針葉天藍繡球的組織培養(yǎng)繁育方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種針葉天藍繡球的組織培養(yǎng)繁育方法，解決該品種優(yōu)良品種基數少、繁殖速度慢，無法滿足生產需求問題，該方法包括以下的步驟：1)外植體選擇；2)外植體滅菌；3)接種培養(yǎng)；4)增殖培養(yǎng)；5)壯苗培養(yǎng)；6)瓶外生根馴化。本發(fā)明在溫室內搭建拱棚，育苗盤底部給水，控溫控濕進行瓶外生根馴化，建立了針葉天藍繡球組培快繁體系。此方法使該品種繁殖系數增加迅速，一個增殖周期為28-35天，增殖系數在5.78倍，縮短培養(yǎng)周期25-30天且不受季節(jié)的影響，可極大提高種苗繁殖系數，一年繁殖系數可達1萬倍左右，本發(fā)明簡便易行，操作簡單，有效的縮短了培養(yǎng)周期，成活率高，成本低，為針葉天藍繡球優(yōu)良種苗的規(guī)?；a提供了可靠地技術途徑。
【專利說明】針葉天藍繡球的組織培養(yǎng)繁育方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種針葉天藍繡球的組織培養(yǎng)繁育方法。
技術背景
[0002]針葉天藍繡球(Phlox subulata)為花惹科福祿考屬多年生草本，其適應性強，抗寒、抗干旱、耐貧瘠，花期早、群植效果顯著通過大面積種植能夠形成多個觀賞景區(qū)，能夠改善寒冷地區(qū)早春園林花卉品種少、色彩單調的局面，由于在我國寒冷地區(qū)引進栽培針葉天藍繡球優(yōu)良品種較少，無法滿足生產需求，限制了該品種在寒地的大面積推廣與應用。通過植物組織培養(yǎng)，快速繁殖優(yōu)良品種，是解決該問題行之有效的方法之一。
[0003]針葉天藍繡球在園林應用中的主要特點是，群植效果顯著，能夠形成大面積的觀賞景觀，通過針葉天藍繡球的組織培養(yǎng)繁育方法，解決了該品種優(yōu)良原種資源奇缺，得不到大面積生產的實際問題。


【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明簡便易行，操作簡單，有效的縮短了培養(yǎng)周期，成活率高，成本低，為針葉天藍繡球優(yōu)良種苗的規(guī)?；a提供了可靠地技術途徑。為了實現上述目的，本發(fā)明的技術方案為:一種針葉天藍繡球的組織培養(yǎng)繁育方法，包括以下步驟:
[0005]1)外植體篩選:春季從新萌發(fā)的葉天藍繡球的母株上剪取粗壯的健康嫩莖；
[0006]2)外植體滅菌:剪去嫩莖上針葉，先用自來水浸泡并沖洗30分鐘，用洗潔劑清洗
1-2遍，再用自來水流水沖洗20-30分鐘，用質量百分比濃度為75%酒精浸泡10-15秒，放入含氯質量百分比濃度為5%的次氯酸鈉溶液內滴入1-2滴吐溫20(TWeen20)，置于磁力攪拌器上均勻攪拌15-25分鐘，在超凈工作臺內，倒掉消毒液，用無菌水沖洗3-5遍，濾紙吸干水分備用；
[0007]3)接種培養(yǎng):將滅好菌的嫩莖切口傾斜45度，切成2-3cm的莖段，每段帶有1_2個葉芽，直立插于誘導培養(yǎng)基中，在22-25°C，光照14小時培養(yǎng)3-4周，光照強度為1800?2000勒克斯(Lux)，Lux為:照度的國際單位，莖段潛伏芽生長出長l-2cm的新芽；所述培養(yǎng)基構成為:基本培養(yǎng)基(MS)附加0.5mg/L萘乙酸(NAA)和lmg/L6_芐胺基嘌呤(6-BA)，棉砂糖 15-20g/L，瓊脂粉 5g/L，ρΗ5.8-6.2 ；
