一種產(chǎn)鐵載體類芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)鐵載體類芽孢桿菌，該菌株為伊利諾伊類芽孢桿菌(Paenibacillus illinoisensis)，于2014年8月29日保藏中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號：CGMCC No.9620。本發(fā)明菌株在限鐵培養(yǎng)基中可以產(chǎn)生鐵載體。在盆栽和大田條件下，用本發(fā)明的產(chǎn)鐵載體菌株的菌懸液在花生播種前浸種處理和生長期灌根處理后，在石灰性土壤中能明顯改善花生生長時(shí)期的鐵營養(yǎng)，并且能增加花生葉綠素含量，增強(qiáng)花生的根系活力，促進(jìn)花生植株體內(nèi)氮、磷、鉀的積累，提高植株生物量，改善花生品質(zhì)，提高花生產(chǎn)量。CGMCC No.96202014.08.29
【專利說明】一種產(chǎn)鐵載體類芽孢桿菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種產(chǎn)鐵載體類芽孢桿菌及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 花生是中國重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，中國北方地區(qū)是花生最大的栽培地區(qū)之 一。近年來，花生缺鐵性黃化病的發(fā)生越來越嚴(yán)重，這對花生的產(chǎn)量和質(zhì)量都造成了很大 損害。目前人們防治花生缺鐵性黃化病主要是依靠農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治的方法，但農(nóng)業(yè)防 治方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且很難從根源上有效防治病害的發(fā)生，化學(xué)防治方法對環(huán)境污染大，并 且對人體健康也有一定的傷害。因此，利用生物學(xué)方法來防治花生缺鐵性黃化病的發(fā)生已 經(jīng)逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，而找到對花生缺鐵性黃化病有很好防治作用的菌種資源是關(guān) 鍵，其中產(chǎn)鐵載體菌株的篩選和應(yīng)用是目前微生物學(xué)工作者的研究熱點(diǎn)之一。
[0003] 鐵載體是微生物和部分植物在低鐵應(yīng)激條件下合成的一類對三價(jià)鐵離子有高效 親和能力的低分子量（l_2kDa)有機(jī)化合物，它可以從各種水溶性和非水溶性的化合物中 奪走Fe3+。近幾年，產(chǎn)鐵載體微生物在植物方面的生防和促生作用越來越受到國內(nèi)外研究 者的關(guān)注。很多研究成果討論了土壤微生物在植物根系吸收鐵中可能的作用機(jī)理，這種機(jī) 理可能包括以下幾種：（1)缺鐵植物根系分泌小分子有機(jī)化合物，如酚類和黃素類等化合 物，這些化合物可以作為抑菌劑和（或）直接作為微生物生長的碳源來改變植物根際微生 物的群落結(jié)構(gòu)，并在植物根際形成特異性的微生物種群，這種特異性微生物種群就會通過 分泌鐵載體來增加土壤中有效鐵的含量，從而提高植株對鐵的吸收。（2) -些與植物根系共 生的微生物也會改善增強(qiáng)植物對鐵的吸收利用，比如根瘤菌（Rhizobium)可以通過結(jié)瘤作 用來增強(qiáng)植物鐵脅迫的生理響應(yīng)；侵染根系的菌根真菌通過增加植物根系的養(yǎng)分吸收面積 和分泌對鐵載體來改善植物的鐵營養(yǎng)。
[0004] 目前，關(guān)于產(chǎn)鐵載體的假單胞菌和真菌在改善植物鐵營養(yǎng)和促生方面的報(bào)道較 多，但關(guān)于類芽孢桿菌對植物鐵營養(yǎng)的改善和促生方面的報(bào)道卻沒有。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)鐵載體類芽孢桿菌及其應(yīng)用，主要在花生鐵營養(yǎng)的改 善和促生方面的應(yīng)用。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] -種產(chǎn)鐵載體類芽孢桿菌，該菌株分類命名為伊利諾伊類芽孢桿菌 (Paenibacillus illinoisensis)YZ29,保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心（CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期：2014年8月29日， 保藏編號：CGMCC No. 9620。
