：本發(fā)明屬于海洋農(nóng)業(yè)中貝類遺傳繁育技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用卵生型手段繁育幼生型牡蠣的方法。

背景技術(shù)：
：牡蠣屬于軟體動物門，雙殼綱，珍珠貝目，牡蠣科，是一種重要的海洋生物資源，其肉味鮮美、富含多種人體必需氨基酸。為世界最重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟種類之一，其養(yǎng)殖的總產(chǎn)量和單位面積產(chǎn)量在所有的貝類養(yǎng)殖品種中位居首位(張躍環(huán)，2012)。我國是牡蠣養(yǎng)殖大國，2010-2012年產(chǎn)量在350-380萬噸之間；它占養(yǎng)殖貝類產(chǎn)量的35％，海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的25％，世界產(chǎn)量的70％以上(中國漁業(yè)年鑒2013)。在我國，牡蠣科至少包括5個屬，分別為巨蠣屬(Crassostrea)、牡蠣屬(Ostrea)、小蠣屬(Saccostrea)、齒蠣屬(Dendostrea)、舌骨牡蠣屬(Parahyotissa)等(夏建軍，2008)。其中，有趣的是，牡蠣屬種類繁殖方式均為幼生型，而其它屬種類均為卵生型。卵生型(Oviparoustype)是指動物的受精卵在母體外獨立發(fā)育，胚胎發(fā)育過程完全依靠卵細胞自身卵黃營養(yǎng)，可分為直接產(chǎn)卵排精及交配后產(chǎn)卵兩種形式，絕大多數(shù)的貝類均屬于這種繁殖方式。幼生型(Larvaetype)牡蠣在繁殖時，精卵在鰓腔中受精，發(fā)育至面盤幼蟲離開母體，經(jīng)過浮游階段，附著變態(tài)。它包括牡蠣屬中的密鱗牡蠣(O.denselamellosa)、歐洲牡蠣(O.edulis)、希臘牡蠣(O.lurida)等(王如才等，2008)。那么，能否改變幼生型牡蠣繁殖方式，利用卵生型手段進行幼生型牡蠣的人工繁育，成為本發(fā)明的創(chuàng)新點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
：本發(fā)明的目的是提供一種采用卵生型手段繁育幼生型牡蠣的方法，其可以改變幼生型牡蠣繁殖方式，提高其種群資源數(shù)量，大規(guī)模生產(chǎn)其苗種。本發(fā)明的采用卵生型手段繁育幼生型牡蠣的方法，其特征在于，包括以下步驟：a、親本采集：在自然海區(qū)采集野生的牡蠣屬幼生型牡蠣作為繁殖群體，該類牡蠣長相比較獨特，右殼殼頂部較光滑鱗片愈合，其它鱗片密薄而脆，緊密地以覆瓦狀排列，為了確保該親本準確性，最好進一步采用分子手段進行物種鑒定；b、性腺促熟：以自然條件下性腺發(fā)育較好的步驟a的繁殖群體或者促熟的步驟a的繁殖群體作為親本，自然條件下性腺發(fā)育較好的牡蠣群體可以減少促熟時間，促熟方式可以采用室內(nèi)促熟，也可以采用室外生態(tài)促熟。無論是哪一種促熟方式，均要保證餌料充足、水質(zhì)清新、環(huán)境條件適宜。c、精卵分離：待親本性腺成熟，分離精卵，之后進行受精，獲得受精卵；性腺成熟的標志：少數(shù)親本個體鰓腔中有受精卵或者正在發(fā)育的胚胎。由于大部分幼生型牡蠣屬于雌雄同體，所以在獲得單體精卵時要格外小心。卵子收集方法：將成熟性腺解剖在鹽度3-5ppt水中，浸泡2-5min，將其精子殺死；之后經(jīng)過200目篩絹網(wǎng)過濾，去除大的組織塊，400目篩絹網(wǎng)濃縮，去除小的碎組織塊及死亡精子；最后，濾液放置于鹽度為27-30ppt海水中進行30-60min浸泡激活卵子，激活成功的標準是卵變圓，生發(fā)泡消失。精子收集方法，在卵子激活成功后，通過鏡檢選擇精子活力好的個體性腺，經(jīng)過400目篩絹網(wǎng)過濾，去除卵子及大的組織塊，濾液即為精子，該方法可以有效的收集純度較高的精子；之后在海水激活5-15min，選取精子活性比例高的個體作為父本。受精前，檢查卵子是否被精子污染，棄掉被污染個體卵液，使用尚未受精且激活好的卵子。最后，將精子倒入卵液中受精，每個卵子周圍有3-5個精子比較合適；d、子代培育：采用充氣方式孵化受精卵，孵化密度控制在≤50個/mL，受精卵在溫度28.2-29.4℃，鹽度27-30ppt條件下，經(jīng)過36h左右到達D形幼蟲。對D形幼蟲采用260目篩絹網(wǎng)選優(yōu)(D形幼蟲不能濾過260目篩絹網(wǎng))，之后按照常規(guī)方法培養(yǎng)子代，即可獲得大量該類牡蠣苗種。