[0008]4)增殖培養(yǎng):切取長l-2cm的新芽，切去新長葉片，插入增殖培養(yǎng)基中，在22-25°C，光照14小時，光照強度為1800?2000勒克斯(Lux)的培養(yǎng)室內培養(yǎng)4_6周后，每個莖段萌發(fā)出叢生芽；分割新長出的側芽，需大量繁殖時，此階段可重復進行；所述培養(yǎng)基構成為:基本培養(yǎng)基(MS)附加0.5mg/L萘乙酸(NAA)和lmg/L6_芐胺基嘌呤(6-BA)，棉砂糖 15-20g/L，瓊脂粉 5g/L，ρΗ5.8-6.2 ；
[0009]5)壯苗培養(yǎng):增殖培養(yǎng)中長到l-2cm長的叢生芽切割后，轉入壯苗培養(yǎng)基中，在22-25°C，光照14小時光照強度為1800?2000勒克斯(Lux)，黑暗10小時的培養(yǎng)室內培養(yǎng)
2-3周，形成無側芽小苗，待苗長到3-5cm時，將瓶苗移置過渡培養(yǎng)間。瓶膜稍敞開，但并不完全揭開，保持瓶內與室內環(huán)境一至，1-2天后，去掉瓶膜1天。挑選健壯苗轉入基質中進行瓶外生根馴化；所述培養(yǎng)基構成為:基本培養(yǎng)基(MS)附加0.5mg/L6-芐基腺嘌呤(6-BA)，棉砂糖 6-10g/L，瓊脂粉 5g/L，ρΗ5.8-6.2 ；
[0010]6)瓶外生根馴化:按照周年計劃在寒冷地區(qū)每年12月至次年4月份，挑選健壯3-5cm高的組培苗，用溫水洗凈培養(yǎng)基，浸泡在于室內溫度接近的水中，在溫室內搭建拱棚，拱棚底部鋪設防漏塑料膜，將組培苗移栽到以草炭、珍珠巖、蛭石體積比2:2:1為基質的128穴盤內，128穴盤為:有128個孔的育苗盤，育苗盤在拱棚內底部給水，溫度25-30°C，2-3周后開始生根；
[0011]基本培養(yǎng)基(MS)中所述大量元素，由質量百分比濃度，1900mg/L的硝酸鉀(KN03)，440mg/L 的氯化鈣(CaCl2.2Η20)，370mg/L 的硫酸鎂(MgS04.7Η20)，1650mg/L 的硝酸銨(ΝΗ4Ν03)，170mg/L的磷酸二氫鉀(ΚΗ2Ρ04.Η20)組成，配制大量元素母液1L，10倍量，分別取 19000mgKN03、4400mgCaCl2 *2H20,3700mgMgS04.7Η20、16500mgNH4N03、1700mg KH2P04.Η20，分別溶解后混合定容至1L，每配置1L培養(yǎng)基取大量元素母液100ml ;微量元素由體積百分比濃度為22.3mg/L的硫酸錳(MnS04.4Η20)，6.2mg/L的硼酸(H3B03)，8.6mg/L的硫酸鋅(ZnS04.7H20)，0.25mg/L 的鑰酸鈉(Na2Mo04.2H20)，0.025mg/L 的硫酸銅(CuS04.5H20)，0.025mg/L的氯化鈷(CoCl2.6H20), 0.83mg/L的碘化鉀(KI)組成，配置微量元素母液1L，100 倍量，分別取 2230mgMnS04.4H20、620mgH3B03，860mgZnS04.7H20, 25mgNa2Mo04.2H20,
2.5mgCuS04.5H20, 2.5mgCoCl2.6H20,83mgKI，分別溶解后混合定容至1L，每配置1L培養(yǎng)基取微量元母液10ml ;鐵鹽由質量百分比濃度為27.8mg/L的硫酸亞鐵(FeS04.7Η20)和質量百分比濃度為37.3mg/L的乙二胺四乙酸二鈉(Na2.EDTA.2H20)螯合后的溶液(EDTA_Fe)組成，配置鐵鹽母液1L，分別取2780mgFeS04.7H20、3730mgNa2.EDTA.2H20,分別加熱溶解，混合后再煮沸約20分鐘，冷卻后定容至1L，每配置1L培養(yǎng)基取鐵鹽溶液10ml ;有機物由質量百分比濃度為0.5mg/L的煙酸,0.5mg/L的鹽酸卩比卩多醇,0.4mg/L的鹽酸硫胺素,2mg/L的甘氨酸，100mg/L的肌醇組成,配置有機物母液1L,分別取50mg的煙酸,50mg的鹽酸卩比卩多醇，40mg的鹽酸硫胺素,200mg的甘氨酸，lOOOOmg的肌醇,分別溶解,混合后定容至1L,每配置1L培養(yǎng)基取有機物母液10ml ;棉砂糖15-20g/L，瓊脂粉5g/L，pH值5.8?6。
