一種油松體細胞胚發(fā)生與植株再生方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種油松體細胞胚胎發(fā)生和植株再生方法，包括1)采集油松球果并進行表面滅菌，獲得無菌合子胚；2)將無菌合子胚接種到胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，進行愈傷組織誘導培養(yǎng)；3)將獲得的胚性愈傷組織接種于體細胞胚成熟培養(yǎng)基上，進行體細胞胚發(fā)生培養(yǎng)；4)將成熟的體細胞胚接種于萌發(fā)培養(yǎng)基中進行萌發(fā)培養(yǎng)，獲得體胚苗；5)將體胚苗進行煉苗、移栽，即得。通過本發(fā)明的誘導方法，首次通過誘導胚性愈傷組織的途徑獲得了大量穩(wěn)定生長的油松體細胞胚，并獲得完整小植株。本發(fā)明方法中愈傷組織誘導率、體細胞胚發(fā)生率、萌發(fā)率高，可以在短期內(nèi)形成大量優(yōu)良的油松試管苗，可進行規(guī)?；?、工廠化生產(chǎn)。
【專利說明】一種油松體細胞胚發(fā)生與植株再生方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)的方法，特別涉及油松離體培養(yǎng)和植株再生的方 法，屬于屬林業(yè)行業(yè)中的細胞工程種苗繁育【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 油松（Pinus tabulaeformis C.)，又稱紅皮松、短葉松等等，為松科松屬針葉常綠 喬木。油松是我國特有的針葉樹樹種，為華北地區(qū)最主要的造林樹種之一，其分布區(qū)跨越 14個省區(qū)。油松姿態(tài)優(yōu)美，主干嶙峋，側干崎嶇，四季常春，不畏風雪嚴寒，自古被人美譽為 具有蒼勁有力、剛正不屈的情操。因根系發(fā)達，油松具有耐旱、耐寒、耐貧瘠的抗性優(yōu)勢，在 我國北方廣大生境較差地區(qū)的造林中占有特殊地位，是綠化荒山不可取代的樹種。油松木 材富含松脂，耐腐，適作建筑、家具、枕木、人造纖維等用材，提取的松脂也是一種珍貴的工 業(yè)原料。
[0003] 自從建國以來，我國不少學者開展了油松優(yōu)樹選擇和營建種子園的工作，利用選 擇的優(yōu)樹進行營養(yǎng)繁殖，以使原植株的優(yōu)良性狀得以保持。但由于油松的營養(yǎng)繁殖很困 難，生長周期長，目前能夠用于林業(yè)生產(chǎn)的僅有嫁接方法。油松種子園投資大，結實晚， 面積有限，而建立的種子園又普遍存在種子產(chǎn)量不穩(wěn)定，球果蟲害嚴重，出種率低等問 題。這給油松良種的實生繁殖帶來很大問題，不能滿足生產(chǎn)的要求，極大的限制了良種的推 廣和應用，影響了造林質量。
[0004] 組織培養(yǎng)技術是解決良種繁殖的主要途徑之一，也是實現(xiàn)遺傳轉化及轉基因技術 的前提。體細胞胚胎發(fā)生及其植株再生技術是20世紀90年代形成的高新林業(yè)生物技術的 重要內(nèi)容之一，可用于優(yōu)良品種的大規(guī)模繁殖和用于遺傳轉化體系的建立。體細胞胚發(fā)生， 是指二倍體或單倍體細胞在未經(jīng)性細胞融合的過程，模擬合子胚發(fā)生的各個階段而發(fā)育形 成一個新的個體的形態(tài)發(fā)生和重建過程。這種經(jīng)體細胞胚胎發(fā)生而形成的在形態(tài)結構和功 能上類似于有性胚的結構被稱之為體細胞胚或者胚狀體。
[0005] 體細胞胚胎發(fā)生在保持遺傳穩(wěn)定性，提高繁殖率，縮短培養(yǎng)時間等方面與芽增殖 或其他器官發(fā)生相比具有無可比擬的優(yōu)勢，尤其在常規(guī)營養(yǎng)繁殖困難的木本植物上，更顯 示出其巨大潛力。體細胞胚胎發(fā)生技術克服了傳統(tǒng)育種方法的諸多缺點，已逐漸成為植物 快速繁殖的重要手段。
