一種新型飼料添加劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬用的新型飼料添加劑，所述該添加劑由復(fù)方中草藥、復(fù)合微生態(tài)制劑、丁酸鈉三種主要成分組成，其中復(fù)方中草藥、復(fù)合微生態(tài)制劑、丁酸鈉按照重量比1∶1-2∶2-3混合制成本發(fā)明的新型飼料添加劑。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點在于：該新型飼料添加劑將復(fù)合微生態(tài)制劑、化學(xué)藥物、復(fù)方中草藥科學(xué)配伍，各組分相輔相成，充分發(fā)揮了三者的協(xié)同作用，調(diào)節(jié)豬的腸道微生態(tài)環(huán)境，有效減少豬的腸道疾病，提高豬的生長性能及免疫力，改善養(yǎng)殖環(huán)境，促進養(yǎng)豬業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。
【專利說明】一種新型飼料添加劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及飼料添加劑和微生態(tài)制劑領(lǐng)域，尤其涉及的是一種基于復(fù)合微生態(tài)制 劑配伍丁酸鈉及復(fù)方中草藥的新型飼料添加劑。

【背景技術(shù)】
[0002] 近幾年來，隨著飼用抗生素添加劑在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛使用，它的弊端也日益 凸顯，例如抗生素濫用導(dǎo)致動物腸道正常菌群失調(diào)，大量耐藥性菌株產(chǎn)生；對動物機體產(chǎn)生 毒副作用；危害公共衛(wèi)生安全；降低畜禽產(chǎn)品在市場上的競爭力；影響畜牧業(yè)的健康發(fā)展 和食品安全等突出問題。因此，許多國家相繼禁止或限制抗生素在飼料中的應(yīng)用，鑒于當(dāng)前 形勢，國內(nèi)外的諸多研究人員開始致力于開發(fā)通過調(diào)整動物胃腸道平衡和功能以達到促進 生長和維持動物健康水平等為目的的非抗生素飼料添加劑，微生態(tài)制劑及中草藥等因其具 有促生長、無毒、無副作用、無殘留等特點而引起了各國的廣泛關(guān)注和重視，使用的種類越 來越多，其應(yīng)用于動物生產(chǎn)的良好效果己被大量試驗和生產(chǎn)實踐所證實。
[0003] 微生態(tài)制劑是在微生態(tài)學(xué)理論的指導(dǎo)下，調(diào)整微生態(tài)環(huán)境，保持微生態(tài)平衡，提高 宿主健康水平或促進有益菌生長及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的一類制劑。根據(jù)定義，微生態(tài)制劑包 括了益生菌、益生元和合生元三個概念。近年來，國內(nèi)外研制出多種益生菌制劑，其指導(dǎo)思 想是用人或動物正常生理菌群的成員，經(jīng)過選種和人工繁殖，通過各種途徑制成活菌制劑， 然后再以投入方式使其回到原環(huán)境，發(fā)揮自然的生理作用。益生菌在使用中還可產(chǎn)生蛋白 酶、淀粉酶等活性物質(zhì)，具有促進腸道消化、抑制病原菌、增強機體免疫力等多種作用，因此 在短時間內(nèi)已得到廣泛應(yīng)用。微生態(tài)制劑仍處在發(fā)展的初期，一般微生態(tài)制劑產(chǎn)品均使用 單一益生菌，僅僅提倡增強機體自身免疫力的功能與傳統(tǒng)抗生素添加劑結(jié)合的實例較少。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)中微生物制劑發(fā)展初期品種單一、與其他領(lǐng)域交叉結(jié)合應(yīng)用實例較 少的不足，本發(fā)明提供一種將復(fù)合微生態(tài)制劑、丁酸鈉、復(fù)方中草藥原料篩選后，科學(xué)配伍 制備成新型飼料添加劑，部分替代、甚至完全替代飼用抗生素，主要用于不同日齡豬的促生 長、提高免疫力，減少豬群疾病特別是腸道疾病的發(fā)生率，滿足養(yǎng)豬業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的需 要。
[0005] 本發(fā)明選用的原料包括枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌及釀酒酵母菌，所選三株菌活 菌總數(shù)均不低于lX10 9cfu/g，均為市售品；選用的黨參和黃芪以生藥計算，均為市售品；選 用的丁酸鈉為市售品，濃度不低于98%。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明的新型飼料添加劑由復(fù)方中草藥、復(fù)合微生態(tài)制劑和丁酸鈉組成，復(fù)方中 草藥、復(fù)合微生態(tài)制劑和丁酸鈉按照質(zhì)量比1 : 1-2 : 2-3混合制成本發(fā)明的新型飼料添 加劑。其中復(fù)方中草藥包括黃芪和黨參，按照質(zhì)量比例為1 : 1混合制備復(fù)方中草藥；復(fù)合 微生態(tài)制劑包括枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌和釀酒酵母菌，其中，三種菌株的細菌數(shù)的比例 優(yōu)選為I : 2-3 : 1-2;最優(yōu)選為I : 2 : 2。其中，上述原料菌株的優(yōu)選比例經(jīng)過耐0.3% 豬膽鹽、耐PH = 3酸篩選、并按照比較三株菌混合培養(yǎng)產(chǎn)蛋白酶及淀粉酶量的方法篩選確 定。
