枯草芽孢桿菌h8-3及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)H8-3及在制備腐熟菌劑中的應(yīng)用，枯草芽孢桿菌H8-3保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2013年10月21日，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2013483，地址為湖北武漢武漢大學(xué)；本發(fā)明枯草芽孢桿菌H8-3耐高溫，在30℃-60℃均能存活，蛋白酶活性較高，且生長(zhǎng)較迅速；利用該菌株制備的腐熟菌劑具有耐高溫，分泌蛋白酶、脂肪酶以高效發(fā)酵動(dòng)物類廢棄物的優(yōu)點(diǎn)，利用所述腐熟菌劑堆肥具有環(huán)境污染小、經(jīng)濟(jì)易行等優(yōu)點(diǎn)，堆肥處理后的產(chǎn)品經(jīng)過(guò)后續(xù)處理，可以作為有機(jī)肥料達(dá)到變廢為寶的目的。
CCTCC NO：M 2013483
2013.10.21

CCTCC NO：M 2013482
2013.10.21

CCTCC NO：M 2013481
2013.10.21
【專利說(shuō)明】枯草芽孢桿菌H8-3及其應(yīng)用 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌及應(yīng)用，特別涉及一株枯草芽孢桿菌H8-3及其在 制備腐熟囷劑中的應(yīng)用。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 有機(jī)廢棄物常被當(dāng)作垃圾送進(jìn)垃圾場(chǎng)、焚化爐或者隨意丟棄。開(kāi)發(fā)利用有機(jī)廢棄 物的方法是非常必要的，不光能保護(hù)環(huán)境，而且能變廢為寶。當(dāng)前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了不少利用有機(jī) 廢棄物的方法，但是大部分都是對(duì)纖維素、淀粉含量高的廢棄物的利用，而對(duì)含蛋白質(zhì)與脂 肪較高的廢棄物的利用方法則較少。
[0003] 富含蛋白質(zhì)與脂肪的廢棄物（如動(dòng)物類廢棄物），如果直接丟棄，將產(chǎn)生大量的污 水、臭氣，污染環(huán)境，并有可能導(dǎo)致病菌傳播擴(kuò)散，存在極大的安全隱患。目前世界范圍內(nèi)處 理動(dòng)物類廢棄物的方法主要包括深埋法、焚化法、和煉油法。但這些方法都各自存在這一些 諸如成本高、效率低或安全性差等不足之處。正是基于這一出發(fā)點(diǎn)，應(yīng)用堆肥法處理動(dòng)物 類廢棄物逐漸走入了人們的視線。堆肥法可以定義為利用自然界廣泛存在的微生物（細(xì) 菌、放線菌、真菌等）或商業(yè)菌株，有控制的促進(jìn)可被生物降解的有機(jī)物向穩(wěn)定的腐殖質(zhì)轉(zhuǎn) 化的生物化學(xué)過(guò)程。由于堆肥過(guò)程受微生物種類、環(huán)境溫度等因素的影響較大，所以在沒(méi) 有人為添加菌劑的情況下堆肥發(fā)酵效率較低。所以亟待開(kāi)發(fā)一種發(fā)酵效率高的菌劑以安全 環(huán)保又經(jīng)濟(jì)的處理動(dòng)物類廢棄物。
[0004] 本發(fā)明提供的菌劑具有耐高溫，分泌蛋白酶、脂肪酶以高效發(fā)酵動(dòng)物類廢棄物的 優(yōu)點(diǎn)。利用該菌劑堆肥具有環(huán)境污染小、經(jīng)濟(jì)易行等優(yōu)點(diǎn)，堆肥處理后的產(chǎn)品經(jīng)過(guò)后續(xù)處 理，可以作為有機(jī)肥料達(dá)到變廢為寶的目的。 (三）


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種新菌株-枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)H8_3及在制 備腐熟菌劑中的應(yīng)用，利用H8-3菌株制備的腐熟菌劑在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)和發(fā)酵條件下，能高效 分解蛋白質(zhì)、脂肪，在處理動(dòng)物類廢棄物方面有良好的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明提供一株新菌株一枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)H8_3,保藏于中國(guó) 典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2013年10月21日，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M 2013483， 地址為湖北武漢武漢大學(xué)。
