一種甘薯病毒苗的莖尖脫毒方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及了一種甘薯病毒苗莖尖脫毒及培養(yǎng)方法，所述方法包括以下步驟：(1)取已感染薯羽狀斑駁病毒和/或甘薯G病毒的薯塊，室內(nèi)培養(yǎng)至萌芽；(2)剪取生長至1.5～2.0cm長的頂芽進行消毒；(3)從步驟(2)所得頂芽中無菌剝離帶2個葉原基的莖尖作為外植體進行接種培養(yǎng)，獲得再生植株；(4)對步驟(3)所得再生植株經(jīng)2～3次繼代培養(yǎng)建立株系，依次采用指示植物法和硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附法進行檢測，獲得脫毒株系；(5)對脫毒株系進行快速繁殖，即得脫毒苗。本發(fā)明提供的方法能快速建立其適用于大多數(shù)甘薯品種/品系的莖尖培養(yǎng)和脫毒苗快繁的培養(yǎng)體系。
【專利說明】_種甘署病毒苗的蓮尖脫毒方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及甘薯莖尖分生組織的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)和組織培養(yǎng)技術(shù)，即是涉及一種一種甘薯病毒苗的莖尖脫毒方法。

【背景技術(shù)】
[0002]甘薯(Ipomoea batatas L.)是一種重要的糧食、飼料和工業(yè)原料作物，具有產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富、適應(yīng)性強、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。當(dāng)前推廣的甘薯品種，一般是有性雜交一代的無性系，在遺傳上是高度雜合的，因此生產(chǎn)上利用薯塊進行無性繁殖來保持優(yōu)良種性的要求。甘薯生產(chǎn)中是以薯塊留種并年年進行無性繁殖，種薯一旦受到病毒病的浸染，便造成病毒病的積累而蔓延，從而造成甘薯總產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降，甚至種性退化等嚴(yán)重問題，顯然病毒病給甘薯生產(chǎn)帶來巨大威脅，是當(dāng)今現(xiàn)代農(nóng)業(yè)高能源型甘薯產(chǎn)業(yè)化發(fā)展中必須高度重視的高危病毒病問題。
[0003]Morel和Martin早在1952年就利用分生組織培養(yǎng)獲得大麗花和馬鈴薯脫毒苗，同時建立了莖尖脫毒的組織培養(yǎng)技術(shù)體系。然而直至目前，對病毒在植物體內(nèi)分布不均一性的機理還不十分清楚，通過大量的研宄認(rèn)為，基本已經(jīng)證實了莖尖分生組織并不是完全沒有病毒，只是不帶或很少帶有病毒，在實際應(yīng)用中依然是以幾種假說作為理論依據(jù)。但就脫毒而言，莖尖仍然是植物脫毒培養(yǎng)并得以保持物種種性更為理想的外植體，在甘薯組織培養(yǎng)研宄中也是首選外植體。為此，利用莖尖脫毒仍然是甘薯生產(chǎn)中無性繁殖作物雜種一代無性系優(yōu)勢利用的主要途徑。莖尖的葉原基個數(shù)直接影響到莖尖培養(yǎng)成苗率及其脫毒效果，不帶葉原基的莖尖分生組織則成苗困難，而分離多個葉原基的莖尖分生組織又會對脫毒效果產(chǎn)生不利影響。
[0004]專利文獻CN103190264A公開了一種馬鈴薯莖尖脫毒方法，包括以下步驟:1)將需要脫毒的原原種進行田間播種；2)植株生長期常規(guī)管理；3)在現(xiàn)蕾或開花期從馬鈴薯地里篩選健康的植株，做好標(biāo)記，較其他植株提前半個月收獲，每株篩選個大，薯型標(biāo)準(zhǔn)和健康的種薯單獨收獲和貯存；4)種薯發(fā)芽后，剪取幼芽進行病毒檢測；5)將檢測健康的種薯，重新催芽后剪取大芽經(jīng)酒精和升汞殺菌處理后，放于常規(guī)MS固體培養(yǎng)基上做成莖段苗；6)將長高的莖段苗，剪取上部三分之一高度保種，剩余三分之二進行病毒檢測；7)病毒檢測合格后，按照常規(guī)方法進行快繁；通過本發(fā)明可以在相對短的周期內(nèi)獲得馬鈴薯脫毒試管苗，得到的脫毒試管苗健康，遺傳基因穩(wěn)定。但是該方法無法適用于大多數(shù)甘薯品種/品系的甘薯莖尖培養(yǎng)和脫毒苗快繁的培養(yǎng)體系。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種適用于多種甘薯品種/品系的甘薯病毒苗莖尖脫毒及培養(yǎng)方法，所述甘薯病毒為薯羽狀斑駁病毒和/或甘薯G病毒。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種甘薯病毒苗莖尖脫毒及培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0007](I)材料培養(yǎng):取已感染薯羽狀斑駁病毒和/或甘薯G病毒的薯塊，室內(nèi)培養(yǎng)至萌芽；