[0008] 優(yōu)選地，復(fù)方中草藥、復(fù)合微生態(tài)制劑、丁酸鈉按照重量份數(shù)1 : 2 : 3混合制成 本發(fā)明的新型飼料添加劑。其中黃芪和黨參按照重量份數(shù)比例1 : 1制備復(fù)方中草藥；復(fù) 合微生態(tài)制劑包括枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌及釀酒酵母菌，其最優(yōu)菌株經(jīng)過耐0. 3%豬膽 鹽、耐PH = 3酸篩選；其最優(yōu)細菌數(shù)比例經(jīng)過比較三株菌混合培養(yǎng)產(chǎn)蛋白酶及淀粉酶量的 方法篩選，本發(fā)明細菌數(shù)比例為1 : 2 : 2,三株細菌菌粉按照篩選的最優(yōu)菌株及最優(yōu)細菌 數(shù)比例混合，即為所述的復(fù)合微生態(tài)制劑。
[0009] 所述一種（豬用）新型飼料添加劑的制備方法，該方法為將復(fù)方中草藥、復(fù)合微生 態(tài)制劑和丁酸鈉按比例混合制成所述添加劑。
[0010] 其中，復(fù)合微生態(tài)制劑的菌株的比例篩選方法按以下步驟進行：
[0011] ⑴枯草芽孢桿菌經(jīng)過耐〇. 3%豬膽鹽、耐PH = 3酸篩選最優(yōu)菌株后，接種到LB 培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)12±2小時，獲得枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液；
[0012] (2)干酪乳桿菌經(jīng)過耐0. 3 %豬膽鹽、耐PH = 3酸篩選最優(yōu)菌株后，接種到MRS培 養(yǎng)基中，厭氧靜置培養(yǎng)24±2小時，獲得干酪乳桿菌培養(yǎng)液；
[0013] (3)將步驟（1)、⑵的枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌在細菌數(shù)比例1?4 : 1?4 的范圍內(nèi)選取不同比例的復(fù)合配比，分別測定不同配比下混合液產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)淀粉酶的含 量，其中蛋白酶的測定采用考馬斯亮藍法，淀粉酶的測定采用碘-淀粉比色法（結(jié)果如圖 4、圖5所示），篩選出產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)淀粉酶含量高的最佳復(fù)合比例（篩選的最佳復(fù)合比例為 1 : 2?3)，將震蕩后的枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌按細菌數(shù)比例1 : 2?3混合，獲得混 合液，將混合液接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ± I °C下220rpm繼續(xù)震蕩培養(yǎng)14± 2h，獲得枯草 芽孢桿菌和干酪乳桿菌混合培養(yǎng)液；
[0014] (4)釀酒酵母菌經(jīng)過耐0. 3%豬膽鹽、耐PH = 3酸篩選最優(yōu)菌株后，接種到Y(jié)H)培 養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)28±2小時，獲得釀酒酵母菌培養(yǎng)液；
[0015] (5)將步驟（3)制得的枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌最佳細菌數(shù)比例混合培養(yǎng)液與 步驟（4)的釀酒酵母菌培養(yǎng)液進行不同比例的復(fù)合配比，所述復(fù)合配比的比例范圍為：枯 草芽孢桿菌：釀酒酵母菌的細菌數(shù)比例為I : 1?4的范圍內(nèi)選取測定不同復(fù)合配比下混 合菌液產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)淀粉酶的含量，方法同（3)所述（結(jié)果見圖6、圖7)，篩選出產(chǎn)蛋白酶、 產(chǎn)淀粉酶含量高的最佳復(fù)合比例（最佳復(fù)合比例為：枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌及釀酒酵 母菌的細菌數(shù)比例1 : 2?3 : 1?2)。