[0006] 科研人員發(fā)現(xiàn)：①外植體的選擇對針葉樹體細胞胚胎發(fā)生至關重要。外植體的類 型及成熟程度決定著體細胞胚胎發(fā)生能否成功。同一植物不同組織，器官對相同的外界信 號刺激的敏感程度不同，因此感受態(tài)也不同。一般來說，材料越幼嫩，其胚性感受態(tài)越 高，即體胚發(fā)生越容易。外植體球果在接種前必須在低溫條件下（〇 _ 4°C )冷藏一段時間， 一般要冷藏1 -2個月，沒有低溫處理不能啟動。②外植體基因型的選擇對針葉樹體細胞胚 發(fā)生存在明顯影響。不同家系之間胚性愈傷組織的誘導率，體細胞胚的獲得率均不同。③ 培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分及含量對針葉樹胚性愈傷組織及體細胞胚的誘導至關重要。
[0007] 在植物組織培養(yǎng)中，誘導體細胞胚胎發(fā)生和誘導器官發(fā)生相比具有顯著的特點： ①針葉樹胚性細胞的第一次分裂為不均等分裂，形成頂細胞和基細胞，具有兩極性。其后 體積較小的頂細胞繼續(xù)分裂形成多細胞原胚，而體積較大的基細胞進行少數(shù)幾次分裂成 為胚柄部分，在形態(tài)上具有明顯的極性。在針葉樹中，胚細胞和胚柄細胞不斷分裂發(fā)育 形成一團細胞，即胚性愈傷組織，在松柏類植物中稱為胚性胚柄團（embryoic suspensor mass，ESM)。ESM由細胞質濃，體積較小的胚頭細胞和高度液泡化、伸長的胚柄細胞組成。② 體細胞胚形成后與母體植物或外植體分離，出現(xiàn)所謂生理上的隔離現(xiàn)象。胚性細胞細胞壁 加厚，很容易把它們與其它細胞分開。體胚與合子胚十分相似，從一開始就是完整的個體。 ③體細胞胚胎發(fā)生途徑相比植物組織培養(yǎng)中器官發(fā)生，是最直接體現(xiàn)植物細胞全能性的方 式，重演了合子胚形態(tài)發(fā)生的進程。目前有關植物組織培養(yǎng)技術的各類文獻中，尚未見有油 松（Pinus tabulaeformis C.)體細胞胚胎發(fā)生和植株再生的研究技術。
[0008] 本發(fā)明的主要目的是針對油松天然結實率低，扦插困難，種苗繁殖技術無法滿足 大面積植樹造林需要的現(xiàn)狀，尋找一種油松體細胞胚胎發(fā)生的技術，為油松的大規(guī)模無性 繁殖育苗提供一種周期短、繁殖率高、成本低廉的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的首要目的是針對上述現(xiàn)有技術存在的問題提供一種新的油松體細胞胚 發(fā)生和植株再生方法，該方法的油松體細胞胚誘導率高、體胚萌發(fā)率高，可以在較短時間內(nèi) 形成大量優(yōu)良的油松試管苗，可進行規(guī)模化、工廠化生產(chǎn)，本發(fā)明為油松的大規(guī)模無性繁殖 育苗提供一種周期短、繁殖率高、成本低廉的方法。
[0010] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供一種油松體細胞胚發(fā)生和植株再生方法，包 括如下順序進行的步驟：
[0011] 1)采集油松球果；
[0012] 2)將油松球果進行表面滅菌后取出其合子胚，獲得無菌合子胚；
[0013] 3)將無菌合子胚接種到胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，獲 得胚性愈傷組織；
[0014] 4)將胚性愈傷組織接種于體細胞胚成熟培養(yǎng)基上，進行體細胞胚發(fā)生培養(yǎng)，獲得 體細胞胚；
[0015] 5)將成熟的體細胞胚接種于萌發(fā)培養(yǎng)基中進行萌發(fā)培養(yǎng)，獲得體胚苗；
[0016] 6)將體胚苗進行煉苗、移栽，即得。
[0017] 本發(fā)明中所述體細胞胚簡稱體胚。
[0018] 油松的外植體胚齡對愈傷組織的誘導率影響顯著，過嫩或過熟的合子胚均不能得 到理想的胚性愈傷組織誘導結果。本發(fā)明通過大量的實驗發(fā)現(xiàn)，處于開花散粉后第6 -10周 時間段內(nèi)的油松球果作為外植體，其胚性愈傷組織誘導效果相比于其它時間段內(nèi)的球果有 明顯的提高；進一步的實驗發(fā)現(xiàn)，采集處于油松開花散粉后第44天至第65天這一時間段內(nèi) 的球果作為外植體的合子胚處于球形胚和魚雷胚階段，其繁殖效果有進一步的提高，采用 處于油松開花散粉后第44天至第58天這一時間段內(nèi)的球果作為外植體的繁殖效果得到了 更進一步的提高，采用處于開花散粉后第51天的油松球果作為外植體取得了最好的繁殖 效果：采集油松開花散粉后第51天的球果中的未成熟合子胚在誘導培養(yǎng)基上的出愈率均 高于其它時期的外植體，其胚性愈傷組織誘導率為6 - 10%、誘導得到的胚性愈傷組織生長 速度快，呈透明晶瑩狀，水分很大，松散狀態(tài)，經(jīng)多次繼代仍能保持較高的活力；愈傷組織有 胚性和非胚性的區(qū)別，其中胚性愈傷組織結構松散，半透明，非胚性愈傷組織結構致密，顏 色發(fā)黃，之后的實驗不能得到體胚；胚性愈傷組織發(fā)育成體細胞胚誘導率為100%，體胚萌 發(fā)率達80%，均明顯高于其它時段的外植體，所以本發(fā)明最優(yōu)選采集處于開花散粉后第51 天的油松球果作為外植體。