[0008](2)材料消毒:剪取生長至1.5?2.0cm長的頂芽進行消毒；
[0009](3)接種培養(yǎng):從步驟(2)所得頂芽中無菌剝離帶2個葉原基的莖尖作為外植體進行接種培養(yǎng)，獲得再生植株；
[0010](4)株系建立與病毒檢測:對步驟(3)所得再生植株經(jīng)2?3次繼代培養(yǎng)建立株系，依次采用指示植物法和硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附法進行檢測，獲得脫毒株系；
[0011](5)快速繁殖:對脫毒株系進行快速繁殖，即得脫毒苗。
[0012]本發(fā)明所述步驟(I)具體為:選取收獲已攜帶病毒的薯塊，洗凈表面后用30?35mg/kg赤霉素(GA3)浸種25?30min，用消毒濕砂覆埋于25?27°C黑暗催芽，當(dāng)芽露出砂面后用38?40°C熱處理7?8d。
[0013]本發(fā)明所述步驟(2)中，所述消毒具體為:先用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇浸泡25?30s，無菌水沖洗一遍，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 %的HgCl2浸泡8?lOmin，無菌水沖洗3?5遍。
[0014]本發(fā)明所述步驟(3)中，所述莖尖大小為0.22?0.35mm ;莖尖形態(tài)為突起態(tài)、半閉合態(tài)或閉合態(tài)；其中，半閉合態(tài)和閉合態(tài)的成苗培養(yǎng)效果好，突起態(tài)的脫毒效果好；
[0015]所述無菌剝離具體為:用鑷子夾取消毒材料置于墊有濕潤濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，然后在雙目體視鏡下，一只手用一根解剖針按住莖尖的另一端，另一只手持解剖針縱向去掉包圍在莖尖外層的幾層幼葉，當(dāng)接近莖尖生長點之下的第3?4個幼葉時，要求做到剝?nèi)ヒ粚?片幼葉的解剖針就應(yīng)在酒精燈火焰上灼燒一次重新滅菌，同時并轉(zhuǎn)移材料在濾紙上的位置，待無菌剝離至2個葉原基時，并再一次重新對解剖針進行滅菌，待針尖冷卻后將莖尖分生組織橫切下來，迅速將已經(jīng)粘附到針尖上的莖尖接種到莖尖培養(yǎng)基上；
[0016]所述接種培養(yǎng)的培養(yǎng)基由以下成分組成:基本培養(yǎng)基MS, 0.8?1.4mg/L 6-節(jié)氨基腺嘌呤(BAP)，0.01?0.02mg/L α -萘乙酸(NAA);或基本培養(yǎng)基MS，0.2?0.8mg/L BAP，0.1 ?0.2mg/L3-吲哚乙酸(IAA)；
[0017]所述接種培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為:溫度25?30°C，光照強度1600LX，光照時數(shù)12?14h0
[0018]本發(fā)明所述步驟(4)中，所述檢測具體為:以試管苗株系對巴西牽牛用涂抹法和嫁接法觀察病毒引起的癥狀，以巴西牽牛為指示植物進行檢測后確認(rèn)無毒的試管苗株系再用硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫檢測法(NCM-ELISA)進行檢測；其中，NCM-ELISA檢測程序為:樣品米集一在膜上點樣一加入封阻液一沖洗一添加特異病毒抗體一沖洗一加入酶標(biāo)抗體一沖洗一顯色一終止反應(yīng)，得到無紫色反應(yīng)(陰性)的脫毒株系。
[0019]本發(fā)明所述步驟(5)中，所述快速繁殖的培養(yǎng)基由以下成分組成:MS基本培養(yǎng)基，
0.1 ?0.2mg/L IAA, 0.1 ?0.5mg/L GA3;
[0020]所述快速繁殖的條件為:溫度28?30°C，光照時數(shù)12?16h。
[0021]作為優(yōu)選方案，本發(fā)明所述方法包括以下步驟:
[0022](I)材料培養(yǎng):選取已感染薯羽狀斑駁病毒和/或甘薯G病毒的薯塊，洗凈表面后用30?35mg/kg GA3浸種25?30min，用消毒濕砂覆埋于25?27°C黑暗催芽，當(dāng)芽露出砂面后用38?40°C熱處理7?8d ;