[0016] 復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法：按照上述步驟篩選的最優(yōu)菌株及最優(yōu)細菌數(shù)比例 1 : 2?3 : 1?2將三株細菌菌粉混合，即為所述的復(fù)合微生態(tài)制劑。
[0017] 其中，復(fù)方中草藥的制備方法為：將黃芪和黨參按照重量份數(shù)比例I : 1分別粉碎 過40目篩，充分混勻后在40-50°C下炒制l_2h，加入混合物2倍體積的50wt %乙醇60°C煎 煮l_2h，隨后烘干至水分低于10%，粉碎過60目篩后得到復(fù)方中草藥成品。
[0018] 本發(fā)明產(chǎn)品在豬飼料中的添加量為1500-2000g/噸。
[0019] 有益效果
[0020] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點：
[0021] 芽孢桿菌是一種好氧、無害、能產(chǎn)生芽孢、耐酸堿、耐高溫和擠壓的益生菌。該菌在 動物腸道酸性環(huán)境中具有高度的穩(wěn)定性，能夠促進豬的腸道有益菌的生長，拮抗腸道內(nèi)的 有害菌，增強機體免疫力，提高抗病能力，另外，它還能分泌較強活性的蛋白酶及淀粉酶，提 高豬的生長性能，促進飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化。目前報道較多的芽孢桿菌菌種有枯草芽孢桿 菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌及東洋芽孢桿菌等。
[0022] 乳酸菌是一種可以分解糖類并產(chǎn)生乳酸的益生菌。在豬體內(nèi)通過生物拮抗作用 降低PH值，阻止和抑制致病菌的侵入和定植；降解氨、吲哚、糞臭素等有害物質(zhì)，維持腸道 中正常的生態(tài)平衡；增強體液免疫和細胞免疫。目前應(yīng)用的乳酸菌主要是來源于乳酸桿菌 屬、乳酸鏈球菌屬和雙歧桿菌屬的近30種微生物，我國農(nóng)業(yè)部允許用作飼料添加劑的乳酸 菌有：干酪乳桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、乳酸片球菌、嗜酸乳桿菌以及乳酸腸球菌等。
[0023] 酵母菌是一種真菌類的益生菌。其有細胞核、細胞膜、細胞壁、線粒體等細胞器及 相同的酵素和代謝途經(jīng)。酵母菌無毒害作用，有氧或者無氧都能生存，其作為飼料添加劑主 要具有平衡機體、合理分配營養(yǎng)、提高動物抗應(yīng)激能力三大功效。目前常用的飼用酵母菌包 括釀酒酵母菌、產(chǎn)朊假絲酵母菌等。
[0024] 復(fù)合微生態(tài)制劑選擇枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌及釀酒酵母菌這三株益生菌，按 照耐豬膽鹽、耐酸篩選后最優(yōu)菌株后，按照產(chǎn)蛋白酶及淀粉酶高的標(biāo)準(zhǔn)篩選最優(yōu)配伍比例， 發(fā)揮了三者的功效優(yōu)勢，彌補了單一菌株的缺陷和劣勢，達到1+1+1 > 3的使用效果，其定 植于豬的腸道后可釋放蛋白酶及淀粉酶等活性物質(zhì)，達到有益菌與生物酶的有效組合，使 各種有益菌的優(yōu)良性能得到充分發(fā)揮；對豬的生產(chǎn)性能、免疫性能、腸道pH、腸道微生物等 方面都有改善，有利于促進豬的生長，提高免疫力，增加飼料的消化率。
[0025] 黨參是桔梗科植物黨參、素花黨參、或川黨參等的干燥根；味甘，性平；有補中益 氣、養(yǎng)血生津的功效，主要用于脾肺氣虛，食少倦怠，氣血不足，內(nèi)熱消渴等。黃芪，又名綿 芪；多年生草本；其有增強機體免疫功能、保肝、利尿、抗應(yīng)激和廣泛抗菌的功效。常與黨參 同用治療氣虛、腸阻、免疫力下降及細菌感染等。
[0026] 丁酸鈉作為去乙?；敢种苿軌蛱岣呓M蛋白乙?；?，已廣泛用于豬的飼 料添加劑，其功能包括促進豬胃腸道內(nèi)有益菌的生長、同時抑制有害菌生長、使胃腸道微生 態(tài)處于正平衡；為豬腸道宿主細胞提供快速能量來源；促進胃腸道上皮及免疫細胞的增殖 和成熟；提高豬生長性能；減少豬群腹瀉和死亡；促進豬非特異性免疫系統(tǒng)和特異性免疫 系統(tǒng)功能；對幼豬具有很強的誘食性。
[0027] 本發(fā)明中所述的終產(chǎn)品一種豬用新型飼料添加劑選擇微生態(tài)制劑、化學(xué)藥物及復(fù) 方中草藥科學(xué)配伍，協(xié)同改善豬的腸道微生態(tài)環(huán)境、提高飼料轉(zhuǎn)化率、提升豬的免疫力、降 低豬群疾病特別是腸道疾病的發(fā)生率，減少飼用抗生素在飼料中的應(yīng)用，同時有利于凈化 欄舍衛(wèi)生、保護和改善豬的欄舍及周邊的生態(tài)環(huán)境。該添加劑所選的原料具有安全、營養(yǎng)、 毒副作用小等特點，在豬飼料中的應(yīng)用對于養(yǎng)豬業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展有一定的實際意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1為枯草芽孢桿菌生長曲線圖；
