一種生物復(fù)配殺菌組合物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生物復(fù)配殺菌組合物，所述生物復(fù)配殺菌組合物含有5～40％吡唑醚菌酯和40~2000億CFU/g的枯草芽孢桿菌兩種活性組分。本發(fā)明還公開了上述生物復(fù)配殺菌組合物在防治草莓枯萎病中的應(yīng)用。本發(fā)明復(fù)配藥劑中枯草芽孢桿菌DJ-6和吡唑醚菌酯分別為不同作用機(jī)理的殺菌劑；該制劑對(duì)草莓重茬病害不但防治效果好，而且促進(jìn)生長(zhǎng)作用明顯，對(duì)環(huán)境友好且具有成本低和加工簡(jiǎn)易的優(yōu)點(diǎn)，明顯減少病苗和死苗發(fā)生，明顯提高重茬草莓種植產(chǎn)量和品質(zhì)，能較好滿足生產(chǎn)上農(nóng)作物病害防治的需要。
【專利說(shuō)明】-種生物復(fù)配殺菌組合物及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種生物復(fù)配殺菌組合物及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 草莓（Fragaria ananassa Duch)以其果實(shí)柔軟多汁、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、生育期 短、結(jié)果早和產(chǎn)量高等特點(diǎn)備受歡迎，在國(guó)際市場(chǎng)上具有重要的經(jīng)濟(jì)地位。由尖孢鐮刀菌草 莓?；停‵usarium oxysporum f.sp.fragariae)從根部侵染引起的草莓枯萎病，是危害 草莓的主要土傳病害，由于大棚草莓連作現(xiàn)象很普遍，從而導(dǎo)致草莓枯萎病的發(fā)生越來(lái)越 嚴(yán)重，植株發(fā)病率可達(dá)89. 2%。草莓枯萎病主要發(fā)生在高溫期，苗期或開花至收獲期均可 發(fā)病。初期僅心葉變黃綠或黃色，有的卷縮或呈波狀產(chǎn)生畸形葉，致病株葉片失去光澤，植 株生長(zhǎng)衰弱，在3片小葉中往往有1?2片畸形或變狹小硬化，且多發(fā)生在一側(cè)，老葉呈紫 紅色萎蔫，被害株的根冠部、葉柄、果梗維管束都變成褐色至黑褐色，造成草莓生長(zhǎng)發(fā)育遲 緩、匍匐莖明顯減少，草莓結(jié)果減少、果實(shí)無(wú)法正常膨大，品質(zhì)低，甚至全株枯死。
[0003] 目前對(duì)該病害仍以化學(xué)防治為主，常用惡霉靈、代森錳鋅、多菌靈和甲基托布津 等殺菌劑根部施用，長(zhǎng)期使用抗藥性嚴(yán)重，且防效不盡理想，易造成農(nóng)藥殘留超標(biāo)和污 染環(huán)境。目前成功用于防治草莓枯萎病的生物農(nóng)藥專用制劑少。文獻(xiàn)已報(bào)道生物防治 控制病害的生防菌屬（種）主要有（1)木霉菌屬真菌（Trichodermaspp.)中的綠色木 霉（Trichoderma viride)和哈茨木霉（Trichoderma harzianum) ; (2)芽抱桿菌屬細(xì) 菌（Bacillus spp.)中的枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)、多粘芽抱桿菌（Bacillus polymyxa)和巨大芽抱桿菌（Bacillus megaterium);⑶假單胞菌屬細(xì)菌（Pseudomonas spp.)中的突光假單胞細(xì)菌（Pseudomonas fluorescens)等。由于單一生防菌往往防效不 夠穩(wěn)定等因素實(shí)際使用更少，因此，必須調(diào)整對(duì)草莓枯萎病的防治策略，合理使用殺菌劑， 同時(shí)也急需篩選出更多有效防治草莓枯萎病的殺菌劑。
[0004] 枯草芽孢桿菌（拉丁文學(xué)名為Bacillus subtilis)DJ-6菌株由鎮(zhèn)江農(nóng)科所從杜 娟根部分離篩選，已于2012年7月2日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心保藏，保藏號(hào)為：CGMCC No. 6314,枯草芽孢桿菌菌體生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的枯草菌素、多粘菌 素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)對(duì)致病菌或內(nèi)源性感染的條件致病菌有 明顯的抑制作用。吡唑醚菌酯又名唑菌胺酯，為新型廣譜殺菌劑，其作用機(jī)理為線粒體呼吸 抑制劑，即通過(guò)在細(xì)胞色素合成中阻止電子轉(zhuǎn)移，具有保護(hù)、治療、葉片滲透?jìng)鲗?dǎo)作用，該化 合物低毒，對(duì)非靶標(biāo)生物安全，而且對(duì)使用者和環(huán)境均安全友好，已被美國(guó)環(huán)保局列為"減 小風(fēng)險(xiǎn)的候選藥劑"。