[0023](2)材料消毒:剪取生長旺盛的長1.5?2.0cm頂芽，在超凈工作臺上切去完全展開的葉片，然后消毒；消毒時將材料先用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇浸泡25?30s，無菌水沖洗一遍，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 %的HgCl2浸泡8?lOmin，無菌水沖洗3?5遍；
[0024](3)接種培養(yǎng):在解剖鏡下無菌剝離0.22?0.35mm大小的生長點帶2個葉原基，接種在預(yù)先制備好的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基組成為:MS基本培養(yǎng)基+0.8?1.4mg/L BAP+0.01?0.02mg/LNAA+0.1 ?0.2mg/L GA3;或 MS 基本培養(yǎng)基 +0.2 ?0.8mg/L ΒΑΡ+0.1 ?0.2mg/LΙΑΑ+0.1?0.2mg/LGA3;培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度26?28°C，光照強度1500?1600Lx，光照時數(shù)12?14h ；
[0025](4)株系建立與病毒檢測:對來自不同品種/品系的莖尖初代培養(yǎng)建立的試管苗嚴(yán)格按株系序號進行繼代培養(yǎng)建立株系，病毒檢測先采用指示植物法用株系涂抹或摩擦巴西牽牛植株葉片生長數(shù)日后觀察引起的癥狀來鑒定，不出現(xiàn)癥狀得到無病毒的株系，再用NCM-ELISA法檢測，其檢測程序為:樣品米集一在膜上點樣一加入封阻液一沖洗一添加特異病毒抗體一沖洗一加入酶標(biāo)抗體一沖洗一顯色一終止反應(yīng)，得到無紫色反應(yīng)的脫毒株系;
[0026](5)快速繁殖:快速繁殖培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基+0.1?0.2mg/L ΙΑΑ+0.1?
0.511^/11^3;在28?30°C、12?16h/d條件下對步驟(4)所得脫毒株系進行快速繁殖，即得脫毒苗。
[0027]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的方法具有以下優(yōu)勢:
[0028]1、本發(fā)明提供的方法可針對不同品種/品系的甘薯病毒苗，適用于大多數(shù)甘薯品種/品系的甘薯莖尖培養(yǎng)和脫毒苗快繁的培養(yǎng)體系，可應(yīng)用于多種甘薯良種和實生系，目前已應(yīng)用成功的品種包括:徐薯18、南薯99、川薯101、魯薯8號、渝薯2號、棉粉I號、北京553、南薯88、渝紫13、商丘52-7、潮薯I號、寧紫I號、勝利百號、蘇薯I號、臺農(nóng)10號；品系包括:0936-16、1008-17、1011-1、1011-4、1013-7、1038-7、1041-3、1112-5、1127-3、1144-3、1173-6、I197-2、1202-1、1204-3、1213-21、1213-22、1213-23、1213-28、1213-34、1213-40、1214-3、1226-2、1246-4、1246-19、1272-6 ；
[0029]具體而言，成苗率(成苗數(shù)/接種數(shù))在91.7?94.4 %的品種/品系為:渝薯 2 號、棉粉 I 號、綿薯早秋、徐薯 18、1213-21、1213-23、1213-28、1213-34、1213-40 ;在82.2?89.1 %的品種/品系為:南薯88、南薯99、北京553、魯薯8號、蘇薯I號、勝利百號、臺農(nóng) 10 號、0936-16、1011-1、1011-4、1013-7、1112-5、1127-3、1144-3、1173-6、1197-2 ；在72.2?79.6%的品種/品系為:川薯101、南瑞苕、商丘52_7、渝紫13、寧紫I號、潮薯
I號、1008-17、1038-7、1041-3、1202-1、1204-3、1213-22、1214-3、1226-2、1246-4、1246-19、1272-6 ；
[0030]上述材料為甘薯新品種育種優(yōu)良親本，利用該技術(shù)體系，可用于甘薯優(yōu)良種質(zhì)資源的保存、保護，為優(yōu)良親本的利用所必需。
[0031]2、本發(fā)明提供的方法采用兩種檢測方法:采用指示植物法是以試管苗株系涂抹法和嫁接法對巴西牽牛進行病毒檢測，以及利用NCM-ELISA的血清學(xué)方法進行病毒檢測。
[0032]3、本發(fā)明提供的方法是在甘薯脫毒研宄中，不同于一般采用2?4葉原基0.5?