[0029] 圖2為干酪乳桿菌生長曲線圖；
[0030] 圖3為釀酒酵母菌生長曲線圖；
[0031] 圖4為枯草芽孢桿菌與干酪乳桿菌不同復(fù)合配比下產(chǎn)蛋白酶活性；
[0032] 圖5為枯草芽孢桿菌與干酪乳桿菌不同復(fù)合配比下產(chǎn)淀粉酶酶活性；
[0033] 圖6為枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌和釀酒酵母菌不同復(fù)合配比下產(chǎn)蛋白酶活性； [0034] 圖7為枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌和釀酒酵母菌不同復(fù)合配比下產(chǎn)淀粉酶活性。

【具體實施方式】
[0035] 以下實施方式僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護范圍并非僅僅局限于以下實施 例。所述【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員依據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容，均可實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0036] 下面結(jié)合附圖1?7對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方 案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，所述的復(fù)合微生態(tài)制劑 菌株選擇及最優(yōu)菌株篩選、三種主要成分配伍比例的改進和制備方法的變化都應(yīng)視為本發(fā) 明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實質(zhì)由權(quán)利要求來限定，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的 實施例。
[0037] 培養(yǎng)基配制
[0038] LB培養(yǎng)基：包括10. Og/L的胰蛋白胨，5. Og/L的酵母浸粉和10. Og/L氯化鈉，25°C 下調(diào)節(jié)pH值至7· 0±0· 1，121°C下滅菌15min。
[0039] MRS培養(yǎng)基：包括10. Og/L的蛋白胨，8. Og/L的牛肉粉，4. Og/L的酵母粉，20. Og/ L的葡萄糖，2. 0g/L的磷酸氫二鉀，2. 0g/L的檸檬酸氫二胺，5. 0g/L的乙酸鈉，0. 2g/L的硫 酸鎂，0. 04g/L的硫酸錳和I. 0g/L的吐溫-80,25°C下調(diào)節(jié)pH值至5. 7±0. 2,118°C下滅菌 15min〇
[0040] Yro培養(yǎng)基：包括10g/L的酵母粉，20g/L的蛋白胨B和20g/L的D-無水葡萄糖， 115°C 下滅菌 15min。
[0041] 以上培養(yǎng)基中加入2g/L的瓊脂，配制成固體培養(yǎng)基。
[0042] 實施例1
[0043] 1、復(fù)合微生態(tài)制劑的篩選以及制備方法
[0044] (1)枯草芽孢桿菌的篩選
[0045] 無菌條件下，將多株市售的枯草芽孢桿菌（朝陽華星生物工程有限公司：活菌總 數(shù)2X 101(lcfu/g)經(jīng)過耐0. 3%豬膽鹽、耐PH = 3酸篩選獲得最優(yōu)菌株，分別接種到50mL 的LB液體培養(yǎng)基中，37±1°C下，220rpm震蕩培養(yǎng)，分別于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、 1611、1811、2011、2211、2411、2611、2811、3011、3211、3411、3611、3811、4011，在吸光度60011111下測定00值， 得到枯草芽孢桿菌的的生長曲線，結(jié)果如圖1所示，取指數(shù)生長后期至穩(wěn)定期后期的枯草 芽孢桿菌，分別接種到LB培養(yǎng)基中，37±1°C下220rpm震蕩培養(yǎng)12±2h ;
[0046] (2)干酪乳桿菌的培養(yǎng)