[0008] 該菌株的菌落及菌體特征為：本發(fā)明的產(chǎn)鐵載體類芽孢桿菌在LB平板培養(yǎng)基（酵 母浸膏，5g ;蛋白胨，IOg ;氯化鈉 ，IOg ;蒸餾水，IOOOmL ;瓊脂，15-20g;12rC滅菌20min ; PH7.0。）上培養(yǎng)24h后菌落呈圓形，乳黃色，稍隆起，邊緣整齊，表面光滑。菌體呈長桿狀， 大小為0· 5-0. 7X1. 2-2. O μ m，產(chǎn)芽孢，革蘭氏陽性。
[0009] 該菌株的生理生化特征為：伏-普試驗(yàn)陰性，檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原 試驗(yàn)陰性，D-葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)陰性，甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)陰性，L-阿拉伯糖發(fā)酵試驗(yàn)陽性，淀粉 水解試驗(yàn)陽性，明膠液化試驗(yàn)陽性，接觸酶試驗(yàn)陽性，氧化酶試驗(yàn)陰性。
[0010] 上述產(chǎn)鐵載體類芽孢桿菌在改善花生鐵營養(yǎng)和促生方面的應(yīng)用。
[0011] 所述產(chǎn)鐵載體類芽孢桿菌的應(yīng)用方法，制備菌懸液，將上述菌懸液（濃度為 IO8Cfu ?ml/1，菌液體積為能浸沒所有種子）浸泡花生種子25-35min (優(yōu)選30min)后播種； 或者在花生定苗后和開花前（或后）用菌懸液灌根；或者是將上述菌懸液浸泡花生種子播 種后，在花生定苗后和開花前（或后）用菌懸液灌根。
[0012] 所述菌懸液的濃度為IO8Cfu · mL'
[0013] 灌根時(shí)的用量為：盆栽試驗(yàn)中每株25mL，田間試驗(yàn)每株200mL。
[0014] 菌懸液的制備方法：將斜面保存的CGMCC9620轉(zhuǎn)接到裝有5-10mL(優(yōu)選IOmL) 液體培養(yǎng)基（盆栽試驗(yàn)為LB培養(yǎng)基；田間試驗(yàn)為豆芽汁培養(yǎng)基）的試管中，放在恒溫 搖床中培養(yǎng)12-16h(優(yōu)選12h)，溫度：37°C ;轉(zhuǎn)速：180-200rpm。將活化好的菌液按1% 接種量接入到l〇〇-2〇〇mL(優(yōu)選200mL)培養(yǎng)基中，放入搖床培養(yǎng)24h，溫度：37°C ;轉(zhuǎn)速： 180-200rpm(180rpm)，然后8000rpm離心IOmin,棄去上清液，加入適量的無菌去離子水，制 成菌懸液。
[0015] LB培養(yǎng)基：酵母浸膏，5g ;蛋白胨，IOg ;氯化鈉，IOg ;蒸饋水，IOOOmL ;121°C滅菌 20min ;pH7. 0。
[0016] 豆芽汁培養(yǎng)基：黃豆芽10g，蔗糖30g，硫酸銨8g，蒸餾水，IOOOmL ; 121 °C滅菌 20min ;pH7.0。
[0017] -種生物防治菌劑，包括上述的伊利諾伊類芽孢桿菌（Paenibacillus illinoisensis)〇
[0018] 上述生物菌劑在改善花生鐵營養(yǎng)和促生方面的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明所產(chǎn)生的有益效果：
[0020] 經(jīng)研究表明，在盆栽和大田條件下，用本發(fā)明的產(chǎn)鐵載體菌株的菌懸液在花生播 種前浸種處理和生長期灌根處理后，在石灰性土壤中能明顯改善花生生長時(shí)期的鐵營養(yǎng)， 并且能增加花生葉綠素含量，增強(qiáng)花生的根系活力，促進(jìn)花生植株體內(nèi)氮、磷、鉀的積累，提 商植株生物量，改善花生品質(zhì)，提商花生廣量。
[0021] 本發(fā)明的產(chǎn)鐵載體類芽孢桿菌能明顯改善花生生長時(shí)期的鐵營養(yǎng)狀況，促進(jìn)花生 生長。