1.5mm大小的莖尖，并結(jié)合溫?zé)峄蚶鋬霪煼ㄌ幚砗笤龠M行離體培養(yǎng)。直至目前，國內(nèi)外尚未見莖尖僅以2葉原基形態(tài)大小為外植體對成苗培養(yǎng)及其脫毒效果的相關(guān)報道，因此本發(fā)明公開了甘薯生長點所具有的2葉原基形態(tài)特征。
[0033]綜上所述，本發(fā)明公開了甘薯莖尖2葉原基不同形態(tài)再生植株的成苗率及其脫毒效果，還公開了大多數(shù)甘薯品種/品系的莖尖培養(yǎng)和脫毒苗快繁的培養(yǎng)體系，同時也將對其它植物的脫毒培養(yǎng)具有技術(shù)方法上的借鑒作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖:
[0035]圖1為本發(fā)明所述莖尖2葉原基形態(tài)，包括頂芽無菌剝離后露出的外觀形態(tài)和三種莖尖葉原基形態(tài)的外植體示意圖，其中，LP1表示第I葉原基，LP 2表示第2葉原基，AD表示生長錐。
[0036]圖2為本發(fā)明所述三種形態(tài)莖尖初代培養(yǎng)的分化苗示意圖，其中圖a為突起態(tài)，圖b為半閉合態(tài)，圖c為閉合態(tài)。
[0037]圖3為本發(fā)明所述三種形態(tài)莖尖成苗培養(yǎng)的再生植株示意圖，其中，圖a為突起態(tài)，圖b為半閉合態(tài)，圖c為閉合態(tài)。
[0038]圖4為本發(fā)明薯塊萌發(fā)苗與莖尖培養(yǎng)株系攜帶SPFMV與SPVG病毒的NCM-ELISA檢測結(jié)果，其中，圖a、b分別為薯塊萌發(fā)苗攜帶的病毒的情況，圖c、d分別為莖尖培養(yǎng)后株系攜帶的病毒的情況。
[0039]圖5為本發(fā)明株系建立及其脫毒苗快繁示意圖，其中，圖a為莖段培養(yǎng)，圖b為液態(tài)培養(yǎng)基快繁，圖c為固態(tài)培養(yǎng)基快繁。

【具體實施方式】
[0040]下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0041]實施例1
[0042]本實施例使用的甘薯品種為綿薯早秋，來源于西南大學(xué)薯類作物研宄所。
[0043]一種甘薯病毒苗的莖尖脫毒方法，具體步驟如下:
[0044](I)材料培養(yǎng):選取收獲已攜帶甘薯羽狀斑駁病毒的薯塊，洗凈表面后用32mg/kgGA3浸種28min，用消毒濕砂覆埋于26°C黑暗催芽，當(dāng)芽露出砂面后用39°C熱處理7d ；
[0045](2)材料消毒:剪取生長旺盛的長1.8cm頂芽，在超凈工作臺上切去完全展開的葉片，然后消毒；消毒時將材料先用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇浸泡28s，無菌水沖洗一遍，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 %的HgCl2浸泡9min，無菌水沖洗4遍；
[0046](3)接種培養(yǎng):在解剖鏡下無菌剝離0.30mm大小的生長點帶2個葉原基，接種在預(yù)先制備好的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基組成為:MS基本培養(yǎng)基+1.0mg/L BAP+0.01mg/LNAA+0.lmg/L 6八3;或 MS 基本培養(yǎng)基+0.5mg/L BAP+0.lmg/L IAA+0.lmg/L GA 3。培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度27°C，光照強度1550Lx，光照時數(shù)13h ；
[0047](4)株系建立與病毒檢測:對來自不同品種/品系的莖尖初代培養(yǎng)建立的試管苗嚴(yán)格按株系序號進行繼代培養(yǎng)建立株系，病毒檢測先采用指示植物法用株系涂抹或摩擦巴西牽牛植株葉片生長數(shù)日后觀察引起的癥狀來鑒定，不出現(xiàn)癥狀得到無病毒的株系，再用血清學(xué)方法NCM-ELISA檢測，其檢測程序:樣品米集一在膜上點樣一加入封阻液一沖洗一添加特異病毒抗體一沖洗一加入酶標(biāo)抗體一沖洗一顯色一終止反應(yīng)，得到無紫色反應(yīng)(陰性)的脫毒株系；