[0047] 無菌條件下，將多株市售的干酪乳桿菌（朝陽華星生物工程有限公司：活菌總數(shù) 2 X 101(lcfu/g)經(jīng)過耐0. 3 %豬膽鹽、耐PH = 3酸篩選獲得最優(yōu)菌株，在MRS固體培養(yǎng)基上 涂布，37 °C下靜置厭氧培養(yǎng)20h，挑取單菌落獲得干酪乳桿菌，接種到IOOmL的MRS液體培養(yǎng) 基中，37°C下厭氧靜置培養(yǎng)，分別于 0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、 26h、28h、30h、32h、34h、36h、38h、40h，在吸光度600nm下測定OD值，得到干酪乳桿菌的的生 長曲線，所述生長曲線如圖2所示，取指數(shù)生長后期至穩(wěn)定期后期的干酪乳桿菌菌液，接種 到MRS培養(yǎng)基中，37°C厭氧靜置培養(yǎng)24h，獲得干酪乳桿菌培養(yǎng)液；
[0048] (3)將步驟（1)、（2)震蕩培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌按細菌數(shù)比例1? 4 : 1?4進行不同比例的復(fù)合配比，測定不同配比下混合液產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)淀粉酶的含量，如 圖4、5所示，其中蛋白酶的測定采用考馬斯亮藍法，淀粉酶的測定采用碘-淀粉比色法，篩 選出產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)淀粉酶含量高的最佳復(fù)合比例為1 : 2;將混合液接種到LB液體培養(yǎng)基 中，37 ± I °C下220rpm繼續(xù)震蕩培養(yǎng)14,獲得枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌混合培養(yǎng)液；
[0049] (4)釀酒酵母菌的培養(yǎng)
[0050] 無菌條件下，將多株市售的釀酒酵母菌（安琪酵母股份有限公司：活菌總數(shù) 2 X 101(lcfu/g)經(jīng)過耐0. 3 %豬膽鹽、耐PH = 3酸篩選獲得最優(yōu)菌株，在YH)固體培養(yǎng)基上涂 布，37°C下靜置培養(yǎng)28h，挑取單菌落，在YPD固體培養(yǎng)基上進一步劃線純化，37°C培養(yǎng)28h 后，挑取單菌落，經(jīng)過耐0. 3%豬膽鹽、耐PH = 3酸篩選獲得后的釀酒酵母菌，接種到IOOmL 的YPD液體培養(yǎng)基中，37°C下厭氧靜置培養(yǎng)，分別于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、 1811、2011、2211、2411、2611、2811、3011、3211、3411、3611、3811、4011，在吸光度60011111下測定00值，得至丨』 釀酒酵母菌的的生長曲線，所述生長曲線如圖3所示，取指數(shù)生長后期至穩(wěn)定期后期的釀 酒酵母菌菌液，接種到Y(jié)H)培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)28h，獲得釀酒酵母菌培養(yǎng)液；
[0051] (5)將步驟（3)制得的優(yōu)選枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌混合培養(yǎng)液與步驟（4)的 釀酒酵母菌培養(yǎng)液進行不同比例的復(fù)合配比，所述復(fù)合配比的比例范圍為：枯草芽孢桿菌、 干酪乳桿菌及釀酒酵母菌的細菌數(shù)比例I : 2 : 1?4,測定不同復(fù)合配比下混合菌液產(chǎn)蛋 白酶、產(chǎn)淀粉酶的含量，如圖6、7所示，篩選出產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)淀粉酶含量高的最佳復(fù)合比例 為 1 : 2 : 2。
[0052] 復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法：按照上述步驟篩選的最優(yōu)菌株及最優(yōu)細菌數(shù)比例 (1 : 2 : 2)將三株細菌菌粉混合，即為所述的復(fù)合微生態(tài)制劑。
[0053] 2、復(fù)方中草藥的制備
[0054] 將黃芪和黨參按重量份數(shù)I : 1分別粉碎過40目篩，充分混勻后在40_50°C下炒 制2h，加入混合物2倍體積的50wt %乙醇60°C煎煮Ih后烘干，水分要低于10%，粉碎過60 目篩后得到復(fù)方中草藥成品。
[0055] 3、新型飼料添加劑的制備
[0056] 將上述的復(fù)方中草藥成品、復(fù)合微生態(tài)制劑、丁酸鈉（質(zhì)量濃度不低于98% )按照 重量份數(shù)1:2:3混合后制成本發(fā)明產(chǎn)品。
[0057] 實施例2
[0058] 本實施例中，制備方法與實施例1相同，包括以下步驟：
[0059] 1、復(fù)合微生態(tài)制劑的篩選及制備方法
[0060] (1)枯草芽孢桿菌的篩選