[0019] 其中，步驟2)中所述滅菌處理包括如下順序進行的步驟：
[0020] A)將采集的油松球果首先用洗潔精清洗，接著用自來水沖洗；
[0021] B)吸干球果表面水分后從球果中取出種子；
[0022] C)種子首先用酒精浸泡，接著用無菌水進行第一次沖洗，然后用HgCl2溶液浸泡種 子，再用無菌水進行第二次沖洗，得到無菌種子；
[0023] D)吸干種子表面的水分后在無菌狀態(tài)下，剝?nèi)o菌種子種皮，得到無菌合子胚。
[0024] 特別是，步驟A)中采用自來水沖洗油松球果至少IOmin ;步驟C)中所述酒精的體 積百分比濃度為75% ;浸泡時間為Imin ;無菌水第一次沖洗3 - 5次；所述HgCl2溶液的質 量百分比濃度為0. 1% ;浸泡時間為3 - 15min，優(yōu)選為IOmin ;無菌水第二次沖洗5 - 6次。
[0025] 特別是，在對采集的油松球果進行滅菌處理之前，還包括將采集的油松球果于 0-4°C冷藏1-2個月后，再進行所述滅菌處理。
[0026] 其中，步驟3)中所述胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基是改良1/2LM培養(yǎng)基+2， 4-D1 - 6mg/l+6-節(jié)胺基噪呤0? 5-2mg/l+水解酪蛋白500mg/l+谷氨酰胺500mg/l+鹿糖 20-50g/L+瓊脂7g/L，pH值為5.8 ;優(yōu)選為：改良1/2LM培養(yǎng)基+2,4-D 2 - 3mg/l+6-芐胺 基嘌呤l-2mg/l+水解酪蛋白500mg/l+谷氨酰胺500mg/l+蔗糖20-50g/L+瓊脂7g/L，pH 值為5. 8 ;進一步優(yōu)選為：改良1/2LM培養(yǎng)基+2,4-D 2mg/l+6-芐胺基嘌呤lmg/1+水解酪 蛋白500mg/l+谷氨酰胺500mg/l+鹿糖20-50g/L+瓊脂7g/L，pH值為5. 8。
[0027] 特別是，步驟3)中所述胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)在以下條件下進行：黑暗條件下， 培養(yǎng)溫度為25 ±2°C ;培養(yǎng)時間為50 - 60天。
[0028] 尤其是，胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)過程中每20 - 25天繼代培養(yǎng)一次；繼代培養(yǎng)次數(shù) 為2 - 3次。
[0029] 尤其是，胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)過程中的相對濕度為60 - 75%。
[0030] 特別是，還包括步驟3A)胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)，將步驟3)獲得胚性愈傷組織接 種于胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，進行愈傷組織增殖培養(yǎng)，獲得增殖胚性愈傷組織。
[0031] 其中，所述胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基是改良1/2LM培養(yǎng)基+2,4-D 0. I - LOmg/ 1+6-芐胺基嘌呤0? 05-0. 5mg/l+水解酪蛋白500mg/l+谷氨酰胺500mg/l+蔗糖20-50g/L+ 瓊脂7g/L，pH值為5. 8 ;優(yōu)選為改良1/2LM培養(yǎng)基+2,4-D 0? 2 - 0? 4mg/l+6-芐胺基嘌呤 0? 1 - 0? 2mg/l+ 水解酪蛋白 500mg/l+ 谷氨酰胺 500mg/l+ 蔗糖 20-50g/L+ 瓊脂 7g/L，pH 值 為 5. 8。