[0048](5)快速繁殖:快速繁殖培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基+0.lmg/L IM+0.lmg/L GA3;在29°C、15h/d條件下對步驟(4)所得脫毒株系進行快速繁殖，即得脫毒苗。
[0049]本實施例所得脫毒綿薯早秋成苗率(成苗數(shù)/接種總生長點數(shù))為94.4%。
[0050]實施例2
[0051]本實施例使用的甘薯品種為南薯88，來源于西南大學(xué)薯類作物研宄所。
[0052]一種甘薯病毒苗的莖尖脫毒方法，具體步驟如下:
[0053](I)材料培養(yǎng):選取收獲已攜帶甘薯G病毒的薯塊，洗凈表面后用30mg/kg Gk嚴(yán)種25min，用消毒濕砂覆埋于25°C黑暗催芽，當(dāng)芽露出砂面后用38°C熱處理7d ；
[0054](2)材料消毒:剪取生長旺盛的長1.5頂芽，在超凈工作臺上切去完全展開的葉片，然后消毒；消毒時將材料先用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇浸泡25s，無菌水沖洗一遍，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 %的HgCl2浸泡8min，無菌水沖洗3遍；
[0055](3)接種培養(yǎng):在解剖鏡下無菌剝離0.22mm大小的生長點帶2個葉原基，接種在預(yù)先制備好的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基組成為:MS基本培養(yǎng)基+0.8mg/L BAP+0.0 lmg/LNAA+0.lmg/L 6八3;或 MS 基本培養(yǎng)基+0.2mg/L BAP+0.lmg/L IAA+0.lmg/L GA 3。培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度26°C，光照強度1500Lx，光照時數(shù)12h ；
[0056](4)株系建立與病毒檢測:對來自不同品種/品系的莖尖初代培養(yǎng)建立的試管苗嚴(yán)格按株系序號進行繼代培養(yǎng)建立株系，病毒檢測先采用指示植物法用株系涂抹或摩擦巴西牽牛植株葉片生長數(shù)日后觀察引起的癥狀來鑒定，不出現(xiàn)癥狀得到無病毒的株系，再用血清學(xué)方法NCM-ELISA檢測，其檢測程序:樣品米集一在膜上點樣一加入封阻液一沖洗一添加特異病毒抗體一沖洗一加入酶標(biāo)抗體一沖洗一顯色一終止反應(yīng)，得到無紫色反應(yīng)(陰性)的脫毒株系；(5)快速繁殖:快速繁殖培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基+0.lmg/LIAA+0.lmg/L 6‘在28°C、ia/d條件下對步驟⑷所得脫毒株系進行快速繁殖，即得脫毒苗。
[0057]本實施例所得脫毒南薯88成苗率為82.2%。
[0058]實施例3
[0059]本實施例使用的甘薯品種為川薯101，來源于西南大學(xué)薯類作物研宄所。
[0060]一種甘薯病毒苗的莖尖脫毒方法，具體步驟如下:
[0061](I)材料培養(yǎng):選取收獲已攜帶薯羽狀斑駁病毒和甘薯G病毒的薯塊，洗凈表面后用35mg/kg GA3浸種30min，用消毒濕砂覆埋于27°C黑暗催芽，當(dāng)芽露出砂面后用40°C熱處理8d ；
[0062](2)材料消毒:剪取生長旺盛的長2.0cm頂芽，在超凈工作臺上切去完全展開的葉片，然后消毒；消毒時將材料先用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇浸泡30s，無菌水沖洗一遍，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的HgCl2浸泡lOmin，無菌水沖洗5遍；
[0063](3)接種培養(yǎng):在解剖鏡下無菌剝離0.35mm大小的生長點帶2個葉原基，接種在預(yù)先制備好的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基組成為:MS基本培養(yǎng)基+0.8?1.4mg/L BAP+0.02mg/LNAA+0.211^/11^3;或1^ 基本培養(yǎng)基 +0.2 ?(λ 8mg/L BAP+0.2mg/L IAA+0.2mg/L GA 3。培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度28°C，光照強度1600Lx，光照時數(shù)14h ；