[0005] 采用枯草芽孢桿菌DJ-6和吡唑醚菌酯混配，彌補(bǔ)單一生防菌劑的不足，提高生物 農(nóng)藥的使用效果，也能減少化學(xué)防治。目前枯草芽孢桿菌DJ-6和吡唑醚菌酯的相關(guān)復(fù)配劑 沒有報(bào)道，試驗(yàn)增效顯著，對(duì)草莓枯萎病的效果明顯好于單一制劑，能較好滿足生產(chǎn)上農(nóng)作 物作物病害防治的需要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供了一種防治效果較好且高效低毒的生物復(fù) 配殺菌組合物。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了上述殺菌組合物的應(yīng)用。長(zhǎng)期連作設(shè)施草莓 枯萎病等發(fā)生嚴(yán)重，生產(chǎn)中常用惡霉靈、多菌靈等化學(xué)農(nóng)藥根部施用，但草莓為不去果皮的 鮮食為主的水果，防止農(nóng)藥殘留提高安全品質(zhì)事關(guān)人們的健康，由于在草莓重茬病害上應(yīng) 用的生物農(nóng)藥少，且因防效不夠穩(wěn)定等因素實(shí)際使用更少，為了提高生物農(nóng)藥的使用效果， 替代或減少化學(xué)防治，本發(fā)明通過(guò)對(duì)枯草芽孢桿菌DJ-6和吡唑醚菌酯混配科學(xué)組合防治 連作草莓田枯萎病等。
[0007] 技術(shù)方案：為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種生物復(fù)配殺菌組合物，所述生 物復(fù)配殺菌組合物含有5?40%吡唑醚菌酯和40?2000億CFU/g的枯草芽孢桿菌DJ-6 兩種活性組分。
[0008] 其中，上述枯草芽孢桿菌DJ-6與吡唑醚菌酯重量比為1:1?1:5。
[0009] 其中，上述生物復(fù)配殺菌組合物為20 %吡唑醚菌酯· 200億CFU/g枯草芽孢桿菌 DJ-6的可濕性粉劑。
[0010] 其中，上述生物復(fù)配殺菌組合物還包括助劑和填料。
[0011] 其中，上述殺菌組合物的劑型為可濕性粉劑、水乳劑、懸浮劑或水分散粒劑中的一 種。
[0012] 其中，上述助劑為表面活性劑和分散劑。
[0013] 其中，上述表面活性劑為十二烷基硫酸鈉，分散劑為NNO。
[0014] 其中，上述填料為白炭黑或高嶺土中的一種或幾種。
[0015] 上述的一種生物復(fù)配殺菌組合物在防治草莓枯萎病中的應(yīng)用。
[0016] 在連作重茬的草莓田，草莓苗定植時(shí)將所述的殺菌組合物稀釋1000-3000倍液， 每株灌根250ml。
[0017] 有益效果：本發(fā)明復(fù)配藥劑中枯草芽孢桿菌DJ-6和吡唑醚菌酯分別為不同作用 機(jī)理的殺菌劑；該制劑對(duì)草莓重茬病害不但防治效果好，而且促進(jìn)生長(zhǎng)作用明顯，對(duì)環(huán)境友 好且具有成本低和加工簡(jiǎn)易的優(yōu)點(diǎn)，明顯減少病苗和死苗發(fā)生，明顯提高重茬草莓種植產(chǎn) 量和品質(zhì)，能較好滿足生產(chǎn)上農(nóng)作物病害防治的需要。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 供試原藥（母藥）：1000億CFU/g枯草芽孢桿菌DJ-6 (BaciIlus subtiIi)母藥， 由鎮(zhèn)江農(nóng)科所現(xiàn)代研究室提供；97%吡唑醚菌酯（Pyraclostrobin)原藥，由江蘇耘農(nóng)化工 有限公司提供。
[0019] 本發(fā)明的生物組合殺菌組合物可制成可濕性粉劑，將吡唑醚菌酯（折百重 量）20g，1000億CFU/克枯草芽孢桿菌DJ-620g，十二烷基硫酸鈉40g，擴(kuò)散劑NN0460g，白炭 黑100g，高嶺土余量，加至1000g，混合物進(jìn)行氣流粉碎，制得20%吡唑醚菌酯·200億CFU/ g枯草芽孢桿菌DJ-6的可濕性粉劑。
