甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌及其在防治禾谷鐮刀菌方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌及其在防治禾谷鐮刀菌方面的應(yīng)用。本發(fā)明公開的一株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)，其保藏編號為CGMCC No.9500，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示。該菌株用于在生物防治鐮刀菌引起的植物病害中的應(yīng)用，作為小麥和玉米作物病害的生物防治材料，無論開發(fā)新的生物農(nóng)藥或者生物防治菌劑，該菌都具有很好的應(yīng)用前景。CGMCC No.95002014.07.18
【專利說明】甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌及其在防治禾谷鐮刀菌方面的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌及及其在防治禾谷 鐮刀菌方面的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 禾谷鐮刀菌（Fusariumgraminearum)是禾本科作物的重要病原菌之一，可引起 麥類赤霉病（FusariumHeadBlight，F(xiàn)HB)，禾谷鐮刀菌為限制小麥產(chǎn)量的一個主要因素 (Dubin，1997)。我國氣候條件十分有利于麥類赤霉病的發(fā)生，長江中下游地區(qū)常年病害造 成產(chǎn)量損失10 % -15 %，大流行年份減產(chǎn)近50 %。由于全球氣候變暖以及秸桿還田、免耕栽 培等耕作制度改變的影響，我國麥類赤霉病的發(fā)生區(qū)域由長江流域迅速向西北、華北擴展， 特別是在2008、2010和2012年，全國麥類赤霉病發(fā)生十分嚴(yán)重，造成了嚴(yán)重的產(chǎn)糧損失和 不良的社會影響，嚴(yán)重威脅我國糧食安全。
[0003] 禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇〇)〇N，3, 7, 15三羥基-12, 13環(huán)氧單端孢 霉-9烯-8酮）是存在于赤霉病菌感染麥粒中的主要天然毒素之一。DON已被認(rèn)定為最 危險的自然發(fā)生食品污染物之一，被列入國際研究的優(yōu)先地位。DON可致人免疫力下降、 貧血、頭痛、腹痛、惡心；致動物拒食、生長延滯和流產(chǎn)（Rochaetal.，2005;Sobrovaet al.，2010 ;Pestka，2010)。DON廣泛存在并大量污染小麥及其制品，對人畜構(gòu)成很大危害， 嚴(yán)重威脅我國食品安全。因此，加強禾谷鐮刀菌防控研究已成為保障我國糧食安全和食品 安全的迫切需求。
[0004] 多年來對麥類赤霉病防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，但隨著化學(xué)農(nóng)藥帶來的環(huán)境問 題，加之多年用藥已導(dǎo)致病原菌抗藥性禾谷鐮刀菌菌株的出現(xiàn)（ChangjunChenetal.， 2007)，使防治難度加大。雖然在赤霉病抗性品質(zhì)方面國內(nèi)外投入大量的精力開展相關(guān)研 究，但至今尚無理想的高抗小麥品種（李正輝等，2007)。
[0005] 生物防治不僅可降低對環(huán)境的影響，還不易產(chǎn)生抗藥性，相關(guān)理論和技術(shù)的研究 日益為人們所關(guān)注。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌營養(yǎng)簡單，在自然界中廣泛存在，對人畜無毒無 害，不污染環(huán)境，能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力，較其他 微生物更具有開發(fā)為生物防控菌劑的潛力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌及其在防治禾谷鐮刀菌方面的應(yīng) 用。
[0007] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0008] 本發(fā)明提供的一種甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillusmethylotrophicus)，該菌株 已進(jìn)行保藏，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址：北京市朝 陽區(qū)北辰西路1號院3號；保藏日期：2014年7月18日；藏編號：CGMCCNo. 9500。
[0009] 本發(fā)明的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌用于在生物防治鐮刀菌引起的植物病害中的應(yīng)用， 所述的鐮刀菌為禾谷鐮刀菌，所述病害為赤霉病或穗腐病或根腐病，所述植物為谷物；所述 谷物為麥類作物或玉米；所述麥類作物具體為小麥。
[0010] 本發(fā)明的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌用于制備防治鐮刀菌引起的植物病害的藥物中的 應(yīng)用，通過常規(guī)的液體后固體培養(yǎng)，獲得包括細(xì)菌菌體培養(yǎng)物，通過常規(guī)的液體發(fā)酵生產(chǎn)， 加入表面活性劑如分散劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、粘結(jié)劑、消泡劑、崩解劑、抗凍劑等中的一種或 幾種，或吸附載體按一定比例混合后，制備成可濕性粉劑、水分散粒劑、懸浮劑、懸乳劑、水 乳劑或微乳劑。