[0061] 將枯草芽孢桿菌（北京昕地美飼料科技有限公司：活菌總數(shù)2X KTcfu/g)經(jīng)過耐 0. 3 %豬膽鹽、耐PH = 3酸篩選最優(yōu)菌株后，分別接種到50mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 土 rc 下，220rpm震蕩培養(yǎng)，取指數(shù)生長后期至穩(wěn)定期后期的枯草芽孢桿菌，分別接種到LB培養(yǎng) 基中，37±1°C下220rpm震蕩培養(yǎng)12h ;
[0062] (2)干酪乳桿菌的培養(yǎng)
[0063] 將干酪乳桿菌（北京昕地美飼料科技有限公司：活菌總數(shù)2X KTcfu/g)經(jīng)過耐 0. 3%豬膽鹽、耐PH = 3酸篩選最優(yōu)菌株后，接種到IOOmL的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C下厭 氧靜置培養(yǎng)，取指數(shù)生長后期至穩(wěn)定期后期的干酪乳桿菌菌液，接種到MRS培養(yǎng)基中，37°C 厭氧靜置培養(yǎng)24h，獲得干酪乳桿菌培養(yǎng)液；
[0064] (3)將步驟（1)、（2)震蕩培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌按細菌數(shù)比例1? 4 : 1?4進行不同比例的復(fù)合配比，測定不同配比下混合液產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)淀粉酶的含量， 產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)淀粉酶含量較多的最佳復(fù)合比例為1 : 3;將混合液接種到LB液體培養(yǎng)基中， 37 土 1°C下220rpm繼續(xù)震蕩培養(yǎng)16h，獲得枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌混合培養(yǎng)液；
[0065] (4)釀酒酵母菌的培養(yǎng)
[0066] 將釀酒酵母菌（福邦品牌：活菌總數(shù)2X KTcfu/g)經(jīng)過耐0. 3%豬膽鹽、耐PH = 3酸篩選最優(yōu)菌株后，接種到IOOmL的YH)液體培養(yǎng)基中，37°C下厭氧靜置培養(yǎng)，釀酒酵母菌 在24?48h時處于指數(shù)生長后期至穩(wěn)定期后期，取指數(shù)生長后期至穩(wěn)定期后期的釀酒酵母 菌菌液，接種到Y(jié)H)培養(yǎng)基中，37 °C靜置培養(yǎng)28h，獲得釀酒酵母菌培養(yǎng)液；
[0067] (5)將步驟（3)制得的優(yōu)選枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌混合培養(yǎng)液與步驟⑷的 釀酒酵母菌培養(yǎng)液進行不同比例的復(fù)合配比，所述復(fù)合配比的比例范圍為：枯草芽孢桿菌、 干酪乳桿菌及釀酒酵母菌的細菌數(shù)比例I : 3 : 1?4,測定不同復(fù)合配比下混合菌液產(chǎn)蛋 白酶、產(chǎn)淀粉酶的含量，篩選出產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)淀粉酶含量高的最佳復(fù)合比例為：1 : 3 : 2。 [0068] 復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法：按照上述步驟篩選的最優(yōu)菌株及最優(yōu)細菌數(shù)比例 (1 : 3 : 2)將三株細菌菌粉混合，即為所述的復(fù)合微生態(tài)制劑。
[0069] 2、復(fù)方中草藥的制備
[0070] 將黃芪和黨參按重量I : 1分別粉碎過40目篩，充分混勻后在40_50°C下炒制lh， 加入混合物2倍體積的50wt%乙醇60°C煎煮Ih后烘干，水分要低于10%，粉碎過60目篩 后得到復(fù)方中草藥成品。
[0071] 3、新型飼料添加劑的制備
[0072] 將上述的復(fù)方中草藥成品、復(fù)合微生態(tài)制劑、丁酸鈉（質(zhì)量濃度不低于98% )按照 重量份數(shù)1:2:2混合后制成本發(fā)明產(chǎn)品。
[0073] 實施例3
[0074] 本實施例中，制備方法與實施例1相同，包括以下步驟：
[0075] 1、復(fù)合微生態(tài)制劑的篩選及制備方法
[0076] (1)枯草芽孢桿菌的篩選
[0077] 將枯草芽孢桿菌（北京昕地美飼料科技有限公司：2X101(lCf U/g)經(jīng)過耐0.3% 豬膽鹽、耐PH = 3酸篩選最優(yōu)菌株后，分別接種到50mL的LB液體培養(yǎng)基中，37土 TC下， 220rpm震蕩培養(yǎng)，取指數(shù)生長后期至穩(wěn)定期后期的枯草芽孢桿菌和，分別接種到LB培養(yǎng)基 中，37 ± I °C下220rpm震蕩培養(yǎng)14h ;
[0078] (2)干酪乳桿菌的培養(yǎng)