[0032] 特別是，步驟3A)中所述胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)在以下條件下進行：黑暗條件下， 培養(yǎng)溫度為25±2°C ;培養(yǎng)時間為6 - 8周。
[0033] 尤其是，胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)過程中每3 - 4周繼代培養(yǎng)一次；繼代培養(yǎng)次數(shù)為 2 - 3 次。
[0034] 尤其是，胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)過程中的相對濕度為60 - 75%。
[0035] 特別是，還包括步驟3B)胚性愈傷組織調(diào)整培養(yǎng)，將步驟3A)獲得的增值胚性愈傷 組織接種于胚性愈傷組織調(diào)整培養(yǎng)基上，進行調(diào)整培養(yǎng)，獲得調(diào)整胚性愈傷組織。
[0036] 其中，所述胚性愈傷組織調(diào)整培養(yǎng)基是改良1/2LM培養(yǎng)基+活性炭l_3g/l+水解 酪蛋白500mg/l+谷氨酰胺500mg/l+蔗糖50-60g/L+瓊脂7g/L，pH值為5.8 ;優(yōu)選為改良 1/2LM培養(yǎng)基+活性炭2g/l+水解酪蛋白500mg/l+谷氨酰胺500mg/l+蔗糖50-60g/L+瓊 脂 7g/L，pH 值為 5.8。
[0037] 特別是，步驟3B)中所述胚性愈傷組織調(diào)整培養(yǎng)在以下條件下進行：黑暗條件下， 培養(yǎng)溫度為25±2°C ;培養(yǎng)時間為7 - 15天。
[0038] 尤其是，胚性愈傷組織調(diào)整培養(yǎng)過程中的相對濕度為60 - 75%。
[0039] 其中，步驟4)中所述體細胞胚成熟培養(yǎng)基是改良1/2LM培養(yǎng)基+PEG400050-100g/ 1+脫落酸50-10011〖/1111+活性炭（4〇1-3〖/1+水解酪蛋白50011^/1+谷氨酰胺50011^/1+鹿 糖50-70g/L+瓊脂7g/L，pH值為5. 8 ;優(yōu)選為改良1/2LM培養(yǎng)基+PEG400060-80g/l+脫落 酸50-90 ii g/ml+活性炭l-2g/l+水解酪蛋白500mg/l+谷氨酰胺500mg/l+鹿糖50-70g/L+ 瓊脂7g/L，pH值為5. 8 ;步驟5)中所述萌發(fā)培養(yǎng)基是WPM基本培養(yǎng)基+IBA I - 2mg/L+NAA 0? 2 -2mg/L+ 蔗糖 10-20g/L+ 瓊脂 7g/L+AC lg/L，pH 值為 5. 8 ;優(yōu)選為 WPM 基本培養(yǎng)基 +IBA lmg/L+NAA 0.5mg/L+鹿糖 20g/L+瓊脂 7g/L+AC lg/L。
[0040] 特別是，步驟4)中所述體細胞胚發(fā)生培養(yǎng)在以下條件下進行：黑暗條件下，培養(yǎng) 溫度為25±2°C ;培養(yǎng)過程中的相對濕度為60 - 75%。
[0041] 尤其是，步驟4)中所述體細胞胚發(fā)生培養(yǎng)過程中每3 -4周繼代培養(yǎng)一次；繼代培 養(yǎng)次數(shù)為2次；培養(yǎng)時間為40 - 50天。
[0042] 特別是，步驟5)中所述萌發(fā)培養(yǎng)在以下條件下進行：光照條件下，培養(yǎng)溫度為 25±2°C ;培養(yǎng)過程中的相對濕度為60 - 75%。
[0043] 尤其是，步驟5)中所述萌發(fā)培養(yǎng)的培養(yǎng)時間為7 - 8天；光照強度為 1500 - 20001ux，光照周期為10 - 16h光照/8 - 14h黑暗。
[0044] 其中，步驟6)中所述煉苗、移栽包括順序進行的步驟：打開培養(yǎng)瓶蓋，在移栽室內(nèi) 煉苗培養(yǎng)1天，取出植株，用自來水洗凈試管苗根部殘留的瓊脂培養(yǎng)基，移栽到油松無土栽 培基質（珍珠巖、蛭石，珍珠巖與蛭石的體積之比為1:1)中在移栽室進行容器培養(yǎng)。移苗 后一周保持相對濕度為70 - 90%，培養(yǎng)溫度為25±5°C，7 - 10天后獲得油松幼苗。
[0045] 在試管苗移栽過程中，移入時不要損傷根系，用薄塑料膜套在容器上方，注意保持 足夠的濕度，精心管理。
