus.C.A.Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) C.Y.Wu et Κ.M.Feng)米自湖北恩施市。
[0069]采用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，根據(jù)羽葉三七達瑪烯二醇合酶基因的全長cDNA序列(SEQ ID N0.1)，在擴增編碼區(qū)的正反方向引物上引入限制性內(nèi)切酶位點(視選用的載體而定)，構(gòu)建植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入羽葉三七，篩選轉(zhuǎn)基因植株檢測其達瑪烷型皂苷的含量。
[0070]具體如下:
[0071]實施例2中獲得的DS基因編碼區(qū)(SEQ ID N0.1所示)連接到pMD 18-T simpleV ector的質(zhì)粒上，進行PCR擴增后，分別在正、反向引物上分別引入限制性酶切位點KpnI和 Sail，利用正向引物 Pl:5’ -GGTACCATGTGGAAGCTGAAGGTTGC-3’ ;反向引物 P2:5’ -GTCGACTTAAATTTTGAGCTGCTGGTGG-3’ 進行 PCR 反應(yīng)，TA 克隆，提取質(zhì)粒。
[0072]用KpnI和SalI雙酶切含目的基因序列PpgDS和原核表達載體質(zhì)粒pBI121，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后回收相應(yīng)的片段，PBI121載體與PpgDS目的基因片段經(jīng)T4DNA連接酶在16°C下進行連接反應(yīng)16h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，用50ug/mL卡那霉素篩選，挑取陽性單克隆菌落擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進行酶切鑒定，將酶切鑒定好的表達載體pB1-PpgDS轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，遺傳轉(zhuǎn)化羽葉三七。
[0073]利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的羽葉三七的遺傳轉(zhuǎn)化，所需的材料和操作步驟如下:
[0074]I)發(fā)根農(nóng)桿菌A4，使用前自冰箱中取出，用YEB培養(yǎng)基傳代2次，菌種在使用前接種于YEB液體培養(yǎng)基中，28 °C培養(yǎng)過夜。
[0075]2)取羽葉三七細嫩葉片，洗凈后置于70%酒精中浸泡lmin，棄酒精，加入2%次氯酸鈉消毒lOmin，期間搖動數(shù)次，棄去消毒液，用無菌水漂洗4?5次，置于無菌濾紙上晾干，用無菌刀片將羽葉三七葉片切成5mmX5mm小片，置于預(yù)培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上，在(23±1)°C暗箱培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)2d。
[0076]3)經(jīng)過夜培養(yǎng)的發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌液離心后，菌體沉淀用1/2MS重懸，置于4°C中2h后取出。將預(yù)培養(yǎng)過的羽葉三七葉片浸泡于1/2MS重懸的菌液中5min，用無菌濾紙吸去多余菌液，放入含250-500mg/L卡那霉素的1/2MS固體培養(yǎng)基中，(23±1) °C黑暗條件下培養(yǎng)，每2周轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中I次，待長出毛狀根后分離毛狀根，轉(zhuǎn)移至含250-500mg/L卡那霉素的無激素1/2MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2周轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中至無菌為止，然后再轉(zhuǎn)移至不含卡那霉素的無激素1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0077]4)把在固體培養(yǎng)基上的毛狀根繼代培養(yǎng)物接種于裝有150ml無激素1/2MS液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，培養(yǎng)溫度、光照、轉(zhuǎn)速等培養(yǎng)條件與愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)條件相同，培養(yǎng)25d后，將毛狀根從培養(yǎng)基中取出放入冷凍干燥機中進行干燥，然后稱重，貯存-80°C中備用。