[0022] 本研究篩選的CGMCC9620菌株在盆栽條件和大田條件下對花生鐵營養(yǎng)和促生效 果的研究，所采用的試驗(yàn)方法和條件與已有的文獻(xiàn)報(bào)道相比，更貼近實(shí)際應(yīng)用狀態(tài)（很 多報(bào)道研究的假單胞菌和真菌是在水培條件下驗(yàn)證對花生的影響的，而不是在石灰性土 壤中），這也有力地說明了對花生鐵營養(yǎng)的吸收和促生方面的效果是很明顯的。另外， 目前未見關(guān)于類芽孢桿菌對植物鐵營養(yǎng)的改善和促生方面的報(bào)道，這說明本研究篩出的 CGMCC9620菌株豐富了防治花生缺鐵性黃化病的菌種資源。類芽孢桿菌是一種能夠形成芽 孢的細(xì)菌它比假單胞菌更容易在土壤中生存，比真菌生長速度快更容易發(fā)揮作用。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0024] 實(shí)施例1
[0025] -種產(chǎn)鐵載體類芽孢桿菌，該菌株分類命名為伊利諾伊類芽孢桿菌 (Paenibacillus illinoisensis)，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心（CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期：2014年8月29日，保藏 編號：CGMCC No. 9620。
[0026] CGMCC9620 篩選過程：
[0027] (1)分離和純化
[0028] 該菌種從花生根際土壤中分離篩選得到。
[0029] 土壤樣品采自山東省兗州市寨子洼（35° 44'N，116° 75'E)花生種植地。將花生 根際土壤小心抖落到無菌袋里，放于低溫保鮮盒，帶回實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行處理。稱取根際土 壤樣品l〇g，放入90mL無菌水中，振蕩30min后制成土壤懸浮液。分別吸取ImL懸浮液，按 照10倍比例梯度稀釋后，各取1(Γ 4、1(Γ5和KT6倍稀釋液200yL涂布于牛肉膏蛋白胨平板 (牛肉膏，5g ;蛋白胨，IOg ;氯化鈉 ，IOg ;蒸餾水，IOOOmL ;瓊脂，15-20g ;121°C滅菌20min ; pH7. 2-7. 4)上，靜置IOmin后倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24h。挑選代表性菌落于平 板上再通過三區(qū)劃線法純化，純化后的微生物分離物為：CGMCC9620,分離物保存于斜面中 備用。
[0030] (2) CGMCC9620產(chǎn)鐵載體性能的檢測
[0031] 將菌株用牙簽點(diǎn)接在CAS平板，在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-5d，觀察菌落周圍產(chǎn) 生橙黃色變色圈者為能夠產(chǎn)生鐵載體的菌株，若沒有形成變色圈說明菌株不能產(chǎn)生鐵載 體。
[0032] 所述CAS平板制備：
[0033] @取0.0128〇45(〇11'〇11163211〇1'18，北京瀛海精細(xì)化工廠）溶于1〇1]11^雙蒸水中，并 與2mLlmmol/L的FeCl 3溶液混勻，得溶液a ;
[0034] ②取 0· 015gHDTMA(Hexadeeyltrimethylammoniumbormide，北京索萊寶科技有限 公司）溶于8mL雙蒸水中，得溶液b ;
[0035] ③將a溶液緩慢加入b溶液中，充分混勻即得染液c ;
[0036] ④將 IOXMM9 鹽溶液（Na2HP0430g，KH2PO4L 5g，NaCl 2. 5g，NH4Cl 5g，雙蒸水 500mL)20mL，哌嗪二乙醇磺酸（pipes, Sigma公司出品）6. 04g加入盛有150mL雙蒸水的潔 凈三角瓶里，混勻后用質(zhì)量濃度為50% NaOH調(diào)節(jié)pH至6. 8,再加入瓊脂粉3. 2g，得培養(yǎng)基 d ；
[0037] ⑤將染液 c、培養(yǎng)基 d、及 lmmol/L CaCl2、lmmol/L MgSO4 · 7H20、質(zhì)量濃度為 20% 葡萄糖、質(zhì)量濃度為10%水解酪素分別滅菌（115°c，20min)后，置于50°C水浴鍋內(nèi)保溫待 用；
[0038] ?分別量取上述1臟〇1/1〇3(：120.211^、1臟〇1/1]\%50 4*7!120 411^、質(zhì)量濃度為20% 葡萄糖2mL及質(zhì)量濃度為10 %水解酪素6mL加入培養(yǎng)基d中，再沿瓶壁加入染液c，充分搖 勻（勿產(chǎn)生氣泡），即得藍(lán)色定性檢測培養(yǎng)基。