[0046] 本發(fā)明的油松體細胞胚發(fā)生和植株再生方法具有以下優(yōu)點：
[0047] 1、本發(fā)明利用油松幼胚作為外植體進行體細胞胚發(fā)生和植株再生繁殖，每個培養(yǎng) 階段所采用的基本都是改良的1/2LM培養(yǎng)基（除了萌發(fā)培養(yǎng)基之外，萌發(fā)培養(yǎng)的基本培養(yǎng) 基是WPM)，具有低鹽的特征，研究表明，降低NH4+對薺菜胚培養(yǎng)能提高存活率和生長量，椰 子汁、水解酪蛋白、谷氨酰胺等是除了 NH4+外提供還原氮的主要來源。本發(fā)明去掉NH4NO3, 用谷氨酰胺和水解酪蛋白等提供有機形式的還原態(tài)氮，可起到明顯的促進分裂的作用，可 以為胚性愈傷組織生長提供合適的生長環(huán)境和所需營養(yǎng)成分，維持其胚性穩(wěn)定性和快速增 殖能力，能夠讓胚性愈傷組織發(fā)育成質量良好的體胚。
[0048] 2、本發(fā)明的其中體胚發(fā)生和植株再生方法是在大量試驗的基礎上，根據(jù)油松體胚 的發(fā)育特征，在其各個培養(yǎng)階段向基礎培養(yǎng)基中添加不同的植物生長調(diào)節(jié)劑及有機化合物 所得，本方法所用的培養(yǎng)基利于油松胚性愈傷組織的誘導、增殖、調(diào)整以及體細胞胚發(fā)生、 體細胞胚萌發(fā)，改良培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分比例適宜，其中胚性愈傷組織的誘導率為3. 9-10%， 占愈傷組織總量的40-100%、體細胞胚發(fā)生率達90-100%、體細胞胚萌發(fā)率達53%以上。
[0049] 3、本發(fā)明方法繁殖的油松苗生長健壯、繁殖系數(shù)高，培養(yǎng)時間短，是工廠化大規(guī)模 生產(chǎn)油松幼苗的簡便、快捷的技術體系。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0050] 圖1是油松未成熟合子胚誘導培養(yǎng)的胚性愈傷組織；
[0051] 圖2是油松胚性愈傷組織增殖階段分化出胚頭和胚柄結構；
[0052] 圖3是油松胚性愈傷組織調(diào)整培養(yǎng)階段表面有刺狀突起；
[0053] 圖4是油松胚性愈傷組織成熟培養(yǎng)的油松體細胞胚；
[0054] 圖5是油松體細胞胚萌發(fā)培養(yǎng)的體胚苗；
[0055] 圖6是油松體胚苗煉苗、移栽得到的油松幼苗。

【具體實施方式】
[0056] 下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0057] 本發(fā)明實施例中數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel和SPSS10.0軟件進行方差分析與多 重比較（鄧肯式檢驗，P = 0. 01);百分數(shù)經(jīng)反正弦（y = arcsin x1/2)轉換后再進行分析和 比較，鄧肯式顯著性檢驗結果存在顯著差異。
[0058] 實施例1
[0059] 一、試驗材料
[0060] 1、油松未成熟的合子胚
[0061] 本發(fā)明以北京林業(yè)大學林場（北京市海淀區(qū)，經(jīng)度：116. 34,緯度：40. 00)良好、成 熟，健康，無蟲害，結實率高的10棵油松為取材資源，在2013年5月上旬至6月下旬期間， 采集散粉后第4 - 11周的油松球果，每間隔7天采集一次，即采集散粉后30、37、44、51、58、 65、72、79天的球果，每次每棵樹采集30個球果，每次一共采集300個球果，將當天采集的球 果在冰盒中低溫保存帶回實驗室，之后放在〇 - 4°C的冰箱里冷藏1-2個月，備用。
[0062] 2、植物生長調(diào)節(jié)劑
[0063] 本發(fā)明中所使用的植物生長調(diào)節(jié)物質采用國產(chǎn)6 -芐氨基腺嘌呤（6 - BA)、2,4 - 二氯苯氧基乙酸（2, 4-D)。
[0064] 3、培養(yǎng)基
[0065] (1)改良1/2LM培養(yǎng)基
[0066] 表1改良1/2LM培養(yǎng)基配方
[0067]

【權利要求】