[0078]陽性株利用常規(guī)real-time PCR進行進一步的篩選驗證，本發(fā)明所用方法具體如下:
[0079]提取具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化羽葉三七植株的總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，半定量所用引物為羽葉三七達瑪烯二醇合酶基因特異引物(正向引物5’ -GGTACCATGTGGAAACTGAAAGTGGC-3’ ；反向引物 5’ -GTCGACAATTTTCAGCTGCTGATGTT-3，)，反應(yīng)程序為 94°C 時 3 分鐘，94°C變性30秒，61°C退火30秒，72°C延伸45秒，25個循環(huán)；循環(huán)完成后72°C延伸5分鐘。用羽葉三七的actin基因做為內(nèi)參基因，正向引物5’-GGAAAAGATTTGGCATC-3’，反向引物5’ -GGGCGTAACCCTCATA-3’。對羽葉三七的野生型和轉(zhuǎn)化系在相同生長狀態(tài)下進行目的基因表達水平的分析。最終選擇相對于野生型植株，基因表達量的Fold-change值高于4倍以上(P〈0.01)的轉(zhuǎn)化植株作為陽性株進行目的物質(zhì)含量檢測。
[0080]5)含羽葉三七達瑪烯二醇基因的轉(zhuǎn)基因發(fā)根的達瑪烷型皂苷元含量的HPLC檢測
[0081]轉(zhuǎn)基因羽葉三七發(fā)根中達瑪烷型皂苷的含量的檢測可使用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，本發(fā)明具體采用以下步驟:
[0082]發(fā)根系樣品的前處理，用液氮將樣品研磨成粉末，各取0.1g放入茄形瓶中，加入4ml的甲醇，將裝有樣品的茄形瓶固定在蛇形冷凝管上，置于80°C的水浴鍋上，回流提取12h，將茄形瓶取出，吸出甲醇提取液，并用少量甲醇洗滌樣品粉末二至三次，一并轉(zhuǎn)入容量瓶中，定容至5ml，用0.45um有機系濾膜過濾后，即可用于HPLC進樣檢測。
[0083]采用美國Thermo Fisher公司液質(zhì)聯(lián)用儀(LCQ Fleet)的高效液相色譜儀,檢測轉(zhuǎn)基因發(fā)根中皂苷元原人參二醇(PPD)和原人參三醇(PPT)的含量，色譜柱為Hypersil0DS2C18柱(250nmX4.6mm，5um)，色譜條件如下:流動相為甲醇-水(90:10)流速1.0ml/min，柱溫25°C，檢測波長203nm。
[0084]以非轉(zhuǎn)基因羽葉三七發(fā)根系為對照，對照組和轉(zhuǎn)基因組均檢測10株，比較其達瑪烷型皂苷的平均含量。
[0085]檢測結(jié)果表明:與對照組相比，過表達羽葉三七達瑪烯二醇合酶基因的轉(zhuǎn)基因羽葉三七中，原人參二醇皂苷(PPD)的含量平均提高了 2.3倍，原人參三醇皂苷(PPT)的含量平均提高了 3.6倍。
[0086]由此證明，羽葉三七達瑪烯二醇合酶基因?qū)Υ龠M羽葉三七達瑪烷型皂苷含量的提高有顯著作用，羽葉三七達瑪烯二醇合酶基因可用于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高羽葉三七達瑪烷型皂苷含量的研究和產(chǎn)業(yè)化中，具有一定的應(yīng)用前景。
【權(quán)利要求】
1.一種分離的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，其序列為SEQID N0.1所示。
4.含有權(quán)利要求2所述核苷酸序列的植物表達載體。
5.含有權(quán)利要求4所述植物表達載體的轉(zhuǎn)基因植株。
6.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2所述的基因在提高人參屬植物達瑪烷型皂苷含量中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2所述的基因在提高羽葉三七達瑪烷型皂苷含量中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01H5/00GK104293756SQ201410479785
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月19日
【發(fā)明者】陳平, 黃璐琦, 張紹鵬, 趙小龍, 汪琪, 朱聞君, 伍翀, 王如峰, 鄧琛, 張西鋒 申請人:黃璐琦, 陳平, 張紹鵬, 張西鋒, 趙小龍, 汪琪, 陳燕, 朱聞君, 伍翀, 王如峰, 鄧琛