[0012]本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)【技術領域】，涉及一種針葉天藍繡球的組織培養(yǎng)繁育及瓶外生根方法，以針葉天藍繡球當年萌發(fā)的嫩莖段為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，利用萘乙酸NAA、6-芐基腺嘌呤6-BA、吲哆叮酸等外源激素，在溫室內搭建拱棚，底部給水，控溫控濕進行瓶外生根馴化，建立了針葉天藍繡球組培快繁體系。此方法使該品種繁殖系數增加迅速，一個增殖周期為28-35天，增殖系數在5.78倍，縮短培養(yǎng)周期25-30天且不受季節(jié)的影響，可極大提高種苗繁殖系數，一年繁殖系數可達1萬倍左右，本發(fā)明簡便易行，操作簡單，有效的縮短了培養(yǎng)周期，成活率高，成本低，為針葉天藍繡球優(yōu)良種苗的規(guī)模化生產提供了可靠地技術途徑。

【專利附圖】

【附圖說明】
:
[0013]圖1為外植體芽誘導實驗數據統計表
[0014]圖2為側芽分化實驗統計表
[0015]圖3為生根實驗統計表

【具體實施方式】
[0016]本發(fā)明是一種針葉天藍繡球的組織培養(yǎng)繁育方法，包括以下幾個步驟:
[0017]1)外植體篩選:春季從新萌發(fā)的葉天藍繡球的母株上剪取粗壯的健康嫩莖；
[0018]2)外植體滅菌:將步驟1)剪去嫩莖上針葉，先用自來水浸泡并沖洗30分鐘，用洗潔劑清洗1-2遍，再用自來水流水沖洗20-30分鐘，用75%酒精浸泡10-15秒，放入含氯質量百分比濃度為5%的次氯酸鈉溶液內，滴入1-2滴吐溫20(TWeen20)，置于磁力攪拌器上均勻攪拌15-25分鐘，消毒時要注意外植體的顏色變化，時間過長接種不易成活，過短容易發(fā)生污染，在超凈工作臺內，倒掉消毒液，用無菌水沖洗3-5遍，確認消毒液沖洗干凈后，濾紙吸干水分，放入培養(yǎng)皿中備用；
[0019]3)接種培養(yǎng):將步驟2)滅好菌的嫩莖切口傾斜45度，切成2-3cm的莖段，每段帶有1-2個葉芽，直立插于誘導培養(yǎng)基中，外植體插入培養(yǎng)基不易過深，在22-25°C，光照14小時光照強度為1800?2000勒克斯(Lux)，黑暗培養(yǎng)10小時培養(yǎng)3_4周，莖段潛伏芽生長出長l-2cm的新芽；如圖1所示；所述培養(yǎng)基構成為:基本培養(yǎng)基(MS)附加0.5mg/L萘乙酸(NAA)和 lmg/L6-芐基腺嘌呤(6-BA)，棉砂糖 15_20g/L，瓊脂粉 5g/L，pH5.8-6.2 ；
[0020]4)增殖培養(yǎng):從步驟3)選中取長l-2cm的新芽，切去新長葉片的2/3，插入增殖培養(yǎng)基中，在22-25°C，光照14小時光照強度為1800?2000勒克斯(Lux)，黑暗10小時的培養(yǎng)室內培養(yǎng)4-6周后，每個莖段萌發(fā)出叢生芽；分割新長出的側芽，需大量繁殖時，此階段可重復進行；如圖2所示；所述培養(yǎng)基構成為:基本培養(yǎng)基(MS)附加0.5mg/L萘乙酸(NAA)和 lmg/L6-芐基腺嘌呤(6-BA)，棉砂糖 15_20g/L，瓊脂粉 5g/L，pH5.8-6.2 ；
[0021]5)壯苗培養(yǎng):將步驟4)增殖培養(yǎng)中長到l-2cm長的叢生芽切割后，轉入壯苗培養(yǎng)基中，在22-25°C，光照14小時光照強度為1800?2000勒克斯(Lux)，黑暗10小時的培養(yǎng)室內培養(yǎng)2-3周，形成無側芽小苗，待苗長到3-5cm時，將瓶苗移置過渡培養(yǎng)間。瓶膜稍敞開，但并不完全揭開，保持瓶內與室內環(huán)境一至，1-2天后，去掉瓶膜1天。挑選健壯苗轉入基質中進行瓶外生根馴化；所述培養(yǎng)基構成為:基本培養(yǎng)基(MS)附加0.5mg/L6-芐基腺嘌呤(6-BA)，棉砂糖 6-10g/L，瓊脂 15 ?20g/L，ρΗ5.8-6.2 ；