[0008] 枯草芽孢桿菌H8-3生理生化特征如下：在LB培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，無(wú)光澤，邊 緣不整齊，表面有皺褶。好氧呼吸，在有氧條件下生長(zhǎng)良好；革蘭氏染色陽(yáng)性；在葡萄糖、蔗 糖、木糖、甘露糖、麥芽糖發(fā)酵試驗(yàn)中可產(chǎn)酸；能水解明膠、淀粉和酪蛋白；還原石蕊牛奶； V-P測(cè)定陽(yáng)性；甲基紅測(cè)定陰性。產(chǎn)蛋白酶，能耐60°C的高溫。
[0009] 本發(fā)明還提供所述枯草芽孢桿菌H8-3在制備腐熟菌劑中的應(yīng)用，所述腐熟菌劑 由短短芽孢桿菌H3凍干粉、枯草芽孢桿菌H4凍干粉、枯草芽孢桿菌H8-3凍干粉和淀粉構(gòu) 成，所述短短芽孢桿菌H3凍干粉與枯草芽孢桿菌H4凍干粉、枯草芽孢桿菌H8-3凍干粉和 淀粉質(zhì)量比為1:1:1:97 ;
[0010] 所述短短芽孢桿菌H3凍干粉是由短短芽孢桿菌H3經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液離 心，取沉淀冷凍干燥（優(yōu)選-50°C?-KTC冷凍干燥12?24h，更優(yōu)選-50°C冷凍干燥24h) 獲得的，所述短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis)H3,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏日期為2013年10月21日，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M 2013481，地址為湖北武漢武漢大 學(xué)；
[0011] 所述枯草芽孢桿菌H8-3凍干粉是由枯草芽孢桿菌H8-3經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵 液離心，取沉淀冷凍干燥（優(yōu)選-50°C?-KTC冷凍干燥12?24h，更優(yōu)選-50°C冷凍干燥 24h)獲得的。
[0012] 所述枯草芽孢桿菌H4凍干粉是由枯草芽孢桿菌H4經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液離 心，取沉淀冷凍干燥（優(yōu)選-50°C?-KTC冷凍干燥12?24h，更優(yōu)選-50°C冷凍干燥24h) 獲得的，所述枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)H4,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保 藏日期為2013年10月21日，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M 2013482,地址為：湖北武漢武漢大 學(xué)。
[0013] 本發(fā)明還提供一種所述腐熟菌劑在降解含蛋白質(zhì)和/或脂肪的廢棄物中的應(yīng)用， 具體所述的應(yīng)用為：將腐熟菌劑加入到含蛋白質(zhì)和/或脂肪的廢棄物中，在30°c?60°C下 降解反應(yīng)1?4天（即將腐熟菌劑與廢棄物混合均勻后放置1?4天即可進(jìn)行降解），降解 產(chǎn)物處理后作為植物有機(jī)肥再利用，所述處理優(yōu)選常溫堆肥1?4周即可。
[0014] 進(jìn)一步，優(yōu)選所述腐熟菌劑與廢棄物重量比為0. 1?5 :100。
[0015] 進(jìn)一步，優(yōu)選所述降解的溫度為50°C?60°C。
[0016] 所述枯草芽孢桿菌H4生理生化特征如下：在LB培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，無(wú)光澤， 邊緣不整齊，表面有皺褶。好氧呼吸，在有氧條件下生長(zhǎng)良好；革蘭氏染色陽(yáng)性；在葡萄糖、 蔗糖、木糖、甘露糖、麥芽糖發(fā)酵試驗(yàn)中可產(chǎn)酸；能水解明膠、淀粉和酪蛋白；還原石蕊牛 奶；V-P測(cè)定陽(yáng)性；甲基紅測(cè)定陰性。產(chǎn)蛋白酶，能耐70°C的高溫。
[0017] 短短芽孢桿菌H3生理生化特征如下：在LB培養(yǎng)基上菌落呈白色，無(wú)光澤，邊緣不 整齊，表面有皺褶。好氧呼吸，在有氧條件下生長(zhǎng)良好；產(chǎn)脂肪酶，能耐60°C的高溫。
[0018]本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌H8-3具有耐高溫（在30°C -80°c均能存活）、蛋白酶活 性較高，且生長(zhǎng)較迅速的優(yōu)點(diǎn)。