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 1、室內(nèi)抑菌活性測(cè)定
[0022] I. 1試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)
[0023] 于2012年4一7月份在鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究室實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。
[0024] L 2供試菌株
[0025] 草莓枯萎病菌，采自江蘇省句容市大棚草莓，品種為紅頰，由鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究 所現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究室分離、鑒定、及按照柯郝法則（Koch's Rule)驗(yàn)證后并保存?zhèn)溆?。菌株?存于馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA)斜面上（4°C )。
[0026] 1. 3供試藥劑
[0027] 1000億CFU/克枯草芽孢桿菌DJ-6 (Bacillus subtiIi)母藥，由鎮(zhèn)江農(nóng)科所現(xiàn)代 研究室提供；97%吡唑醚菌酯（(Pyraclostrobin)原藥，由江蘇耘農(nóng)化工有限公司提供。
[0028] 1.4儀器設(shè)備
[0029] 電子天平（感量0. lmg)、GZP-300A培養(yǎng)箱、直徑為75mm的培養(yǎng)皿、三角瓶、移液 器、移液管、洗耳球、打孔器、接種刀等。
[0030] 1. 5試驗(yàn)方法
[0031] I. 5. 1藥液的配制及濃度設(shè)計(jì)
[0032] (1)母液配制：將1000億CFU/g枯草芽孢桿菌DJ-6母藥加無(wú)菌水配成10000 μ g/ mL，97%吡唑醚菌酯原藥用適量丙酮溶解后并加入10%的吐溫-80,配制成ΙΟΟΟμ g/mL母 液，置于4°C冰箱中備用。
[0033] (2)各藥劑單劑與復(fù)配劑的濃度設(shè)計(jì)：枯草芽孢桿菌DJ-6、吡唑醚菌酯以及枯草 芽孢桿菌〇1-6與吡唑醚菌酯（1:1、1 :2、1:3、1:4和1:5)復(fù)配劑在含藥？54中的濃度設(shè)計(jì) 均為 100. 00、50· 00、25· 00、12· 50、6· 25,3· 125, L 5625 和 0· 78125μ g/mL，8 個(gè)不同濃度梯 度的PSA培養(yǎng)基。除母液外，所有試驗(yàn)藥劑系列濃度的藥液均為現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0034] 1. 5. 2試驗(yàn)方法
[0035] 采用菌絲生長(zhǎng)速率法，將各單劑與復(fù)配劑的藥液依次稀釋至所需濃度，然后將ImL 藥液與9mL培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿內(nèi)混勻，制成含系列濃度藥劑的PSA培養(yǎng)基，采用無(wú)菌水作空白 對(duì)照，各處理重復(fù)4次。將保留的草莓枯萎病菌轉(zhuǎn)接到PSA平皿中，在25°C下活化72h，然 后在近菌落邊緣用打孔器制取直徑為5_的菌餅，并轉(zhuǎn)接到含藥的PSA平皿和空白對(duì)照中。 25 °C培養(yǎng)96h，待對(duì)照中菌落長(zhǎng)至約平皿直徑的4/5時(shí)，采用十字交叉法量取菌落直徑。
[0036] 計(jì)算菌落直徑均值，并按照下列公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)平均抑制率：
[0037] 菌絲生長(zhǎng)平均抑制率={(對(duì)照菌落直徑均值-處理菌落直徑均值）八對(duì)照菌落 直徑均值-接種菌餅直徑）} X 100 %，采用DPS13. 0專業(yè)版數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出藥劑對(duì)草 莓枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)抑制的回歸方程、EC5tl及其95 %置信限。