[0064](4)株系建立與病毒檢測:對來自不同品種/品系的莖尖初代培養(yǎng)建立的試管苗嚴(yán)格按株系序號進行繼代培養(yǎng)建立株系，病毒檢測先采用指示植物法用株系涂抹或摩擦巴西牽牛植株葉片生長數(shù)日后觀察引起的癥狀來鑒定，不出現(xiàn)癥狀得到無病毒的株系，再用血清學(xué)方法NCM-ELISA檢測，其檢測程序:樣品米集一在膜上點樣一加入封阻液一沖洗一添加特異病毒抗體一沖洗一加入酶標(biāo)抗體一沖洗一顯色一終止反應(yīng)，得到無紫色反應(yīng)(陰性)的脫毒株系；
[0065](5)快速繁殖:快速繁殖培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基+0.2mg/L IAA+0.5mg/L GA3;在30°C、16h/d條件下對步驟(4)所得脫毒株系進行快速繁殖，即得脫毒苗。
[0066]本實施例所得脫毒川薯101成苗率為72%。
[0067]下文通過實驗對本發(fā)明所述技術(shù)方案取得的效果進行說明。
[0068]1、本發(fā)明所述方法所得莖尖2葉原基形態(tài)(如圖1所示)由第I葉原基和第2葉原基及生長錐組成一個完整的生長點，實質(zhì)是一個植株的雛形，其成苗率因莖尖2葉原基形態(tài)差異而在培養(yǎng)時分化生長的表現(xiàn)也不同，(如圖2、圖3所示)初代培養(yǎng)初期突起態(tài)表現(xiàn)弱小，不及半閉合態(tài)或閉合態(tài)粗壯，閉合態(tài)和半閉合態(tài)有較高的成苗率，突起態(tài)成苗率較低，分別是 92.9%,88.9%和 46.rI %。
[0069]2、莖尖的不同葉原基形態(tài)在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，外植體形成“愈傷組織”與“芽”具有促進和抑制兩個方面的作用，一般在誘導(dǎo)培養(yǎng)初期莖尖基部愈傷化程度適合時對芽生長是有利的。觀察發(fā)現(xiàn)，莖尖接種到培養(yǎng)基后的I?3周，由肉眼隱約可見0.22?0.35_大小到形成清晰可見0.6?3.0mm以上大小的一團綠色與淺綠色的初代培養(yǎng)物，其綠色部分為莖尖的生長錐和2個葉原基逐漸生長發(fā)育為包裹緊密的微型小芽，淺綠色部分為包圍在小芽周圍的愈傷組織，由培養(yǎng)初期培養(yǎng)基中附加的激素成分誘導(dǎo)形成，外植體與培養(yǎng)基接觸面適度的愈傷化對微小的莖尖器官組織培養(yǎng)的成活是有利的。經(jīng)過培養(yǎng)至第4?5周，莖尖的生長與其愈傷組織的形成是同步性進行的，可見起源于原來帶2個葉原基的莖尖經(jīng)培養(yǎng)后長出了 3個小芽，實際上為I個頂芽和2個腋芽的外觀形態(tài)表現(xiàn)，即已經(jīng)形成具莖節(jié)、葉片和頂芽的地上部分植株雛形。第6周后，轉(zhuǎn)入新配制的無附加激素成分的相同培養(yǎng)基中，雛形植株再經(jīng)過繼代培養(yǎng)后便完成甘薯植株再生過程。
[0070]3、本發(fā)明所述方法提供MS基本培養(yǎng)基附加不同的激素體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)(如圖2所示)都能誘導(dǎo)甘薯莖尖分生組織萌發(fā)產(chǎn)生再生植株，但不同培養(yǎng)基對同一品種/品系的莖尖成苗率的影響很大。激素種類中，BAP是影響甘薯成苗率的重要因子，與0.01mg/L NAA組合時以0.8?1.4mg/L為好；與0.lmg/L IAA組合時以0.2?0.8mg/L為好。若BAP為2.0mg/L的培養(yǎng)基上，幾乎所有品種/品系都有不同程度的、顏色較淡的大塊愈傷組織出現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移后成苗率較其它愈傷組織分化成苗率低；IAA是影響甘薯成苗率的次要因子，但對莖尖生長無明顯差異，其濃度在0.1?0.2mg/L為宜；加有GA3的培養(yǎng)基所誘導(dǎo)成功的植株比無GA3的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的植株長勢強，其濃度在0.1?0.5mg/L。不同品種/品系的成苗培養(yǎng)最適培養(yǎng)基基本一致，為 MS+0.8 ?L 4mg/L BAP+0.0 lmg/L NAA+0.lmg/L GA3；MS+0.2 ?0.8mg/L BAP+0.lmg/LIAA+0.lmg/L GA3。