[0079] 將干酪乳桿菌（朝陽華星生物工程有限公司：2X 101(lCfU/g)經(jīng)過耐0. 3%豬膽鹽、 耐PH = 3酸篩選最優(yōu)菌株后，接種到IOOmL的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C下厭氧靜置培養(yǎng)，取 指數(shù)生長后期至穩(wěn)定期后期的干酪乳桿菌菌液，接種到MRS培養(yǎng)基中，37°C厭氧靜置培養(yǎng) 24h，獲得干酪乳桿菌培養(yǎng)液；
[0080] (3)將步驟（1)、（2)震蕩培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌按細菌數(shù)比例1? 4 : 1?4進行不同比例的復(fù)合配比，測定不同配比下混合液產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)淀粉酶的含量， 產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)淀粉酶含量較多的最佳復(fù)合比例為1 : 2;將混合液接種到LB液體培養(yǎng)基中， 37 土 1°C下220rpm繼續(xù)震蕩培養(yǎng)14h，獲得枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌混合培養(yǎng)液；
[0081] (4)釀酒酵母菌的培養(yǎng)
[0082] 將釀酒酵母菌（安琪酵母股份有限公司JXlO'fu/g)經(jīng)過耐0.3%豬膽鹽、耐 PH = 3酸篩選最優(yōu)菌株后，接種到IOOmL的YH)液體培養(yǎng)基中，37°C下厭氧靜置培養(yǎng)，釀酒 酵母菌在24?48h時處于指數(shù)生長后期至穩(wěn)定期后期，取指數(shù)生長后期至穩(wěn)定期后期的釀 酒酵母菌菌液，接種到Y(jié)H)培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)28h，獲得釀酒酵母菌培養(yǎng)液；
[0083] (5)將步驟（3)制得的優(yōu)選枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌混合培養(yǎng)液與步驟⑷的 釀酒酵母菌培養(yǎng)液進行不同比例的復(fù)合配比，所述復(fù)合配比的比例范圍為：枯草芽孢桿菌、 干酪乳桿菌及釀酒酵母菌的細菌數(shù)比例I : 2 : 1?4,測定不同復(fù)合配比下混合菌液產(chǎn)蛋 白酶、產(chǎn)淀粉酶的含量，篩選出產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)淀粉酶含量高的最佳復(fù)合比例為：1 : 2 : 2 [0084] 復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法：按照上述步驟篩選的最優(yōu)菌株及最優(yōu)細菌數(shù)比例 (1 : 2 : 2)將三株細菌菌粉混合，即為所述的復(fù)合微生態(tài)制劑。
[0085] 2、復(fù)方中草藥的制備
[0086] 將黃芪和黨參按重量I : 1分別粉碎過40目篩，充分混勻后在40_50°C下炒制2h， 加入混合物2倍體積的50%乙醇60°C煎煮2h后烘干，水分要低于10%，粉碎過60目篩后 得到復(fù)方中草藥成品。
[0087] 3、新型飼料添加劑的制備
[0088] 將上述的復(fù)方中草藥成品、復(fù)合微生態(tài)制劑、丁酸鈉（質(zhì)量濃度不低于98% )按照 重量份數(shù)I:1:2混合后制成本發(fā)明產(chǎn)品。
[0089] 試驗例1
[0090] 本試驗例中，將實施例1?3制備獲得的新型飼料添加劑進行不同的添加劑量分 別飼喂210頭平均體重8. 5kg斷奶仔豬，隨機分成7個飼料添加組，6個試驗組和1個對照 組,每個處理組設(shè)3個重復(fù)（欄），每個重復(fù)（欄）10頭，試驗動物分組情況見表1
[0091] 表1試驗用仔豬分組及新型飼料添加劑添加情況

【權(quán)利要求】
1. 一種新型飼料添加劑，其特征在于，所述添加劑由復(fù)方中草藥、復(fù)合微生態(tài)制劑和丁 酸鈉組成，其中復(fù)方中草藥、復(fù)合微生態(tài)制劑和丁酸鈉的質(zhì)量比為1 : 1-2 : 2-3。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型飼料添加劑，其特征在于，所述復(fù)方中草藥的原料為黃 苗和黨參，質(zhì)量比為黃苗：黨參=1 : 1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型飼料添加劑，其特征在于，所述復(fù)合微生態(tài)制劑包括枯 草芽孢桿菌、干酪乳桿菌和釀酒酵母菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的新型飼料添加劑，其特征在于，所述復(fù)合微生態(tài)制劑中 原料細菌數(shù)的比例為枯草芽孢桿菌：干酪乳桿菌：釀酒酵母菌=1 : 2-3 : 1-2;優(yōu)選為 1 ： 2 ： 2〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4權(quán)利要求所述的新型飼料添加劑，其特征在于，所述復(fù)合微生態(tài) 制劑的各原料的活菌總數(shù)均不低于1X l〇9cfu/g。