[0022]6)瓶外生根馴化:按照周年計劃在寒冷地區(qū)每年12月至次年4月份，在步驟5)中挑選健壯3-5cm高的組培苗，用溫水洗凈培養(yǎng)基，浸泡在于室內溫度接近的水中，在溫室內搭建拱棚，拱棚底部鋪設防漏塑料膜，將組培苗移栽到以草炭、珍珠巖、蛭石體積比2:2:1為基質的128穴盤內，128穴盤為:有128個孔的育苗盤，育苗盤底部給水，溫度25_30°C，拱棚密閉，溫度過高可通風降溫，2-3周后開始生根，生根率100%。莖葉的馴化溫度在20-25°C，3-5周，期間逐步打開、撤掉棚膜，10周后移入溫度20°C的溫室內，出苗前3周移入室外煉苗；如圖3所示。
[0023]如圖1所示，從表1可以看供試的植株外植體100個，3-4周后，其全部分化出側芽，外植體芽誘導率達到100%。
[0024]如圖2所示，從表2中可以看出，以100個側芽為基數，通過1個月的培養(yǎng)，擴繁得到的組培不定芽578個，增殖倍數為5.78倍。
[0025]如圖3所示，從表3可以看出，500株瓶外生根的組織培養(yǎng)苗經過4周馴化培養(yǎng)500株均正常生根，其中死亡35株，其成活率約為93%。
[0026]如圖1、圖2、圖3所示，從表1、2、3中可知，本發(fā)明從外植體選擇，外植體滅菌；接種培養(yǎng)；增殖培養(yǎng)；壯苗培養(yǎng)；瓶外生根馴化，建立了一整套針葉天藍繡球組培快繁體系。分化率達到100%，月增殖系數達到5.78，生根率達到100%，成活率達到93%。
【權利要求】
1.一種針葉天藍繡球的組織培養(yǎng)繁育方法，其特征是:包括以下幾個步驟: . 1)外植體篩選:春季從新萌發(fā)的葉天藍繡球的母株上剪取粗壯的健康嫩莖； . 2)外植體滅菌:剪去嫩莖上針葉，先用自來水浸泡并沖洗30分鐘，用洗潔劑清洗1-2遍，再用自來水流水沖洗20-30分鐘，用質量百分比濃度為75%酒精浸泡10-15秒，放入含氯質量百分比濃度為5%的次氯酸鈉溶液內滴入1-2滴吐溫20 (Tween20)，置于磁力攪拌器上均勻攪拌15-25分鐘，在超凈工作臺內，倒掉消毒液，用無菌水沖洗3-5遍，濾紙吸干水分備用; . 3)接種培養(yǎng):將滅好菌的嫩莖切口傾斜45度，切成2-3cm的莖段，每段帶有1_2個葉芽，直立插于誘導培養(yǎng)基中，在22-25°C，光照14小時培養(yǎng)3-4周，光照強度為1800?2000勒克斯(Lux)，Lux為:照度的國際單位，莖段潛伏芽生長出長l-2cm的新芽；所述培養(yǎng)基構成為:基本培養(yǎng)基(MS)附加0.5mg/L萘乙酸(NAA)和lmg/L6_芐胺基嘌呤(6-BA)，棉砂糖.15-20g/L，瓊脂粉 5g/L，ρΗ5.8-6.2 ； . 4)增殖培養(yǎng):切取長l_2cm的新芽，切去新長葉片，插入增殖培養(yǎng)基中，在22-25°C，光照14小時，光照強度為1800?2000勒克斯(Lux)的培養(yǎng)室內培養(yǎng)4_6周后，每個莖段萌發(fā)出叢生芽；分割新長出的側芽，需大量繁殖時，此階段可重復進行；所述培養(yǎng)基構成為:基本培養(yǎng)基(MS)附加0.5mg/L萘乙酸(NAA)和lmg/L6_芐胺基嘌呤(6-BA)，棉砂糖15_20g/L,瓊脂粉 5g/L，ρΗ5.8-6.2 ； . 5)壯苗培養(yǎng):增殖培養(yǎng)中長到l-2cm長的叢生芽切割后，轉入壯苗培養(yǎng)基中，在.22-25°C，光照14小時光照強度為1800?2000勒克斯(Lux)，黑暗10小時的培養(yǎng)室內培養(yǎng).2-3周，形成無側芽小苗，待苗長到3-5cm時，將瓶苗移置過渡培養(yǎng)間。