1. 一種油松體細胞胚發(fā)生和植株再生方法，包括如下順序進行的步驟： 1) 采集油松球果； 2) 將油松球果進行表面滅菌后取出其合子胚，獲得無菌合子胚； 3) 將無菌合子胚接種到胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，獲得胚 性愈傷組織； 4) 將胚性愈傷組織接種于體細胞胚成熟培養(yǎng)基上，進行體細胞胚發(fā)生培養(yǎng)，獲得體細 胞胚； 5) 將成熟的體細胞胚接種于萌發(fā)培養(yǎng)基中進行萌發(fā)培養(yǎng)，獲得體胚苗； 6) 將體胚苗進行煉苗、移栽，即得。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征是：所述的油松球果是處于油松開花散粉后4-11 周時間段內(nèi)的油松球果；優(yōu)選處于油松開花散粉后6-9周時間段內(nèi)的油松球果。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征是：步驟3)中所述胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基是改 良1/2LM培養(yǎng)基+2,4-D 1 - 6mg/l+6-芐胺基嘌呤0? 5-2mg/l+水解酪蛋白500mg/l+谷氨 酰胺 500mg/l+ 蔗糖 20-50g/L+ 瓊脂 7g/L。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征是還包括步驟3A)胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)，將步 驟3)獲得胚性愈傷組織接種于胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，進行愈傷組織增殖培養(yǎng)，獲得 增殖胚性愈傷組織。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征是所述胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基是改良1/2LM培 養(yǎng)基+2,4-0 0.1-1.01^/1+6-芐胺基嘌呤0.05-0.51^/1+水解酪蛋白50011^/1+谷氨酰胺 500mg/l+ 鹿糖 20-50g/L+ 瓊脂 7g/L。
6. 如權利要求4所述的方法，其特征是還包括步驟3B)胚性愈傷組織調(diào)整培養(yǎng)，將步 驟3A)獲得的增殖胚性愈傷組織接種于胚性愈傷組織調(diào)整培養(yǎng)基上，進行調(diào)整培養(yǎng)，獲得 調(diào)整胚性愈傷組織。
7. 如權利要求6所述的方法，其特征是所述胚性愈傷組織調(diào)整培養(yǎng)基是改良1/2LM培 養(yǎng)基+活性炭l_3g/l+水解酪蛋白500mg/l+谷氨酰胺500mg/l+蔗糖50-60g/L+瓊脂7g/ L〇
8. 如權利要求1所述的方法，其特征是步驟4)中所述體細胞胚成熟培養(yǎng)基是改良 1/2LM培養(yǎng)基+PEG400050-100g/l+脫落酸50-100 y g/ml+活性炭l-3g/l+水解酪蛋白 500mg/l+ 谷氨酰胺 500mg/l+ 鹿糖 50-70g/L+ 瓊脂 7g/L。
9. 如權利要求1所述的方法，其特征是步驟5)中所述萌發(fā)培養(yǎng)是WPM基本培養(yǎng)基+IBA 1 - 2mg/L+NAA 0? 2 - 0? 5mg/L+ 活性炭 lg/L+ 蔗糖 10-20g/L+ 瓊脂 7g/L。
10. 如權利要求1所述的方法，其特征是步驟3)中所述胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)、4)中 所述體細胞胚發(fā)生培養(yǎng)在以下條件下進行：黑暗條件下，培養(yǎng)溫度為25±2°C。
【文檔編號】A01H4/00GK104381131SQ201410573714
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月24日 優(yōu)先權日:2014年10月24日
【發(fā)明者】張金鳳, 李慧, 趙健, 王曉琪, 付雙彬, 康向陽, 羅曉芳, 張俊琦, 胡冬梅 申請人:北京林業(yè)大學