步驟a所述的幼生型牡蠣指的是牡蠣屬中的密鱗牡蠣、希臘牡蠣、歐洲牡蠣等，它們繁殖時精卵在鰓腔中受精，待受精卵發(fā)育至D形幼蟲階段排出體外，經(jīng)過浮游階段之后附著變態(tài)。目前，有關(guān)于牡蠣屬牡蠣繁育的研究，僅限于李琪等(2009)公開了對比文件1，即密鱗牡蠣的人工繁育方法(授權(quán)公告號：CN101731168B)；陳璐等(2011)發(fā)表了密鱗牡蠣的人工繁育(對比文件2)。對比文件1為國家發(fā)明專利，而對比文件2期刊論文，兩者內(nèi)容幾乎完全一致。2個對比文件與本發(fā)明不同，他們均是利用密鱗牡蠣幼生型特性，待其自然排放幼體之后，進行子代培育；而本發(fā)明則是在幼生型牡蠣性腺成熟時，采用卵生型剖取精卵方式對其進行繁育，成功獲得大量存活子代。本發(fā)明與2個對比文件相比，改變了傳統(tǒng)上認為幼生型牡蠣只能待親本排放D形幼蟲后，進行子代培育的繁殖規(guī)律。本發(fā)明具有操作性強，易于推廣，可用于大規(guī)模生產(chǎn)幼生型牡蠣苗種，進行資源恢復(fù)維持其生物多樣性；同時為開展幼生型牡蠣的常規(guī)育種及多倍體育種等提供了實踐基礎(chǔ)。本發(fā)明打破了傳統(tǒng)上認為幼生型牡蠣無法通過解剖方式進行子代繁育的觀念，首次通過卵生型牡蠣繁育模式培養(yǎng)出幼生型牡蠣苗種，為其大規(guī)模繁殖提供了技術(shù)保證，為該類牡蠣的常規(guī)數(shù)量遺傳育種及染色體操縱育種等提供了可能，也為該類牡蠣資源恢復(fù)奠定了理論與實踐基礎(chǔ)。具體實施方式：以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。實施例1a、親本采集：于2013年6月中旬，在湛江硇洲島采集野生密鱗牡蠣作為繁殖群體，雖然密鱗牡蠣長相比較特別，在右殼上有很多鱗片狀結(jié)構(gòu)。但是，有個別巨蠣屬中的葡萄牙牡蠣、熊本牡蠣在其自然環(huán)境下，也會長出一些鱗片狀結(jié)構(gòu)。為此，采用分子手段對牡蠣的COI序列進行擴增測序，通過Blast與序列號為YP004300304的密鱗牡蠣進行比對鑒定，剔除了混淆個體，獲得殼高在12-18cm密鱗牡蠣125只。b、性腺促熟：采集到的密鱗牡蠣性腺比較飽滿，將其移至恒興南方海洋生物科技有限公司1個12m3水泥池內(nèi)，采用微充氣方式進行促熟。每天投喂角毛藻、海鏈藻、酵母粉，投喂量因設(shè)施情況而定，保證餌料充足；每天換水15-30％。促熟期間，水溫27.0-28.2℃，鹽度27-30ppt。c、精卵分離：經(jīng)過15天促熟，發(fā)現(xiàn)個別親本的鰓腔中有受精卵，說明性腺已經(jīng)成熟。由于該親本大多數(shù)是雌雄同體，為此，解剖性腺進行精卵分離。卵子收集方法：將成熟性腺解剖在鹽度3ppt水中，浸泡5min，將其精子殺死；之后經(jīng)過200目篩絹網(wǎng)過濾，去除大的組織塊，400目篩絹網(wǎng)濃縮，濾掉碎組織塊及死亡精子；最后，濾液(含卵子)放置于鹽度為30ppt海水中進行45min浸泡激活卵子，激活成功的標準是卵變圓，生發(fā)泡消失，此時的卵徑為80-90μm。精子收集方法，在卵子激活成功后，通過鏡檢以精子活力好的個體性腺作為父本，再解剖性腺即可，經(jīng)過400目篩絹網(wǎng)過濾，濾液即為精子；之后利用海水激活6min，選取精子活性比例高的個體作為父本。受精前，檢查卵子是否被精子污染，棄掉被污染個體卵液，使用尚未受精且激活好的卵子。經(jīng)過顯微鏡觀察，選取30個未受精較好的卵液作為母本卵源，之后將其混合在一起，放置于60L白桶中；選取5個精子活性好的個體作為父本精源，每個精源放置于100mL燒杯中。將卵源分成5份，每份12L，利用每個精子分別與每份卵源交配，以平衡精子受精能力，維持物種結(jié)構(gòu)多樣性，防止近交衰退。精子使用標準，每個卵子周圍有3-5個較適宜，獲得受精卵。受精60min后，利用300目篩絹網(wǎng)洗卵，之后將其倒入12m3水泥池中孵化。d、子代培育：采用微充氣方式孵化受精卵，孵化密度為12個/mL，受精卵在溫度28.6-29.4℃，鹽度28ppt條件下，經(jīng)過36h左右到達D形幼蟲，D形幼蟲殼高在110-120μm。對D形幼蟲采用260目篩絹網(wǎng)選優(yōu)，收集篩絹網(wǎng)中的D形幼蟲，之后按照常規(guī)密鱗牡蠣培育方法培養(yǎng)子代，約經(jīng)過20d浮游期，7d變態(tài)期，24d的稚貝培育，利用1個12m3水泥池培育出240萬個殼高在4-9mm的密鱗牡蠣稚貝，單位水體出苗量為20萬/m3。