[0039] 然后按每皿20mL倒入培養(yǎng)皿中，待凝固后備用。
[0040] CGMCC9620擴(kuò)大培養(yǎng)方法：
[0041] 將斜面保存的CGMCC9620轉(zhuǎn)接到裝有IOmL液體LB培養(yǎng)基（酵母浸膏，5g ;蛋白胨， IOg ;氯化鈉 ，IOg ;蒸饋水，IOOOmL ;121°C滅菌20min ;pH7. 0。）的試管中，放在恒溫?fù)u床中 培養(yǎng)12h (溫度：37°C;轉(zhuǎn)速：180rpm)。將活化好的菌液按1%接種量接入到IOOOmL的盛有 200mL液體LB培養(yǎng)基或豆芽汁培養(yǎng)基（黃豆芽10g，蔗糖30g，硫酸銨8g，蒸餾水，IOOOmL ; 121°C滅菌20min;pH7.0。）的三角瓶中，放入搖床培養(yǎng)24h(溫度：37°C;轉(zhuǎn)速：180rpm)。
[0042] CGMCC9620 的鑒定
[0043] (1)菌落特征及菌體形態(tài)
[0044] 該菌株的菌落及菌體特征為：在LB平板培養(yǎng)基上（酵母浸膏，5g;蛋白胨，IOg;氯 化鈉 ，IOg ;蒸餾水，IOOOmL ;瓊脂，15-20g ;121°C滅菌20min ;ρΗ7· 0。）培養(yǎng)24h后菌落呈圓 形，乳黃色，稍隆起，邊緣整齊，表面光滑。菌體呈長桿狀，大小為（〇. 5-0. 7) μ mX (1. 2-2. 0) μ m，產(chǎn)芽孢，革蘭氏陽性。
[0045] (2)生理生化特征
[0046] 伏-普試驗(yàn)陰性，檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性，D-葡萄糖發(fā)酵試 驗(yàn)陰性，甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)陰性，L-阿拉伯糖發(fā)酵試驗(yàn)陽性，淀粉水解試驗(yàn)陽性，明膠液化試 驗(yàn)陽性，接觸酶試驗(yàn)陽性，氧化酶試驗(yàn)陰性。
[0047] (3)16S rDNA 序列分析
[0048] 16S rDNA基因序列，見序列表所示。將所測16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的 序列比對，結(jié)果表明：本發(fā)明的菌株與Paenibacillus illinoisensis(AB073192)同處于 一個最小分支上，其 16S rDNA 基因序列與 Paenibacillus illinoisensis (JQ579623)的菌 株序列相似度為99%，結(jié)合上述生理生化特征結(jié)果，鑒定本發(fā)明的菌株為伊利諾伊類芽孢 桿菌（Paenibacillus illinoisensis) 〇
[0049] 為了明確CGMCC9620在花生鐵營養(yǎng)的改善和促生方面的應(yīng)用，進(jìn)行了如下試驗(yàn)：
[0050] 盆栽試驗(yàn)和田間試驗(yàn)
[0051] 將斜面保存的CGMCC9620轉(zhuǎn)接到裝有IOmL液體培養(yǎng)基（盆栽試驗(yàn)為LB培養(yǎng)基，田 間試驗(yàn)為豆芽汁培養(yǎng)基）的試管中，放在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12h (溫度：37°C ;轉(zhuǎn)速：ISOrpm)。 將活化好的菌液按1%接種量接入到200mL培養(yǎng)基中，放入搖床培養(yǎng)24h(溫度：37°C ;轉(zhuǎn) 速：180rpm)，然后8000rpm離心IOmin,棄去上清液，加入適量的無菌去離子水，制成濃度為 IO8Cfu · ι?Γ1的菌懸液。
[0052] 上述LB培養(yǎng)基：酵母浸膏，5g ;蛋白胨，IOg ;氯化鈉，IOg ;蒸餾水，IOOOmL ;121°C 滅菌 20min ;ρΗ7· 0。
[0053] 豆芽汁培養(yǎng)基：黃豆芽10g，蔗糖30g，硫酸銨8g，蒸餾水，IOOOmL ; 121 °C滅菌 20min ;pH7. 0。
[0054] 在播種前，將花生種子在IO8Cfu 的菌懸液中浸泡30min，取出種子，將表面的 水陰干，播種。在花生定苗后和開花前再次用IO8Cfu · ml/1的菌懸液采用灌根法各施菌一 次，盆栽試驗(yàn)中每株25mL，田間試驗(yàn)每株200mL。對照組用等量無菌去離子水處理。在花生 各生育期（即幼苗期、開花下針期、莢果期和飽果期）測定花生葉片活性鐵含量和葉綠素含 量、根系活力、植株全氮磷鉀，收獲時(shí)統(tǒng)計(jì)相關(guān)產(chǎn)量因子。結(jié)果如下表所示。