6. 根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的新型飼料添加劑的制備方法，其特征在于該方法為將 復(fù)方中草藥、復(fù)合微生態(tài)制劑和丁酸鈉按比例混合制成所述添加劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述復(fù)方中草藥的制備方法為選擇 重量比為1 : 1的黃芪和黨參，分別粉碎過40目篩，充分混勻后在40-50°C下炒制l-2h，力口 入混合物2倍體積的50wt %乙醇60°C煎煮2-4h，烘干至水分低于10%，粉碎后過60目篩， 得到所述復(fù)方中草藥成品。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法為 將枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌和釀酒酵母菌按照細菌數(shù)比例混合。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6或8所述的制備方法，其特征在于，所述復(fù)合微生態(tài)制劑的原料菌株 的混合比例的篩選確定方法為： (1) 枯草芽孢桿菌，經(jīng)過耐〇. 3%豬膽鹽、耐PH = 3酸篩選最優(yōu)菌株后，接種到LB培養(yǎng) 基中，震蕩培養(yǎng)12±2小時； (2) 干酪乳桿菌，經(jīng)過耐0. 3%豬膽鹽、耐PH = 3酸篩選最優(yōu)菌株后，接種到MRS培養(yǎng) 基中，厭氧靜置培養(yǎng)24±2小時，獲得干酪乳桿菌培養(yǎng)液； (3) 將步驟（1)、（2)震蕩培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌在細菌數(shù)比例 1-4 : 1-4范圍內(nèi)選取不同比例、分別混合后接種到多個LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)14±2 小時；獲得枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌混合培養(yǎng)液；測定不同配比下混合培養(yǎng)液產(chǎn)蛋白 酶、產(chǎn)淀粉酶的含量，其中蛋白酶的測定采用考馬斯亮藍法，淀粉酶的測定采用碘-淀粉比 色法，確定最佳細菌數(shù)比例；將震蕩后的枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌按確定的最佳細菌數(shù) 比例混合，獲得混合液，將混合液接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ± 1 °C下220rpm繼續(xù)震蕩培養(yǎng) 14 ±2h，獲得最佳枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌混合培養(yǎng)液； (4) 釀酒酵母菌，經(jīng)過耐0. 3%豬膽鹽、耐PH = 3酸篩選最優(yōu)菌株后，接種到Y(jié)H)培養(yǎng) 基中，靜置培養(yǎng)28±2小時，獲得釀酒酵母菌培養(yǎng)液； (5) 將步驟（3)制得的最佳細菌數(shù)比例的枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌混合培養(yǎng)液與步 驟（4)的釀酒酵母菌培養(yǎng)液在枯草芽孢桿菌：釀酒酵母菌的細菌數(shù)比例1 : 1-4范圍內(nèi)，選 取不同比例分別混合后震蕩培養(yǎng)14±2小時，獲得枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌及釀酒酵母 菌混合培養(yǎng)液，測定不同配比下混合液產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)淀粉酶的含量，方法同（3)所述，確定 最優(yōu)細菌數(shù)比例。
10.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的新型飼料添加劑，其特征在于，在豬飼料中的添加量 為 1500-2000g/ 噸。
【文檔編號】A23K1/16GK104286419SQ201410573117
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】朱天勇 申請人:沈陽天佳華生物科技有限公司