瓶膜稍敞開，但并不完全揭開，保持瓶內與室內環(huán)境一至，1-2天后，去掉瓶膜I天。挑選健壯苗轉入基質中進行瓶外生根馴化；所述培養(yǎng)基構成為:基本培養(yǎng)基(MS)附加0.5mg/L6-芐基腺嘌呤(6-BA)，棉砂糖 6-10g/L，瓊脂粉 5g/L，ρΗ5.8-6.2 ； .6)瓶外生根馴化:按照周年計劃在寒冷地區(qū)每年12月至次年4月份，挑選健壯3-5cm高的組培苗，用溫水洗凈培養(yǎng)基，浸泡在于室內溫度接近的水中，在溫室內搭建拱棚，拱棚底部鋪設防漏塑料膜，將組培苗移栽到以草炭、珍珠巖、蛭石體積比2:2:1為基質的128穴盤內，128穴盤為:有128個孔的育苗盤，育苗盤在拱棚內底部給水，溫度25-30°C，2-3周后開始生根，生根率100% ； 基本培養(yǎng)基(MS)中所述大量元素，由質量百分比濃度，1900mg/L的硝酸鉀(KNO3),.440mg/L 的氯化鈣(CaCl2.2H20), 370mg/L 的硫酸鎂(MgSO4.7H20)，1650mg/L 的硝酸銨(NH4NO3)，170mg/L的磷酸二氫鉀(KH2PO4 -H2O)組成，配制大量元素母液1L，10倍量，分別取.19000mgKN03、4400mgCaCl2.2H20、3700mgMgS04.7H20、16500mgNH4N03、1700mg KH2PO4.H2O,分別溶解后混合定容至1L，每配置IL培養(yǎng)基取大量元素母液10ml ;微量元素由體積百分比濃度為22.3mg/L的硫酸錳(MnSO4.4H20),6.2mg/L的硼酸(H3BO3)，8.6mg/L的硫酸鋅(ZnSO4.7H20),0.25mg/L 的鑰酸鈉(Na2M0O4.2H20),0.025mg/L 的硫酸銅(CuSO4.5H20)，.0.025mg/L的氯化鈷(CoCl2.6H20), 0.83mg/L的碘化鉀(KI)組成，配置微量元素母液1L，.100 倍量，分別取 2230mgMnS04.4H20、620mgH3B03，860mgZnS04.7H20，25mgNa2Mo04.2H20,.2.5mgCuS04.5H20, 2.5mgCoCl2.6H20,83mgKI，分別溶解后混合定容至1L，每配置IL培養(yǎng)基取微量元母液1ml ;鐵鹽由質量百分比濃度為27.8mg/L的硫酸亞鐵(FeSO4.7Η20)和質量百分比濃度為37.3mg/L的乙二胺四乙酸二鈉(Na2.EDTA.2H20)螯合后的溶液(EDTA-Fe)組成，配置鐵鹽母液1L，分別取2780mgFeS04.7H20、3730mgNa2.EDTA.2H20,分別加熱溶解，混合后再煮沸約20分鐘，冷卻后定容至1L，每配置IL培養(yǎng)基取鐵鹽溶液1ml ;有機物由質量百分比濃度為0.5mg/L的煙酸,0.5mg/L的鹽酸卩比卩多醇,0.4mg/L的鹽酸硫胺素，2mg/L的甘氨酸，100mg/L的肌醇組成,配置有機物母液1L,分別取50mg的煙酸,50mg的鹽酸卩比B多醇，.40mg的鹽酸硫胺素,200mg的甘氨酸，1000mg的肌醇,分別溶解,混合后定容至1L,每配置IL培養(yǎng)基取有機物母液1ml ;棉砂糖15-20g/L，瓊脂粉5g/L，pH值5.8?6.2。
【文檔編號】A01H4/00GK104381133SQ201410648995
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月14日 優(yōu)先權日:2014年11月14日
【發(fā)明者】唐煥偉, 曲彥婷, 張冬青, 張興, 韓輝, 李黎, 陳菲, 熊燕, 張鵬遠, 羅春雨, 于振良 申請人:黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所