[0071]4、本發(fā)明所述方法提供的莖尖2葉原基處于突起，半閉合和閉合3種不同形態(tài)時未在突起態(tài)的株系中檢測出病毒，而在半閉合態(tài)及閉合態(tài)的株系中檢測出單一 SPFMV，及(如圖4c、4d所示)SPVG與SPFMV進行復(fù)合浸染的兩種病毒，單一病毒和復(fù)合病毒的陽性率，三形態(tài)莖尖建立株系的脫毒率分別為100 %，83.9 %和71.9 %，平均脫毒率為85.3%。所得結(jié)果分析認(rèn)為，甘薯莖尖2葉原基相同大小的分生組織中，在其半閉合態(tài)和閉合態(tài)時已經(jīng)受到病毒的浸染，但其葉原基處于突起態(tài)時并未檢測出病原，可能原因是莖尖分生組織旺盛的分生能力或生理特異性阻擋了病毒的傳遞，也可能是來源于薯塊萌發(fā)植株生理發(fā)育進程的差異性存在少量病毒滯留于半閉合態(tài)和閉合態(tài)的葉原基中。由此說明，可以利用無毒操作技術(shù)無菌剝離2葉原基突起態(tài)的莖尖進行培養(yǎng)，能獲得100%的脫毒植株。
[0072]5、本發(fā)明所述方法提供的培養(yǎng)基對甘薯脫毒苗的單莖節(jié)有特殊效果。以MS為基本培養(yǎng)基，BAP配比NAA、IAA、GA^合中，NAA具有促進植株生長的良好作用，但其體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)小于0.05mg/L ;IAA也具有促進葉片數(shù)增加的效果，其體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.lmg/L較適合，同時加入0.lmg/L GAJi長勢也有一定效果。(如圖5a所示)培養(yǎng)基附加BAP體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)小于0.2mg/L，否則莖段也極易愈傷組織化，腋芽難以生長并轉(zhuǎn)向愈傷組織形成，說明脫毒苗莖段對BAP較敏感，BAP不能促進腋芽的生長。
[0073]6、不同培養(yǎng)方式對脫毒苗生長有影響，(如圖5b、5c所示)固體和液體培養(yǎng)基對甘薯脫毒苗的單莖節(jié)離體快繁，生長溫度在28°C以上，光照時數(shù)12?16h/d，25d后其株高、葉片數(shù)、鮮重和節(jié)間長液體培養(yǎng)都顯著優(yōu)于固體培養(yǎng)。
[0074]最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種甘薯病毒苗莖尖脫毒的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)材料培養(yǎng):取已感染薯羽狀斑駁病毒和/或甘薯G病毒的薯塊，室內(nèi)培養(yǎng)至萌芽； (2)材料消毒:剪取生長至1.5?2.0cm長的頂芽進行消毒； (3)接種培養(yǎng):從步驟(2)所得頂芽中無菌剝離帶2個葉原基的莖尖作為外植體進行接種培養(yǎng)，獲得再生植株； (4)株系建立與病毒檢測:對步驟(3)所得再生植株經(jīng)2?3次繼代培養(yǎng)建立株系，依次采用指示植物法和硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附法進行檢測，獲得脫毒株系； (5)快速繁殖:對脫毒株系進行快速繁殖，即得脫毒苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述消毒具體為:先用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡25?30s，無菌水沖洗一遍，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的HgCl2浸泡8?lOmin，無菌水沖洗3?5遍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述莖尖大小為0.22?0.35mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述莖尖形態(tài)為突起態(tài)、半閉合態(tài)或閉合態(tài)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述接種培養(yǎng)的培養(yǎng)基由以下成分組成:基本培養(yǎng)基MS，0.8?1.4mg/L BAP，0.01?0.02mg/L NAA ;或基本培養(yǎng)基MS，0.2 ?0.8mg/L BAP, 0.1 ?0.2mg/L ΙΑΑ。