[0019] 本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌H4凍干粉的制備方法為：
[0020] (1)斜面培養(yǎng)
[0021] 將枯草芽孢桿菌H4接種至斜面培養(yǎng)基，30°C?50°C培養(yǎng)1天，獲得斜面菌體；所 述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，瓊脂粉15g/L，溶劑 為去離子水，pH值為7. 0 ;
[0022] (2)種子培養(yǎng)
[0023] 從斜面菌體挑取一接種環(huán)菌體接種至種子培養(yǎng)基，在30°C?70°C培養(yǎng)1天，獲得 種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶劑為去 離子水，pH值為7. 0 ;
[0024] (3)發(fā)酵培養(yǎng)
[0025] 將種子液以體積濃度0. 1%?1%(優(yōu)選0. 1%)的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基， 30°C?70°C、100?300rpm發(fā)酵培養(yǎng)1?2天，獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液離心，收集沉淀 在-50°C?-KTC冷凍干燥12?24h (優(yōu)選-50°C冷凍干燥24h)，獲得所述枯草芽孢桿菌H4 凍干粉；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：葡萄糖30g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏10 g/L，氯化 鈉2 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，溶劑為去離子水，pH值為 7. 2。
[0026] 本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌H8-3凍干粉的制備方法為：
[0027] (1)斜面培養(yǎng)
[0028] 將枯草芽孢桿菌H8-3接種至斜面培養(yǎng)基，30°C?50°C培養(yǎng)1天，獲得斜面菌體； 所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，瓊脂粉15g/L，溶 劑為去離子水，pH值為7.0;
[0029] (2)種子培養(yǎng)
[0030] 從斜面菌體挑取一接種環(huán)菌體接種至種子培養(yǎng)基，在30°C?60°C培養(yǎng)1天，獲得 種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶劑為去 離子水，pH值為7. 0;
[0031] (3)發(fā)酵培養(yǎng)
[0032] 將種子液以體積濃度0. 1%?1%(優(yōu)選0. 1%)的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基， 30°C?60°C、100?300rpm發(fā)酵培養(yǎng)1?2天，獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液離心，收集沉淀 在-50°C?-KTC冷凍干燥12?24h(優(yōu)選-50°C冷凍干燥24h)，獲得所述枯草芽孢桿菌 H8-3凍干粉；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L， 氯化鈉2g/L，硫酸鎂0. 5g/L，磷酸氫二鉀lg/L，磷酸二氫鉀lg/L，溶劑為去離子水，pH值為 7. 2。
[0033] 本發(fā)明所述短短芽孢桿菌H3凍干粉的制備方法為：
[0034] (1)斜面培養(yǎng)
[0035] 將短短芽孢桿菌H3接種至斜面培養(yǎng)基，30?50°C培養(yǎng)1天，獲得斜面菌體；所述 斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaC110g/L，瓊脂粉15g/L，溶劑為去 離子水，pH值為7. 0;
[0036] (2)種子培養(yǎng)
[0037] 從斜面菌體挑取一接種環(huán)菌體接種至種子培養(yǎng)基，在30?60°C培養(yǎng)1天，獲得種 子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶劑為去離 子水，pH值為7.0;
[0038] (3)發(fā)酵培養(yǎng)