[0011] 本發(fā)明甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌防治鐮刀菌引起的植物病害的方法也屬于本發(fā)明的 保護范圍，該方法是在植物生長過程中進(jìn)行噴霧處理；所述噴霧為該甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌 的菌懸液或發(fā)酵液或代謝產(chǎn)物或制備的農(nóng)藥制劑。
[0012] 本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明提供的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌不僅在平板培養(yǎng)時可高 效抑制禾谷鎌刀囷，而且在溫室實驗中其防治效果_達(dá)77. 4%。作為小麥赤霉病的生物防 治材料，無論開發(fā)新的生物農(nóng)藥或者生物防治菌劑，該菌都具有很好的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1是JS20GA對禾谷鐮刀菌的對峙培養(yǎng)實驗，圖1A為以僅接種禾谷鐮刀菌菌盤 的PDA平板對照組，圖1B為在距PDA平板中心25mm處四點劃線接種相同體積和濃度的 JS20GA；
[0014] 圖2是JS20GA產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體的抑菌實驗，圖2A為接種禾谷鐮刀菌菌盤的PDA 平板的對照組，圖2B為在NA平板中心接種JS20GA，倒扣于接有禾谷鐮刀菌的平板。

【具體實施方式】
[0015] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的 較佳實施例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用 上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi) 容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修改、等同變化與改型，均落在本 發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0016] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0017]NB液體培養(yǎng)基：由溶劑和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)為蛋白胨、牛肉膏和NaCl，溶劑為水；蛋 白胨在NB液體培養(yǎng)基中的濃度為1 %，牛肉膏在NB液體培養(yǎng)基中的濃度為0. 3 %，NaCl在 NB液體培養(yǎng)基中的濃度為0. 5%，所述％均為質(zhì)量體積百分比（g/100ml)。
[0018]NA固體培養(yǎng)基：在NB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂（瓊脂與液體培養(yǎng)基的比例為1. 5g: 100ml)，得到NA固體培養(yǎng)基。
[0019] PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，加入少量水煮20min，三層紗布過濾，取濾液用水定容至 1L，加入20g葡萄糖，15g瓊脂，121°C高壓滅菌20min。
[0020] 綠豆湯培養(yǎng)基：綠豆10g，加入少量水煮20min，三層紗布過濾，取濾液用水定容至 1L，分裝后121°C高壓滅菌20min。
[0021] 磷酸鹽緩沖液：由溶劑和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)為磷酸二氫鉀和氯化鎂，溶劑為水； 磷酸二氫鉀的濃度為〇. 004%，氯化鎂的濃度為0. 019%，所述％均為質(zhì)量體積百分比 (g/lOOml)。
[0022] 禾谷鐮刀菌（Fusariumgraminearum)FGl在文獻(xiàn)"楊慧勇，李飛鳳，陸瓊嫻，徐 劍宏，史建榮.拮抗菌株AFR0406對小麥赤霉病菌和紋枯病菌的生物活性測定.江蘇農(nóng)業(yè) 科學(xué)，2006 (06)，142-144. "中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所獲得。
[0023] 小麥?zhǔn)?28品種在文獻(xiàn)"孫志軍，楊曉麗，張輝，張廣輝.小麥新品種石新828選 育過程及高產(chǎn)栽培技術(shù).現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011 (09)，96-97. "中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè) 科學(xué)院農(nóng)廣品加工研究所獲得。
[0024] 實施例1菌的分離與鑒定
[0025] 一、菌的分離
[0026] ( -）2012年6月，在超凈工作臺中，將10穗江蘇采集的小麥病穗放在100ml無菌 蒸餾水中震蕩15分鐘制備菌懸液，然后80°C水浴處理10分鐘。
[0027](二）將菌懸液用無菌蒸餾水進(jìn)行濃度梯度稀釋后涂布在NA培養(yǎng)基平板上，30°C 條件下培養(yǎng)24小時，菌落布滿整個平板，用接種環(huán)挑取平板上形態(tài)、大小、顏色、透明度不 同的菌株平板劃線純化，點接純化后的菌株應(yīng)用于禾谷鐮刀菌對峙培養(yǎng)實驗。將得到的對 禾谷鐮刀菌拮抗能力強的一株菌命名為JS20GA。
[0028]二、鑒定