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述接種培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為:溫度25?30°C，光照強度1600Lx，光照時數(shù)12?14h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述檢測具體為:以試管苗株系對巴西牽牛用涂抹法和嫁接法觀察病毒引起的癥狀，以巴西牽牛為指示植物進行檢測后確認(rèn)無毒的試管苗株系再用NCM-ELISA法進行檢測。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)所述快速繁殖的培養(yǎng)基由以下成分組成:MS 基本培養(yǎng)基，0.1 ?0.2mg/L IAA, 0.1 ?0.5mg/L GA30
9.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的方法，其特征在于，步驟(5)所述快速繁殖的條件為:溫度28?30°C，光照時數(shù)12?16h。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)材料培養(yǎng):選取已感染薯羽狀斑駁病毒和/或甘薯G病毒的薯塊，洗凈表面后用30?35mg/kg GA3浸種25?30min，用消毒濕砂覆埋于25?27°C黑暗催芽，當(dāng)芽露出砂面后用38?40°C熱處理7?8d ; (2)材料消毒:剪取生長旺盛的長1.5?2.0cm頂芽，在超凈工作臺上切去完全展開的葉片，然后消毒；消毒時將材料先用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡25?30s，無菌水沖洗一遍，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 %的HgCl2浸泡8?lOmin，無菌水沖洗3?5遍； (3)接種培養(yǎng):在解剖鏡下無菌剝離0.22?0.35mm大小的生長點帶2個葉原基，接種在預(yù)先制備好的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基組成為:MS基本培養(yǎng)基+0.8?1.4mg/L BAP+0.01?.0.02mg/L ΝΑΑ+0.1 ?0.2mg/L GA3;或 MS 基本培養(yǎng)基 +0.2 ?0.8mg/L ΒΑΡ+0.1 ?0.2mg/L IAA+0.1?0.2mg/L GA3;培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度26?28°C，光照強度1500?1600Lx，光照時數(shù)12?14h ; (4)株系建立與病毒檢測:對來自不同品種/品系的莖尖初代培養(yǎng)建立的試管苗嚴(yán)格按株系序號進行繼代培養(yǎng)建立株系，病毒檢測先采用指示植物法用株系涂抹或摩擦巴西牽牛植株葉片生長數(shù)日后觀察引起的癥狀來鑒定，不出現(xiàn)癥狀得到無病毒的株系，再用NCM-ELISA法檢測，其檢測程序為:樣品米集一在膜上點樣一加入封阻液一沖洗一添加特異病毒抗體一沖洗一加入酶標(biāo)抗體一沖洗一顯色一終止反應(yīng)，得到無紫色反應(yīng)的脫毒株系;(5)快速繁殖:快速繁殖培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基+0.1?0.2mg/L ΙΑΑ+0.1?.0.5mg/L 6^;在28?30°C、12?16h/d條件下對步驟(4)所得脫毒株系進行快速繁殖，即得脫毒苗。
【文檔編號】A01H4/00GK104429953SQ201410671976
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】黃遠新, 王季春, 張凱, 唐道彬, 何鳳發(fā), 呂長文, 趙勇, 劉勛 申請人:西南大學(xué)