[0038] 根據(jù)Wadley法，計(jì)算增效系數(shù)（SR)。根據(jù)增效系數(shù)（SR)評(píng)價(jià)藥劑混用的聯(lián)合作 用類型，即SR〈0. 5為拮抗作用，0· 5彡SR彡L 5為相加作用，SR>1. 5為增效作用。
[0039] SR = EC50 (Eth) /EC50 (Eob)..........................................· · (1)
[0040] EC50 (th) = (a+b)/[(a/EC (A) 50+(b/EC (B)50].........................(2)
[0041] 其中，A、B分別為殺菌劑單劑，a、b為相應(yīng)單劑在混劑中的比例，EC5tl (Eth)為混劑 EC5tl理論值，EC5tl(Eob)為混劑EC5tl實(shí)測(cè)值。
[0042] 1.6室內(nèi)抑菌活性測(cè)定結(jié)果
[0043] 1. 6. 1枯草芽孢桿菌DJ-6及吡唑醚菌酯對(duì)草莓枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的影響
[0044] 從表1中的結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌DJ-6與吡唑醚菌酯的濃度為0.78125? 100 μ g/mL時(shí)，對(duì)草莓枯萎病病菌的抑菌率分別為3. 08?36. 92%、41. 03?77. 44%。
[0045] 表1枯草芽孢桿菌DJ-6與吡唑醚菌酯對(duì)草莓枯萎病菌的抑制效果（72h)
[0047] 注：菌落直徑含菌餅5_。下同。

【權(quán)利要求】
1. 一種生物復(fù)配殺菌組合物，其特征在于，所述生物復(fù)配殺菌組合物含有5?40 %吡 唑醚菌酯和4(Γ2000億CFU/g的枯草芽孢桿菌DJ-6兩種活性組分。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物復(fù)配殺菌組合物，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌 DJ-6與吡唑醚菌酯重量比為1:1~1:5。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物復(fù)配殺菌組合物，其特征在于，所述生物復(fù)配殺菌 組合物為20%吡唑醚菌酯· 200億CFU/g枯草芽孢桿菌DJ-6的可濕性粉劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物復(fù)配殺菌組合物，其特征在于，所述生物復(fù)配殺菌 組合物還包括助劑和填料。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種生物復(fù)配殺菌組合物，其特征在于，所述殺菌組合物的 劑型為可濕性粉劑、水乳劑、懸浮劑或水分散粒劑中的一種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種生物復(fù)配殺菌組合物，其特征在于，所述助劑為表面活 性劑和分散劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種生物復(fù)配殺菌組合物，其特征在于，所述表面活性劑為 十二烷基硫酸鈉，分散劑為NNO。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種生物復(fù)配殺菌組合物，其特征在于，所述填料為白炭黑 或高嶺土中的一種或幾種。
9. 權(quán)利要求1所述的一種生物復(fù)配殺菌組合物在防治草莓枯萎病中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，在連作重茬的草莓田，草莓苗定植時(shí)將 所述的殺菌組合物稀釋1000-3000倍液，每株灌根250ml。
【文檔編號(hào)】A01P3/00GK104286031SQ201410487192
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月22日
【發(fā)明者】吉沐祥, 陳宏洲, 吳祥, 王莉莉, 繆康, 陳原, 朱成剛, 王健 申請(qǐng)人:江蘇省綠盾植保農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)有限公司, 江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所