[0039] 將種子液以體積濃度0? 1%?1% (優(yōu)選0? 1% )的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng) 基，30?60°C、100?300rpm發(fā)酵培養(yǎng)1?2天，獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液離心，收集沉淀 在-50°C?-KTC冷凍干燥12?24h (優(yōu)選-50°C冷凍干燥24h)，獲得所述短短芽孢桿菌H3 凍干粉；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，氯化鈉 2g/L，硫酸鎂0. 5g/L，磷酸氫二鉀lg/L，磷酸二氫鉀lg/L，溶劑為去離子水，pH值為7. 2。
[0040] 本發(fā)明所述含蛋白質(zhì)和/或脂肪的廢棄物是指自然死亡的家畜家禽，如雞、鴨、豬 等，以及它們屠宰后的廢棄物。
[0041] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供一株新菌株--枯草 芽孢桿菌H8-3,菌株H8-3耐高溫，在30°C -60°c均能存活，蛋白酶活性較高，且生長(zhǎng)較迅速； 利用該菌株制備的腐熟菌劑具有耐高溫，分泌蛋白酶、脂肪酶以高效發(fā)酵動(dòng)物類廢棄物的 優(yōu)點(diǎn)，利用所述腐熟菌劑堆肥具有環(huán)境污染小、經(jīng)濟(jì)易行等優(yōu)點(diǎn)，堆肥處理后的產(chǎn)品經(jīng)過(guò)后 續(xù)處理，可以作為有機(jī)肥料達(dá)到變廢為寶的目的。 (四）

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042] 圖1枯草芽孢桿菌H4耐高溫實(shí)驗(yàn)圖。
[0043] 圖2枯草芽孢桿菌H4蛋白水解圈實(shí)驗(yàn)圖。
[0044] 圖3枯草芽孢桿菌H4蛋白酶活性實(shí)驗(yàn)圖。
[0045] 圖4枯草芽孢桿菌H8-3耐高溫實(shí)驗(yàn)圖。
[0046] 圖5枯草芽孢桿菌H8-3蛋白酶水解圈實(shí)驗(yàn)圖。
[0047] 圖6枯草芽孢桿菌H8-3蛋白酶活性實(shí)驗(yàn)圖。
[0048] 圖7短短芽孢桿菌H3耐高溫實(shí)驗(yàn)圖。
[0049] 圖8短短芽孢桿菌H3脂肪酶水解圈實(shí)驗(yàn)圖。
[0050] 圖9短短芽孢桿菌H3脂肪酶活性實(shí)驗(yàn)圖。
[0051] 圖10豬肉經(jīng)腐熟菌劑處理前后對(duì)比圖。
[0052] 圖11腐熟菌劑消化豬肉實(shí)驗(yàn)中游離蛋白質(zhì)含量變化圖。
[0053] 圖12腐熟菌劑消化豬肉實(shí)驗(yàn)中粗脂肪含量變化圖。 (五）

【具體實(shí)施方式】
[0054] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0055] 實(shí)施例1菌株篩選及鑒定
[0056] 1、菌株H4的篩選及鑒定
[0057] (1)培養(yǎng)基及試劑配方：
[0058] S0C液體培養(yǎng)基終濃度組成為：胰化蛋白胨20g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 0. 5g/ L、KC1 2. 5mmol/L、MgCl20. 01mol/L、葡萄糖 0? 02mol/L，溶劑為去離子水，pH 值 7. 0。
[0059] SOC固體培養(yǎng)基終濃度組成為：SOC液體培養(yǎng)基加質(zhì)量終濃度1. 5%的瓊脂粉。
[0060] S0C液體培養(yǎng)基配制方法：配置每升培養(yǎng)基，在965ml去離子水中加入胰化蛋白胨 20g、酵母提取物5g、NaCl 0. 5g搖動(dòng)容器使溶質(zhì)完全溶解。加10ml 250mmol/L KC1水溶液， 用5mol/L NaOH調(diào)pH至7.0,在15psi(1.05kg/cm2)高壓下蒸汽滅菌20min。滅菌后的溶 液加入5ml過(guò)濾滅菌的2mol/L MgCl2，冷卻至60°C或60°C以下，加20ml過(guò)濾滅菌的lmol/ L葡萄糖水溶液。
[0061] 脫脂奶粉培養(yǎng)基終濃度組成：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，脫脂奶粉 20g/L，15g/L瓊脂粉，溶劑為去離子水，pH值為7. 0。在15psi (1. 05kg/cm2)高壓下蒸汽滅 菌 20min。
[0062] LB液體培養(yǎng)基終濃度組成：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶劑為去離 子水，pH值為7.0。在15psi(1.05kg/cm2)高壓下蒸汽滅菌20min。
[0063] LB平板終濃度組成：LB液體培養(yǎng)基加質(zhì)量終濃度1. 5%的瓊脂粉。
[0064] (2) 土樣采集
[0065] 儲(chǔ)藏于杭州師范大學(xué)生物醫(yī)藥與健康研究中心的土樣：郴州汝城溫泉土壤。
[0066] (3)菌種初篩