[0029] (一）按照"伯杰細(xì)菌鑒定手冊"（第八版）和"常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊"（東秀珠， 蔡妙英等編著，北京：科學(xué)出版社，2001. 2)中描述的方法，對菌株JS20GA進(jìn)行形態(tài)特征、培 養(yǎng)特性和生理生化特性鑒定，具體結(jié)果如下：
[0030] 菌體的形態(tài)和生理生化特性：
[0031] 在NA培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)1天，菌體桿狀，直徑約為0. 5-0. 7 ii mX 1. 5-3. 0 ii m ;菌落 奶白色，圓形，微凸，邊緣整齊。
[0032] 生理生化特征：
[0033] 氧化酶：+ ;精氨酸雙水解酶：_ ;明膠水解：+ ;淀粉水解：+ ;過氧化氫酶：+ ;三丁 酸甘油脂水解：+ ;硝酸鹽還原：+ ;七葉靈水解：+ ;酪素水解：+ ;Tween80水解：_ ;卩引哚實 驗：_ ;脈酶：_ ;朽1樣酸利用：+ ;H2S生成：-;VP實驗：+ ;厭氧生長：-;4% NaCl ;pH4. 0 : + ;50°C ;20°C:+。
[0034] 可以利用甘油、L_阿拉伯糖、D_核糖、D_木糖、L_木糖、阿東醇、D_半乳糖、D_匍 萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、a-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙 酰葡糖胺、熊果苷、七葉靈、水楊苷、D-纖維二糖、D-麥芽糖、D-乳糖、D-蜜二糖、D-蔗糖、 菊糖、D-松三糖、D-棉籽糖、淀粉、糖原、D- 土倫糖、D-來蘇糖、D-巖藻糖、L-巖藻糖產(chǎn)酸。
[0035] (二）16SrDNA試驗
[0036] 提取JS20GA的總DNA，以其為模板，利用細(xì)菌16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴增，得 到長度約為1. 4kb的擴增產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物回收并進(jìn)行測序，測得的序列如SEQIDNo. 1所 /_J、i〇
[0037]根據(jù)Gen-Bank序列同源性比較，菌株JS20GA與Bacillus sp. B1 (GenBank 登錄號KF922381. 1)同源性為99%，與Bacillus amylol iquefaciens subsp. plantarumNAU_B3 (GenBank登錄號HG514499.
[0038] 1)同源性為99%，初步判定該菌為芽孢桿菌屬細(xì)菌（Bacillussp.)?；谝陨咸?征，將菌株JS20GA鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillusmethylotrophicus)。該菌株已于 2014年7月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地 址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為 CGMCCNo. 9500。
[0039]實施例2甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌JS20GA對禾谷鐮刀菌的拮抗作用 [0040] 采用對峙培養(yǎng)法檢測甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌JS20GA對禾谷鐮刀菌的拮抗。
[0041] -、用直徑為5mm的打孔器在培養(yǎng)好的病原真菌禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum)FGl菌落邊緣打取菌盤，用滅菌的牙簽將菌盤挑入PDA平板中心。
[0042] 二、在距PDA平板中心25mm處四點劃線接種相同體積和濃度的JS20GA，以僅接種 禾谷鐮刀菌菌盤的PDA平板為對照組，28°C培養(yǎng)4-5天，觀察有無抑菌帶形成。每個組做三 個平行。結(jié)果如表1所示：
[0043] 表1培養(yǎng)5天后JS20GA對禾谷鐮刀菌的抑制作用
[0044]

【權(quán)利要求】
1. 一種甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，其特征在于：該菌株已于2014年7月18日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 9500。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，其特征在于：該甲基營養(yǎng)型芽孢 桿菌的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌用于在生物防治鐮刀菌引起的植物病 害中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌用于制備防治鐮刀菌引起的植物病害 的藥物中的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述的鐮刀菌為禾谷鐮刀菌； 所述病害為鐮刀菌引起的赤霉病或穗腐病或根腐病； 所述植物為谷物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于：所述谷物為小麥或玉米。
【文檔編號】A01N63/02GK104342393SQ201410601775
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】趙月菊, 劉陽, 邢福國, 周露, 王龑 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所