[0055] 表1在盆栽試驗(yàn)中各生育期不同處理組花生葉子的葉綠素含量和活性鐵含量的 差異
[0056]

【權(quán)利要求】
1. 一種產(chǎn)鐵載體類芽孢桿菌，其特征在于，該菌株分類命名為伊利諾伊類芽孢桿菌 (Paenibacillus illinoisensis)，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心（CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期：2014年8月29日，保藏 編號：CGMCC No. 9620。
2. 如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)鐵載體類芽孢桿菌，其特征在于，該菌株的菌落及菌體特征 為：在LB平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后菌落呈圓形，乳黃色，稍隆起，邊緣整齊，表面光滑；菌體 呈長桿狀，大小為0. 5-0. 7X1. 2-2. 0 μ m，產(chǎn)芽孢，革蘭氏陽性；所述LB平板培養(yǎng)基：酵母浸 膏，5g，蛋白胨，10g，氯化鈉，10g，蒸餾水，1000mL，瓊脂，15-20g，121°C滅菌 20min，ρΗ7· 0。
3. 權(quán)利要求1所述的產(chǎn)鐵載體類芽孢桿菌在改善花生鐵營養(yǎng)和促生方面的應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求1所述的產(chǎn)鐵載體類芽孢桿菌在改善花生鐵營養(yǎng)和促生方面的應(yīng)用方法， 其特征在于，制備濃度為108cfu · ml/1菌懸液，將上述菌懸液浸泡花生種子25-35min后播 種，所述菌液體積為浸沒所有種子為準(zhǔn)；或者在花生定苗后、開花前或開花后用菌懸液灌 根；或者是將所述菌懸液浸泡花生種子播種后，在花生定苗后、開花前或開花后用菌懸液灌 根。
5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用方法，其特征在于，灌根時(shí)的用量為：盆栽每株25mL，田間 每株200mL。
6. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用方法，其特征在于，將上述菌懸液浸泡花生種子30min。
7. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述菌懸液的制備方法：將斜面保存的 CGMCC9620轉(zhuǎn)接到裝有5-10mL液體培養(yǎng)基的試管中，放在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12-16h，溫度： 37°C，轉(zhuǎn)速：180-200rpm ;將活化好的菌液按1%接種量接入到100-200mL培養(yǎng)基中，放入搖 床培養(yǎng)24h，溫度：37°C，轉(zhuǎn)速：180-200rpm，然后8000rpm離心10min，棄去上清液，加入適 量的無菌去離子水，制成菌懸液； 所述液體培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基：酵母浸膏，5g，蛋白胨，10g，氯化鈉，10g，蒸饋水， 1000mL，121°C滅菌20min，pH7.0 ;或豆芽汁培養(yǎng)基：黃豆芽10g，蔗糖30g，硫酸銨8g，蒸餾 水，1000mL，121°C滅菌 20min，ρΗ7· 0。
8. -種生物防治菌劑，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的伊利諾伊類芽孢桿菌 (Paenibacillus illinoisensis)〇
9. 權(quán)利要求8所述的生物防治菌劑在改善花生鐵營養(yǎng)和促生方面的應(yīng)用。
【文檔編號】A01P21/00GK104263684SQ201410499488
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月25日
【發(fā)明者】丁延芹, 杜秉海, 姚良同, 劉娣, 劉凱, 王文銅 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)