[0067] 配制S0C液體培養(yǎng)基，滅菌冷卻后分裝，每根試管加入10ml培養(yǎng)基，加入土壤樣 品0. 5g，混勻后60°C水浴搖床震蕩3小時(shí)。無(wú)菌水稀釋103倍，涂布S0C固體培養(yǎng)基平板， 37°C培養(yǎng)20小時(shí)。
[0068] (4)菌種復(fù)篩
[0069] 挑取初篩平板生長(zhǎng)良好的菌落接種于脫脂奶粉培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)20小時(shí)。觀察是 否有透明圈產(chǎn)生。得到一株能產(chǎn)生明顯透明圈的菌株，標(biāo)記為菌株H4,保存。
[0070] (5)耐高溫實(shí)驗(yàn)
[0071] 將菌株H4接種于LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)6小時(shí)。分裝于10ml試管，分別在30°C、 40°C、50°C、60°C、70°C、80°C、90°C的水浴搖床震蕩半小時(shí)，取出冷卻，無(wú)菌水稀釋10 5倍，取 200iil涂布于LB平板上，37°C培養(yǎng)18小時(shí)，計(jì)數(shù)生長(zhǎng)的菌落（見(jiàn)圖1)。可見(jiàn)菌株H4能耐 70°C的高溫。
[0072] (6)蛋白酶活性實(shí)驗(yàn)
[0073] 將菌株H4接種于脫脂奶粉培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，以無(wú)蛋白酶活性的大腸桿菌 作為對(duì)照。結(jié)果見(jiàn)圖2,表明H4具有蛋白酶活性。
[0074] 將菌株H4培養(yǎng)于LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)18小時(shí)，培養(yǎng)液離心，取上清。取 BSA(lmg/ml)(購(gòu)于寶生物工程大連有限公司）100微升，加入100微升上清，50°C孵育0、5、 10、15、20、25、30分鐘，加入5ml考馬斯亮藍(lán)染色液終止反應(yīng)。分光光度計(jì)測(cè)0D_吸收值。 結(jié)果見(jiàn)圖3,表明菌株H4能產(chǎn)蛋白酶。
[0075] (7) 16S rDNA測(cè)序鑒定菌種
[0076] 使用DNA提取試劑盒（購(gòu)自杭州寶賽生物有限公司）提取菌株H4的DNA，以16S rDNA通用引物為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為16S rDNA通用引物1 iil，DNA模板 0.1 ill，dnTP2 iil，buffer 2 iil，rTaq 酶 0.2 iil，無(wú)菌水補(bǔ)足 20 ill。擴(kuò)增條件為 95 °C 預(yù) 變性5min，32個(gè)循環(huán)（98°C變性lOsec ;58°C退火30sec ;72°C延伸2min)，16°C保持。擴(kuò)增 序列由南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)定，菌株H4的16S rDNA全序列為SEQ ID. N01所 示。根據(jù)菌株H4的16S rRNA序列分析結(jié)果，結(jié)合生理生化試驗(yàn)結(jié)果，在NCBI基因庫(kù)比對(duì) 后，確定菌株H4為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)，命名為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)H4〇
[0077] 引物：

【權(quán)利要求】
1. 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)H8-3,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日 期為2013年10月21日，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M 2013483,地址為湖北武漢武漢大學(xué)。
2. -種權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌H8-3在制備腐熟菌劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C05F17/00GK104328065SQ201410519534
【公開(kāi)日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】黃黎鋒, 李海峰, 藍(lán)袁洋, 施建軍, 鐘丹成, 沈如玥 申請(qǐng)人:杭州法莫西生物醫(yī)藥科技有限公司